A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Abstract

المصدر: Jia ، Z. et al. ، A 5-mC Dot Blot Asse Copy مستوى مثيلة الحمض النووي لفك تمايز الخلايا الغضروفية في المختبر.J. Vis. Exp.(2017)

يصف هذا الفيديو تقنية اللطخة النقطية لتحديد مستوى مثيلة الحمض النووي في الخلايا الغضروفية البشرية في المختبر عن طريق نشاف عينات الحمض النووي على غشاء النايلون والتصور اللاحق باستخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة. هذا يساعد على تحديد النمط الظاهري للخلايا الغضروفية في مراحل مختلفة من الثقافة.

Protocol

1. جمع أنسجة الغضروف المفصلي البشري وثقافة الخلايا الغضروفية

1. تحضير المواد
   1. قم بإعداد وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco المكمل بمصل بقري الجنين بنسبة 10٪ و 1٪ بنسلين ستربتومايسين. تحضير 1 مجم / مل كولاجيناز II ، 0.25٪ تريبسين EDTA ، محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، ومصفاة خلوية (40 ميكرومتر من النايلون).
2. جمع أنسجة الغضروف المفصلي البشري
   1. عزل الغضروف المفصلي من مفاصل الركبة للمرضى المتبرعين بعد الصدمة. الحصول على موافقة مستنيرة من جميع المشاركين.
   2. قم بتقطيع الغضروف إلى مكعبات 1-2 مم³ قطع باستخدام مشرط معقم وهضم الخلايا الغضروفية من الغضروف المفروم مع 1 مجم / مل كولاجيناز II في DMEM عند 37 درجة مئوية لمدة 12-16 ساعة.
   3. قم بتصفية تعليق الخلية الناتج من خلال مصفاة خلية (40 ميكرومتر) واغسلها مرتين باستخدام PBS.
   4. عد الخلايا بمقياس الدم والبذور بكثافة 20,000-30,000 خلية/سم² في DMEM مكمل بمصل بقري جنيني 10٪ وبنسلين ستربتومايسين.
   5. الاستزراع في حاضنة عند 37 درجة مئوية.
3. توسيع الخلايا الغضروفية أحادية الطبقة
   1. حصاد الخلايا الفرعية المتجمعة باستخدام 0.25٪ trypsin-EDTA وإعادة اللوحة بكثافة 6,600 خلية / سم². قم بتغيير الوسيط مرتين في الأسبوع.
   2. استزراع الخلايا الغضروفية في طبقات أحادية لما يصل إلى ستة مقاطع وتقييمها في المقاطع 1 و 2 و 3 و 4 و 5.

2. استخراج الحمض النووي الجيني (gDNA)

1. اجمع الخلايا وأعد تعليقها في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل (15 ملي مولار Tris pH 8.0 ، 10 ملي مولار EDTA الرقم الهيدروجيني 8.0 ، 0.5٪ SDS ، 200 ميكروغرام / مل RNase A) لكل 10 ملايين خلية. قم بتعليق الخلايا عن طريق سحب العينة والانعكاس السريع ، ثم احتضانها لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية.
2. أضف البروتيناز K بتركيز 160 ميكروغرام / مل من محللة الخلية واقلب الخليط بقوة. احتضان 6 ساعات عند 55 درجة مئوية.
3. أضف حجما واحدا من Tris pH 7.9 الفينول المشبع: الكلوروفورم: كحول الأيزواميل (25: 24: 1) إلى العينة. دوامة أو رج العينة يدويا جيدا لمدة 20 ثانية تقريبا.
4. الطرد المركزي العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق عند 13,000 × جم. قم بإزالة المرحلة المائية العلوية وانقل الطبقة إلى أنبوب جديد.
5. استخرج بحجم متساو من الكلوروفورم لإزالة الفينول ونقل المرحلة المائية العلوية إلى أنبوب جديد.
6. قم بترسيب الحمض النووي عن طريق إضافة 0.1 حجم عينة من 3 M من أسيتات الصوديوم ، ودرجة الحموضة 8.0 و 2 ، ومجلدات 100٪ من الإيثانول.
7. قم بتخزين الأنبوب عند -20 درجة مئوية طوال الليل لترسيب gDNA.
8. الطرد المركزي العينة عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق عند 16,000 × جم إلى الحبيبات gDNA.
9. اغسل العينة ثلاث مرات باستخدام 70٪ إيثانول ، وجهاز طرد مركزي عند 4 درجات مئوية لمدة دقيقتين عند 13,000 × جم.
10. قم بإزالة المادة الطافية بعناية ثم جففها في الهواء. أعد تعليق الحمض النووي في 10 ملي مولار Tris pH 8.0 ، 0.1 ملي EDTA.

فئة

3. توصيف مثيلة الحمض النووي

1. استخدم مجموعة مثيلة الحمض النووي لإجراء تفاعل تحويل ثنائي الكبريتيت باستخدام ما مجموعه 500 نانوغرام من الحمض النووي الجيني ، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. قم بإزالة 10 ميكرولتر من محلول الشطف (50 نانوغرام / ميكرولتر).
2. قم بإجراء توصيف مثيلة الحمض النووي باستخدام مجموعة تجارية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.

4. تحليل لطخة النقطة

1. قم بتبييس الحمض النووي المعزول (1 مجم لكل عينة) في 0.1 M هيدروكسيد الصوديوم لمدة 10 دقائق عند 95 درجة مئوية. قم بتحييد الحمض النووي باستخدام 1 M NH₄OAc على الجليد ، ثم قم بتخفيفه مرتين. بقعة 2 ميكرولتر من الحمض النووي الجيني المخفف التسلسلي على غشاء N ⁺.
2. امسح الغشاء عند 80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
3. قم بسد مواقع ربط الأجسام المضادة غير المحددة عن طريق نقع غشاء N ⁺ في 5٪ BSA في TBS-T لمدة 1 ساعة. استخدم طبق بتري مقاس 10 سم كغرفة تفاعل في درجة حرارة الغرفة.
4. بعد الغسيل لمدة 5 دقائق ثلاث مرات في TBST ، احتضن الغشاء بجسم مضاد أحادي النسيلة مضاد للفأر مضاد ل 5-ميثيل سيتوزين (5-mC) (1: 1,000) في TBS-T عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
5. اغسل الغشاء لمدة 5 دقائق ثلاث مرات في TBS-T ، ثم احتضنه بجسم مضاد ثانوي ، الغلوبولين المناعي للأغنام المترافق HRP المضاد للفأر G (IgG) (1: 5,000) في TBS-T لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
6. اغسل الغشاء لمدة 5 دقائق ثلاث مرات في TBS-T.
7. أضف ركيزة الإنزيم إلى الغشاء واحتضن لمدة 5-10 دقائق. تصور إشارة الجسم المضاد الثانوي باستخدام مجموعة تلألؤ كيميائي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

Materials

<strong>Reagents</strong>
DMEM&nbsp;&nbsp;	Gibco Inc.	11965&ndash;092	Warm in 37 &deg;C water bath before use
Phosphate-Buffered Saline(PBS)	HyClone Inc.	SH30256.01B	D-PBS, free of&nbsp;Ca2+/Mg2+
FBS	Gibco Inc.	10099-141
0.25%Trypsin/EDTA	Gibco Inc.	25200-056
1%Penicillin-Streptomycin	Gibco Inc.	15140-122
Chloroform	Mallinckrodt	4440
Isoamyl Alcohol	Sigma	I-3643
Phenol	Gibco BRL	15513-039
Proteinase K	Gibco BRL	24568-2
TAE buffer&nbsp;	Bio Whittaker	16-011V
Distilled Water	Gibco BRL	15230-170
1 M Tris-HCl	Biosharp Inc.	BL514A
Tween20	Biotopped Inc.	C58H114O26
BSA	Proliant Inc.	68700
Collagenase, Type II	Sigma-Aldrich	C6885
<strong>Equipment</strong>
Cell Strainer (40&mu;m nylon)	FALCON Inc.	352340
Hemocytometer	ISOLAB Inc.	075.03.001
Falcon 100 mm&nbsp; dish	Corning	353003
Centrifuge Tubes	TPP AG	91050	Gamma-sterilized
High-speed centrifuge	Eppendorf	5804R
ThermoMixer	MIULAB	MTH-100
Carbon dioxide cell incubator	Thermo scientific	3111
Chemi-imaging Analyse System	UVITEC Cambridge	ALLIANCE