A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Abstract

المصدر: Tirumalai، V.، et al. تحليل بقع الحمض النووي الريبي للكشف عن الحمض النووي الريبي الميكرو للنبات وتقديره الكمي. J. Vis. Exp. (2020)

في هذا الفيديو ، نوضح اللطخة الشمالية ، وهي تقنية تهجين لاكتشاف وتحديد microRNAs (miRNAs) من إجمالي الحمض النووي الريبي المستخرج من الأنسجة النباتية.

Protocol

1. الرحلان الكهربائي للهلام

1. أوقف التشغيل المسبق واغسل الآبار قبل تحميل العينة.
2. سخني العينات عند 98 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة وقم بتحميل العينات ساخنة في البئر باستخدام أطراف شعرية. أدخل الطرف في قاع البئر بحيث تشغل العينة طبقة رقيقة واحدة في البئر.
3. تحميل كامل لجميع العينات. قم بتضمين تحميل علامة عقد الحمض النووي الريبي.
4. قم بتشغيل الجل على 80 فولت حتى تعمل الصبغة الزرقاء البروموفينول بالكامل تقريبا. يعمل البروموفينول الأزرق عند 10 نقاط أساس في هلام أكريلاميد متغير الطبيعة بنسبة 15٪.

2. التحضير للنشاف الكهربائي

1. قم بقص غشاء N + النايلون إلى أبعاد لوح زجاجي وقم بتسمية الغشاء في الزاوية العلوية اليمنى بقلم رصاص HB.
2. ضع الغشاء برفق على سطح الماء المعقم ، في مواجهة الجانب المسمى باتجاه سطح الماء. نقع الغشاء مسبقا لمدة 15 دقيقة.
3. قطع 4 قطع من ورق النشاف I إلى أبعاد وسادة الألياف.
4. تحضير شطيرة الجل عن طريق وضع الجانب الرمادي من الكاسيت في صينية نظيفة.
5. بلل وسادة الألياف مسبقا وضعها فوق الكاسيت. قم بإزالة فقاعات الهواء.
6. قم ببللة قطعة واحدة من ورق النشاف مسبقا في 1x TBE وضعها فوق وسادة الألياف. قم بإزالة فقاعات الهواء عن طريق لف ماصة بلاستيكية فوق الورق. ضع قطعة أخرى من ورق النشاف المبلل مسبقا وقم بإزالة فقاعات الهواء.
7. قم بإزالة الجل بعناية من الكاسيت قيد التشغيل وضعه فوق إعداد الساندويتش ، بحيث تكون عينة الحمض النووي الريبي الأولى المحملة باتجاه اليمين.
8. اغمس الغشاء المنقوع مسبقا برفق في 1x TBE وضعه فوق الجل ، مواجها الجانب الملصق لأسفل. افردها لإزالة فقاعات الهواء.
9. اغمس قطعة من ورق النشاف ، وضعها فوق الغشاء ، وقم بإزالة فقاعات الهواء. اغمس قطعة أخرى من ورق النشاف ، وضعها فوق إعداد الساندويتش ، وقم بإزالة فقاعات الهواء.
10. أكمل الساندويتش عن طريق وضع وسادة ألياف مبللة مسبقا فوق الإعداد وإغلاق الكاسيت بإحكام.
11. ضع كاسيت transblot في الوحدة واملأ 1x TBE ، درجة الحموضة 8.2 ، حتى علامة النشاف.
12. نقل عند 10 فولت ، طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
13. بعد النقل ، ضع الغشاء الرطب على ورقة ورقية وقم على الفور بربط الحمض النووي الريبي بالغشاء عن طريق التشعيع بضوء الأشعة فوق البنفسجية 254 نانومتر (120،000 ميكروجول / سم²). يمكن تخزين اللطخة المتشابكة عند 4 درجات مئوية لمزيد من التهجين.

3. تحضير المسبار الملصقات الإشعاعية

1. صمم مسبارا مكملا تماما للحمض النووي الريبي الصغير الذي سيتم اكتشافه.
2. قم بتسمية المسبار باستخدام ƳP32ATP (تم الحصول عليه من BRIT) في نهايته 5 بوصات من خلال الجمع بين المكونات وفقا للوصفة الواردة في الجدول 1.
3. احتضان خليط التفاعل أعلاه عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
4. افصل ƳP32ATP غير المسمى عن المسبار باستخدام عمود Sephadex G-25 وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.

4. تهجين اللطخة

1. ضع اللطخة المتقاطعة ، جانب الحمض النووي الريبي المواجه للجزء العلوي ، داخل زجاجة تهجين.
2. امزج بقوة المخزن المؤقت للتهجين فائق الحساسية ، وأضف 10 مل منه ، واحتضن اللطخة داخل فرن تهجين يتم الحفاظ عليه عند 35 درجة مئوية ، مع الدوران.
3. قم بإجراء التهجين المسبق لمدة 20 دقيقة.
4. أخرجي الزجاجة من الفرن وأضيفي المسبار الملصق برفق إلى مخزن التهجين.
5. قم بتهجين اللطخة عند 35 درجة مئوية ، مع الدوران لمدة 12 ساعة.
6. بعد التهجين ، انقل محلول التهجين بعناية إلى أنبوب سعة 15 مل. يمكن تخزين هذا المحلول في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى إعادة استخدامه.
7. قم بإجراء غسيل سريع للبقعة لمدة دقيقتين لإزالة محلول التهجين الزائد عن طريق إضافة 2x SSC buffer بالإضافة إلى 0.5٪ SDS. تجاهل الحل.
8. احتضن اللطخة مع 2x SSC buffer بالإضافة إلى 0.5٪ SDS ل 35 درجة مئوية ، مع الدوران لمدة 30 دقيقة.
9. اغسل اللطخة مرة أخرى باستخدام المخزن المؤقت 0.5x SSC بالإضافة إلى 0.5٪ SDS لمدة 35 درجة مئوية ، مع الدوران لمدة 30 دقيقة.
10. ضع اللطخة داخل غطاء التهجين ، وقم بإزالة المخزن المؤقت الزائد ، وأغلقها.
11. قم بتعريضه لشاشة تصوير الفوسفور الخالية من الإشعاع طوال الليل داخل كاسيت.
12. اكتشف إشارة التهجين باستخدام جهاز تصوير جزيئي حيوي وقم بتحليل النتائج باستخدام برنامج مناسب.

الجدول 1: جدول الوصفات

المخزن المؤقت والحل وصفة التعليقات 10 × TBE 0.89M تريس عازلة يجب ضبط pH على 8.2 باستخدام حمض الخليك 0.89 م حمض البوريك 30 ملي متر EDTA مزيج جل 15٪ أكريلاميد بيساكريلاميد سول ، 19: 1 يجب ألا يحتوي مزيج الجل على بلورات اليوريا 8 مليون يوريا 1X TBE صبغة تحميل الجل 0.05٪ (وزن / حجم) أزرق بروموفينول يجب توخي الحذر أثناء التعامل مع الفورموميد منزوع الأيونات 0.05٪ (وزن / حجم) زيلين زيانول 100٪ منزوعة الأيونات – فورماميد تسمية المسبار المخزن المؤقت PNK (10X، 2 ميكرولتر) يحتوي هذا الخليط على جزيئات مشعة ، ويجب تنفيذ هذه الخطوة من قبل موظفين مدربين داخل مختبر مشع إنزيم PNK (1 ميكرولتر) أوليغو (100 ميكرومتر ، 0.1 ميكرولتر) ƳP32 ATP (4 ميكرولتر) Wash Buffer – I 2X SSC 0.5٪ (مع حجم حجم) SDS Wash Buffer – II 0.5X SSC 0.5٪ (مع حجم حجم) SDS تجريد المخزن المؤقت – أنا 0.5X SSC 0.1٪ (وزن حجم) SDS تجريد المخزن المؤقت – II 0.1X SSC 0.1٪ (وزن حجم) SDS

Materials

40% Acrylamide-bisacrylamide solution 	Sigma 	A9926	Chemical
Ammonium persulphate (APS)	BioRad	1610700	Chemical
Blotting paper	Whatman blotting paper I	1001-125	Assay
Bromophenol blue	Sigma	B5525-5G	Chemical
Capillary loading tips	BioRad	2239915	Plastic ware
Deionized formamide	Ambion	AM9342	Chemical
Heating block 	Eppendorf	5350	Device
Hybond N+nylon membrane	GE	RPN203B	Assay
Hybridization bottle	Sigma	Z374792-1EA	Plastic ware
Hybridization Oven	Thermo Scientific	1211V79	Device
N,N,N',N'- Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma	T7024-25ml	Chemical
PhosphorImager	GE- Typhoon scanner	29187194	Device
PhosphorImager screen and cassette	GE healthcare	GE28-9564-75	Device
Pipettes	Gilson, models: P20 and P10	FA10002M, FA10003M	Plastic ware
Plastic pipette	Falcon	357550	Plastic ware
Polyacrylamide gel apparatus	BioRad	1658003EDU	Device
Sephadex G-25 column	GE healthcare	27532501	Device
Speed Vac Concentrator	Thermo Scientific	20-548-130	Device
Spinwin	Tarsons	1010	Device
T4 Polynucleotide Kinase (PNK)	NEB	M0201S	Assay
Transblot apparatus	BioRad	1703946	Device
ULTRAHyb hybridization buffer	Ambion	AM8670	Assay
Urea	Fischer Scientific	15985	Chemical
UV-crosslinker	UVP	CL-1000L	Device
Vortex	Tarsons	3020	Device
Water bath	NEOLAB	D-8810	Device
Xylene cyanol	Sigma	X4126-10G	Assay