دراسة تأثير المبيدات الحشرية على الخلايا العصبية Caenorhabditis elegans

1. تحضير ألواح بتري المغلفة بالمبيدات الحشرية

1. تحضير أطباق أجار بتري (قطرها 6 سم تعمل بشكل أفضل) باستخدام الإجراءات القياسية.
   ملاحظه: يمكن صنعها قبل أشهر وتخزينها في الثلاجة حتى الاستخدام. أحضر الأطباق إلى درجة حرارة الغرفة (RT) على سطح الطاولة. في معظم الحالات ، يجب تزويد مجموعات الطلاب بطبق لكل تخفيف لخليط المبيدات ، بما في ذلك التحكم في المياه.
2. قم بإعداد 1 مل من كل تخفيف من مبيد الآفات المختار في أنابيب ميكروفوج مسماة 1.5 مل. للتعامل الآمن ، تأكد من قراءة التعليمات وتوفير القفازات أو العمل في غطاء الدخان ، إذا اقترحت.
   ملاحظه: التخفيفات المقترحة للاختبار: 1 مل من مبيد الآفات كامل القوة ، 1:10 تخفيف في الماء (100 ميكرولتر من مبيد الآفات ، 900 ميكرولتر من الماء المقطر) ، 1: 100 تخفيف (10 ميكرولتر من مبيد الآفات ، 990 ميكرولتر من الماء) ، 1: 1000 تخفيف (10 ميكرولتر من التخفيف 1:10 ، 990 ميكرولتر من الماء) ، إلخ.
3. اصنع مفرشة محلول عن طريق ثني ماصة باستور زجاجية بعناية (مقاس 9 مل) في لهب موقد بنسن. استخدم اللهب لإغلاق فتحة الماصة. ثم قم بتعقيم الموزعة بالإيثانول قبل كل انتشار على لوحة بتري.
4. باستخدام ماصة دقيقة، ضع 100 ميكرولتر من التخفيف (أو التحكم في الماء) في وسط الأجار ووزعها برفق على السطح باستخدام الموزعة المعقمة. أعد تعقيم الموزعة قبل كل استخدام.
5. توضع أطباق بتري جانبا مغطاة ، وتترك المحلول ينقع في السطح حتى "يجف".
   ملاحظه: اعتمادا على مستويات المبيدات والرطوبة في المختبر ، قد يستغرق ذلك بعض الوقت. قد يحتاج الطلاب إلى تحضير أطباقهم في اليوم السابق لفترة التعرض.
6. لفترات التعرض التي تزيد عن 12 ساعة ، أضف 50 ميكرولتر من مزرعة الإشريكية القولونية بين عشية وضحاها إلى الألواح قبل إضافة الديدان الخيطية. بالنسبة للتجارب الحادة (12 ساعة أو أقل) ، ليست هناك حاجة لوجود الإشريكية القولونية على اللوحات.

ملاحظة: سيحتاج الطلاب إلى صفيحة من الديدان الخيطية البالغة (مزارع 5 أيام هي الأفضل) من سلالة الفلورسنت LX929 ، المتوفرة من مركز Caenorhabditis elegans لعلم الوراثة. هناك نوعان من الإجراءات الممكنة لذلك. إذا كان لدى الطلاب خبرة سابقة في العمل مع الديدان الخيطية (على سبيل المثال ، إذا كان هذا الإجراء جزءا من تمرين متعدد الأسابيع وتعلموا بالفعل كيفية اختيار الديدان الخيطية باستخدام دودة) ، فاستخدم الخطوة 2.1. إذا لم يفعلوا ذلك ، فاستخدم الخطوة 2.2.

1. اختر الديدان الخيطية باستخدام معول دودة. صمم دودة من قطعة 1 بوصة من الأسلاك البلاتينية التي يتم صهرها إلى ماصة باستور باستخدام لهب موقد بنسن. التقط نقطة صغيرة من الإشريكية القولونية اللزجة على المعول ثم التقط الديدان الخيطية البالغة باستخدام النقطة اللزجة. للحصول على حجم عينة لائق ، اختر 10 ديدان خيطية لكل لوحة معالجة.
   ملاحظه: يمكن للطلاب الذين ليس لديهم خبرة كبيرة اتباع الخطوات 2.2-2.3.
2. استخدم ماصة دقيقة لوضع 1 مل من الماء المعقم على صفيحة الديدان الخيطية. حرك الماء حوله لرفع الديدان الخيطية ، ثم قم بإزالة السائل مع الديدان الخيطية إلى أنبوب ميكرو فوج سعة 1.5 مل.
3. دع الديدان الخيطية تستقر بالجاذبية لمدة 10 دقائق تقريبا ، ثم قم بإزالة 500 ميكرولتر على الأقل من الماء بعناية وتخلص منها. أعد تعليق الديدان الخيطية ، وباستخدام طرف ماصة أصفر مقطوع ، قم بإزالة 50-100 ميكرولتر من الديدان العالقة إلى كل لوحة معالجة. تأكد من أن كل لوحة تحتوي على 10 ديدان بالغة على الأقل.
4. اضبط مؤقتا ، أو لاحظ الوقت ، وقم بعرض الديدان الخيطية عند RT للفترة الزمنية المختارة. خلال وقت التعرض المختار ، قم بإعداد شرائح المجهر للحوامل الرطبة. يجب عمل الشرائح في نفس يوم الفحص المجهري.
   ملاحظه: ستختار مجموعات الطلاب وقت تعرضهم أثناء التخطيط لدراستهم المستقلة.

ملاحظة: يمكن تنفيذ الخطوات 3.1-3.3 بواسطة كل مجموعة طلاب. قم بإعداد ثلاث شرائح لكل منها.

1. قم بإعداد شريحتين عن طريق وضع قطعة من شريط الملصق على جانب واحد فقط من الشريحة. يتم استخدام الشريط لإنشاء السماكة الصحيحة للأغروز لتشكيل وسادة ذات سمك موحد. ثم ضع شريحة نظيفة وغير مستخدمة بينهما على سطح الطاولة ، كما هو موضح في الشكل.
2. استخدم ماصة دقيقة لوضع قطرة 10 ميكرولتر من الاغاروز المذاب (3٪ في الماء المقطر المزدوج (ddH₂O) ، يتم تسخينها باستخدام سخان كتلة جافة 65 درجة مئوية) في وسط الشريحة الموجودة في المنتصف.
3. قم بتسطيح القطرة عن طريق وضع شريحة نظيفة أخرى في الأعلى ، عموديا على الشريحة مع القطرة ، كما هو موضح في الشكل. قم بالتسطيح بالضغط بحيث تشكل قطرة الاغاروز سمك شريط الوصق.
4. سوف يتجمد الاغاروز في غضون 1 دقيقة تقريبا. ثم اضغط بقوة ثابتة لفصل الشريحتين. سوف تلتصق دائرة أجار بإحدى الشرائح. ضع هذه الشريحة ، بحيث يكون جانب أجار لأعلى ، على سطح الطاولة ، واتركها تجف لمدة 1-2 دقيقة قبل الاستخدام.

1. لإضافة الديدان الخيطية إلى الشريحة المحضرة باستخدام وسادة الاغاروز ، أضف قطرة 5 ميكرولتر من الماء تحتوي على 1 M أزيد الصوديوم (NaN₃) إلى وسادة الأجار. يعمل هذا المحلول على تخدير الديدان وشل حركتها.
   أنذر: يمكن أن يسبب محلول مخزون أزيد الصوديوم المرض إذا تم تناوله.
2. ثم انقل الديدان الخيطية (10 على الأقل لكل شريحة علاج) إلى القطرة باستخدام عودة دودة. عقم المعول قبل وبعد استخدامه لنقل الديدان الخيطية.
3. استخدم الملقط لإضافة غطاء عن طريق وضعه بزاوية وخفضه ببطء. امنع الغطاء من الانزلاق أو الانخفاض بسرعة كبيرة باستخدام قلم رصاص أو مسبار معدني.
4. ضع الحامل الرطب المحضر على مجهر الفلورسنت لمراقبة الديدان ، أولا تحت تكبير 10x وتباين الطور ، ثم تحت تكبير 40x مع تباين الطور وإضاءة الفلورسنت.

5. الفحص المجهري الفلوري

ملاحظة: يجب على مجموعات الطلاب عمل تركيب مبلل لعدة ديدان من كل نوع على شرائح مجهر منفصلة ، والتي يجب عليهم تسميتها بشكل مناسب. الإرشادات التالية هي نصائح عامة حول استخدام مجهر مركب مضان قياسي يمكن أن يحتوي على إعداد ثلاثي العينيات مرفق وكاميرا رقمية ونظام كمبيوتر. يجب أن يكون الطلاب على دراية بإعدادات المجهر ، بما في ذلك الأهداف وأنواع مرشحات الضوء والقدرة على التبديل بين المجال الساطع والضوء الفلوري ، وكيفية إرسال إشارة الضوء إلى الكاميرا الرقمية ، وما إلى ذلك.

1. ضع حاملا مبللا معدا في كل مرة على مرحلة المجهر وثبته في مكانه باستخدام مشابك مرحلة المجهر.
2. ابدأ في عرض الحوامل الرطبة من خلال العرض الأول بأقل هدف تكبير ، والذي يكون عادة 10x ، واستخدم المجال الساطع أو تباين الطور لتصور الديدان الخيطية والتركيز عليها.
3. بمجرد وضع الديدان الخيطية في مجال الرؤية ، ركز عليها باستخدام مقبض التركيز الدقيق على المجهر. قم بتبديل الإضاءة إلى التألق عن طريق تدوير القرص. ثم قم بتوجيه الضوء إلى الكاميرا لالتقاط الصور الرقمية. اضبط الإضاءة باستخدام برنامج التصوير بحيث تكون الخلايا العصبية مضاءة بشكل ساطع ولكن ليست مفرطة التشبع.
4. في مرحلة ما ، احصل على صورة منفصلة لمسطرة بنفس التكبير مثل صور الخلية لتوفير مقياس تكبير لشكلها. ضع قسما قصيرا من المسطرة الشفافة ، أو شريحة ميكرومتر ، على مرحلة المجهر ، وركز عليها باستخدام مقبض التركيز الدقيق ، واحصل على صورة باستخدام برنامج التصوير.
5. احصل على صور إضافية (من 10 ديدان خيطية منفصلة على الأقل) بتكبيرات أعلى ، إن أمكن. من المحتمل أن يؤدي الضوء الشديد إلى تبييض المنطقة التي يتم تصويره منها ، لذا راقب التصوير بعناية ولا تسمح للضوء بالبقاء على نفس المنطقة من الشريحة لفترات طويلة من الزمن. تأكد من تسمية الصور المكتسبة لتتبع الديدان الخيطية والمنطقة ، بالإضافة إلى المعالجة والتكبير.
6. قم بإنشاء مجلد على الكمبيوتر وانقل الصور إلى المجلد لاستخدامها في التحليل وإعداد الشكل.

ملاحظة: السمة الخلوية الرئيسية للضرر التنكسي العصبي في الخلايا العصبية هي تغيير في مورفولوجيا سوما. هناك ثلاث أشكال يمكن عرضها وحسابها بسهولة.

1. عد الخلايا العصبية ذات العمليات الفلورية السلسة والموحدة وأجسام الخلايا غير المستديرة كالمعتاد ، كما هو موضح في الشكلين 1 و 2.
2. في كثير من الأحيان ، يصبح سوما مستديرا ومتورما مقارنة بالخلايا العصبية الشابة السليمة. احسب الخلايا العصبية التي تبدو هكذا على أنها "مقربة".
3. يمكن أن تظهر الخلايا العصبية ذات العمليات العصبية الطويلة نقاعا ، حيث توجد نقاط مستديرة أو حتى فجوات في العمليات. احسب الخلايا العصبية التي تظهر هذه الميزات على أنها "فقاعة".

الشكل 1: تقييم آثار مبيد الآفات المحتوي على النيونيكوتينويد على مورفولوجيا الخلايا العصبية. (أ) الخلايا العصبية الكولينية غير المعالجة من سلالة الفلورسنت LX929. (ب) الخلايا العصبية الكولينية المعرضة لمبيدات الآفات (T + S). (ج) النسبة المئوية للخلايا العصبية التي تظهر فقاعا في الحالتين. أشرطة الخطأ هي الخطأ القياسي للمتوسط. يشير إلى p < 0.001 من ANOVA أحادي الاتجاه. تم تحليل ما مجموعه 113 خلية عصبية من 12 ديدان خيطية فردية. تم تعديل هذا الرقم من برادفورد وآخرون (2020).

الشكل 2: آثار مبيد الآفات المحتوي على المنغنيز على مورفولوجيا الخلايا العصبية الدوبامين. لم تقدم مجموعة الطلاب شريط مقياس لشخصيتهم ولكنها التقطت الصورة بتكبير 40 ضعفا. (أ) سوما العصبية المفترضة CEPDL و CEPVL (المسمى) في الديدان المكافحة. تشير الخلايا العصبية السليمة للرأس وعملياتها إلى نقص التنكس. (ب) عمليات CEPD L&R المفترضة (علامة النجمة) و CEPV L&R العصبية سوما (المسمى) في الديدان المعرضة بشكل حاد. عبر سوما والعمليات عن GFP ، ولكن يبدو أن هناك تثبيتا في تعبير GFP في العمليات الظهرية. (ج) سوما عصبي مفترض CEPDL و CEPVL (مسمى) في الديدان المعرضة للأمراض المزمنة. لم يعبر سوما عن GFP ، ولم تكن العمليات مرئية ، مما يشير إلى تنكس كبير.