توليد نثرة العقدة الجذرية الظهرية وزراعة الخلايا المنفصلة

1. استنباط ثقافة DRG من الفأر البالغ

1. ضع DRG الذي تم جمعه في طبق بتري مقاس 35 مم يحتوي على 3 مل من الوسائط الخالية من المصل المثلج (SFM).
2. انقل كل DRG فردي في طبق بتري زجاجي جاف ، وتحت المجهر الجراحي ، قم بتنظيف وتقليم الألياف الزائدة والأنسجة الضامة التي لا تزال متصلة ب DRG باستخدام شفرة. يمكن التعرف على DRG بسهولة على أنه هيكل شفاف منتفخ على طول العصب / الجذر الشوكي الأبيض. غالبا ما توجد الأوعية الدموية المحيطة ب DRG.
3. ضع DRG النظيف في طبق بتري جديد يحتوي على وسائط SFM مثلجة.
4. خفف خليط البروتين الجيلاتيني (انظر جدول المواد) في SFM المثلج (1: 1).
5. ضع DRG ex vivo في لوح مكون من 12 بئرا مغلفة مسبقا ب 10/20 ميكرولتر من خليط البروتين الجيلاتيني وضعها داخل الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 30-60 دقيقة.
6. أضف برفق 1.5-2 مل من SFM إلى نظام الاستزراع لتغطية المصنع بالكامل والحفاظ على المزاعم في ظروف الاستزراع (37 درجة مئوية و 5٪ CO2).
   ملاحظه: هذه خطوة حاسمة لأن DRG يتم تثبيته على الأطباق الزجاجية فقط بواسطة خليط البروتين الجيلاتيني المبلمر. يعد وقت البلمرة ومهارات سحب العينات أمرا بالغ الأهمية لتجنب الطفو.
7. قم بتغيير وسيط زراعة DRG كل 72 ساعة واترك DRG ينمو طالما دعت الحاجة.

1. ضع كل DRG التي تم جمعها في أنبوب معقم سعة 1.5 مل مع 1.2 مل من وسائط F12 تحتوي على 1.25 مجم / مل من الكولاجيناز IV واحتضانها عند 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون لمدة 45 دقيقة. كرر هذه الخطوة لمدة 45 دقيقة أخرى بعد الحضانة الأولى.
2. عالج النباتات الخارجية ب 2 مل من وسائط F12 التي تحتوي على التربسين (0.025٪) لمدة 30 دقيقة مباشرة بعد معالجة الكولاجيناز IV عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
3. احتضان ب 2 مل من وسائط F12 المحتوية على مصل الأبقار الجنينية (FBS ؛ 33٪) عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 15 دقيقة.
4. اغسل النباتات الخارجية ثلاث مرات باستخدام 2 مل من وسائط F12 واستمر في فصلها ميكانيكيا بماصة زجاجية حتى تصبح الوسائط غائمة.
   ملاحظه: يتضمن هذا الإجراء جمع DRG النظيف / المشذب من ، كما هو موضح في القسم السابق. عند إجراء التفكك الميكانيكي للنباتات الخارجية ، كن لطيفا ولا تستخدم القوة المفرطة لأنها يمكن أن تؤدي إلى انسكاب وفقدان مواد العمل.
5. قم بتصفية مزرعة الخلايا المنفصلة من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر لإزالة أي شوائب وأنسجة ضامة زائدة. جهاز الطرد المركزي لمحللة الخلية المفلترة عند (2,500 × جم) لمدة دقيقتين.
6. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 500 ميكرولتر من الوسائط القاعدية العصبية التي تحتوي على مكمل لزراعة الخلايا العصبية (1x) ، وخليط المضادات الحيوية (1x) ، و L-glutamate (0.5 mM) ، وعامل نمو الأعصاب (5 ميكروغرام / مل) (انظر جدول المواد).
7. ضع الخلايا المنفصلة على شرائح غطاء مغلفة بطبقة من اللامينين (50 ميكروغرام / مل ؛ انظر جدول المواد) بكثافة الخلية المفضلة. حدد كثافة الخلية باستخدام عداد الخلية.
   ملاحظه: قمنا بطلاء الخلايا في 25,000 خلية / شريحة غطاء. تسمح هذه التقنية بتفكك كل من الخلايا العصبية وخلايا الأقمار الصناعية الدبقية. يلعب المكون الدبقي المزروع بشكل مشترك مع الخلايا العصبية القطبية الكاذبة دورا مهما في بقاء الخلايا العصبية.