5-ميثيل سيتوزين نقطة لطخة لتحديد مدى مثيلة الحمض النووي

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Jia ، Z. et al. ، A 5-mC Dot Blot Asse Copy مستوى مثيلة الحمض النووي لفك تمايز الخلايا الغضروفية في المختبر.J. Vis. Exp.(2017)

يصف هذا الفيديو تقنية اللطخة النقطية لتحديد مستوى مثيلة الحمض النووي في الخلايا الغضروفية البشرية في المختبر عن طريق نشاف عينات الحمض النووي على غشاء النايلون والتصور اللاحق باستخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة. هذا يساعد على تحديد النمط الظاهري للخلايا الغضروفية في مراحل مختلفة من الثقافة.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. جمع أنسجة الغضروف المفصلي البشري وثقافة الخلايا الغضروفية

1. تحضير المواد
   1. قم بإعداد وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco المكمل بمصل بقري الجنين بنسبة 10٪ و 1٪ بنسلين ستربتومايسين. تحضير 1 مجم / مل كولاجيناز II ، 0.25٪ تريبسين EDTA ، محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، ومصفاة خلوية (40 ميكرومتر من النايلون).
2. جمع أنسجة الغضروف المفصلي البشري
   1. عزل الغضروف المفصلي من مفاصل الركبة للمرضى المتبرعين بعد الصدمة. الحصول على موافقة مستنيرة من جميع المشاركين.
   2. قم بتقطيع الغضروف إلى مكعبات 1-2 مم³ قطع باستخدام مشرط معقم وهضم الخلايا الغضروفية من الغضروف المفروم مع 1 مجم / مل كولاجيناز II في DMEM عند 37 درجة مئوية لمدة 12-16 ساعة.
   3. قم بتصفية تعليق الخلية الناتج من خلال مصفاة خلية (40 ميكرومتر) واغسلها مرتين باستخدام PBS.
   4. عد الخلايا بمقياس الدم والبذور بكثافة 20,000-30,000 خلية/سم² في DMEM مكمل بمصل بقري جنيني 10٪ وبنسلين ستربتومايسين.
   5. الاستزراع في حاضنة عند 37 درجة مئوية.
3. توسيع الخلايا الغضروفية أحادية الطبقة
   1. حصاد الخلايا الفرعية المتجمعة باستخدام 0.25٪ trypsin-EDTA وإعادة اللوحة بكثافة 6,600 خلية / سم². قم بتغيير الوسيط مرتين في الأسبوع.
   2. استزراع الخلايا الغضروفية في طبقات أحادية لما يصل إلى ستة مقاطع وتقييمها في المقاطع 1 و 2 و 3 و 4 و 5.

< p class = "jove_title" >2. استخراج الحمض النووي الجيني (gDNA)

1. اجمع الخلايا وأعد تعليقها في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل (15 ملي مولار Tris pH 8.0 ، 10 ملي مولار EDTA الرقم الهيدروجيني 8.0 ، 0.5٪ SDS ، 200 ميكروغرام / مل RNase A) لكل 10 ملايين خلية. قم بتعليق الخلايا عن طريق سحب العينة والانعكاس السريع ، ثم احتضانها لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية.
2. أضف البروتيناز K بتركيز 160 ميكروغرام / مل من محللة الخلية واقلب الخليط بقوة. احتضان 6 ساعات عند 55 درجة مئوية.
3. أضف حجما واحدا من Tris pH 7.9 الفينول المشبع: الكلوروفورم: كحول الأيزواميل (25: 24: 1) إلى العينة. دوامة أو رج العينة يدويا جيدا لمدة 20 ثانية تقريبا.
4. الطرد المركزي العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق عند 13,000 × جم. قم بإزالة المرحلة المائية العلوية وانقل الطبقة إلى أنبوب جديد.
5. استخرج بحجم متساو من الكلوروفورم لإزالة الفينول ونقل المرحلة المائية العلوية إلى أنبوب جديد.
6. قم بترسيب الحمض النووي عن طريق إضافة 0.1 حجم عينة من 3 M من أسيتات الصوديوم ، ودرجة الحموضة 8.0 و 2 ، ومجلدات 100٪ من الإيثانول.
7. قم بتخزين الأنبوب عند -20 درجة مئوية طوال الليل لترسيب gDNA.
8. الطرد المركزي العينة عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق عند 16,000 × جم إلى الحبيبات gDNA.
9. اغسل العينة ثلاث مرات باستخدام 70٪ إيثانول ، وجهاز طرد مركزي عند 4 درجات مئوية لمدة دقيقتين عند 13,000 × جم.
10. قم بإزالة المادة الطافية بعناية ثم جففها في الهواء. أعد تعليق الحمض النووي في 10 ملي مولار Tris pH 8.0 ، 0.1 ملي EDTA.

فئة

3. توصيف مثيلة الحمض النووي

1. استخدم مجموعة مثيلة الحمض النووي لإجراء تفاعل تحويل ثنائي الكبريتيت باستخدام ما مجموعه 500 نانوغرام من الحمض النووي الجيني ، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. قم بإزالة 10 ميكرولتر من محلول الشطف (50 نانوغرام / ميكرولتر).
2. قم بإجراء توصيف مثيلة الحمض النووي باستخدام مجموعة تجارية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.

4. تحليل لطخة النقطة

1. قم بتبييس الحمض النووي المعزول (1 مجم لكل عينة) في 0.1 M هيدروكسيد الصوديوم لمدة 10 دقائق عند 95 درجة مئوية. قم بتحييد الحمض النووي باستخدام 1 M NH₄OAc على الجليد ، ثم قم بتخفيفه مرتين. بقعة 2 ميكرولتر من الحمض النووي الجيني المخفف التسلسلي على غشاء N ⁺.
2. امسح الغشاء عند 80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
3. قم بسد مواقع ربط الأجسام المضادة غير المحددة عن طريق نقع غشاء N ⁺ في 5٪ BSA في TBS-T لمدة 1 ساعة. استخدم طبق بتري مقاس 10 سم كغرفة تفاعل في درجة حرارة الغرفة.
4. بعد الغسيل لمدة 5 دقائق ثلاث مرات في TBST ، احتضن الغشاء بجسم مضاد أحادي النسيلة مضاد للفأر مضاد ل 5-ميثيل سيتوزين (5-mC) (1: 1,000) في TBS-T عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
5. اغسل الغشاء لمدة 5 دقائق ثلاث مرات في TBS-T ، ثم احتضنه بجسم مضاد ثانوي ، الغلوبولين المناعي للأغنام المترافق HRP المضاد للفأر G (IgG) (1: 5,000) في TBS-T لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
6. اغسل الغشاء لمدة 5 دقائق ثلاث مرات في TBS-T.
7. أضف ركيزة الإنزيم إلى الغشاء واحتضن لمدة 5-10 دقائق. تصور إشارة الجسم المضاد الثانوي باستخدام مجموعة تلألؤ كيميائي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات الكواشف DMEM شركة جيبكو 11965–092 يسخن في حمام مائي 37 درجة مئوية قبل الاستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) شركة HyClone SH30256.01 مليار D-PBS ، خالي من Ca2 + / Mg2 + FBS شركة جيبكو 10099-141 0.25٪ تريبسين / EDTA شركة جيبكو هاتف: 25200-056 1٪ بنسلين - ستربتومايسين شركة جيبكو 15140-122 كلوروفورم مالينكرودت 4440 كحول الأيزواميل سيغما I-3643 الفينول جيبكو ريال هاتف: 15513-039 بروتيناز ك جيبكو ريال 24568-2 عازلة TAE بيو ويتاكر 16-011 فولت ماء مقطر جيبكو ريال 15230-170 1 م تريس حمض الهيدروكلوريك شركة Biosharp BL514A توين 20 شركة Biotop C58H114O26 جيش صرب البوسنه شركة Proliant 68700 كولاجيناز ، النوع الثاني سيجما ألدريتش [ك6885] معدات مصفاة الخلية (40 ميكرومتر نايلون) شركة فالكون هاتف: 352340 مقياس الدم شركة ISOLAB 075.03.001 صحن فالكون 100 مم كورنينج 353003 أنابيب الطرد المركزي TPP AG 91050 معقم جاما أجهزة طرد مركزي عالية السرعة إيبندورف 5804 ص خلاط حراري ميولب MTH-100 حاضنة خلايا ثاني أكسيد الكربون حراري علمي 3111 ريال نظام تحليل التصوير الكيميائي UVITEC كامبريدج تحالف