إحداث إصابات الدماغ الرضحية المخترقة في ذبابة الفاكهة البالغة

1. اختراق إصابات الدماغ الرضحية (PTBI; الشكل 1)

1. فرز ذباب F1 المغلق حديثا. اختر الذكور الصغار في غضون 6 ساعات بعد الإغلاق. ضع هؤلاء الذكور في قوارير نظيفة تحتوي على طعام ، مع 40 ذبابا أو أقل لكل قارورة.
   ملاحظة: يمكن تحقيق ذلك بسهولة في منتصف الصباح عن طريق تخدير الذباب على وسادة ثاني أكسيد الكربون ₂ وتحديد الذكور البالغين الذين لا يزالون لديهم العقي (يمكن رؤيته كبقعة خضراء داكنة من خلال جدار البطن) في أحشائهم.
2. قم بتعقيم دبابيس Minutien (انظر جدول المواد ) لمدة 5 دقائق على الأقل عن طريق وضع ~ 100 دبوس في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل مملوء بنسبة 70٪ من الإيثانول.
3. قم بتعقيم وسادة CO₂ وفرشاة الرسم عن طريق رش 70٪ من الإيثانول وامسحها حتى تجف بمنديل نظيف وخالي من النسالة. بمجرد أن تصبح الأدوات نظيفة وجافة ، انقل 40 أو أقل من ذكر F1 المصنفين مرة أخرى إلى الوسادة النظيفة.
4. افصل ذكور F1 إلى مجموعتين على وسادة الطيران. ستكون مجموعة واحدة بمثابة تحكم في الذباب غير المصاب. ستخضع المجموعة التجريبية الثانية ل PTBI.
5. باستخدام الملقط ، اسحب 4-5 دبابيس Minutien جديدة من أنبوب الطرد المركزي الدقيق وضعها بالقرب من حافة وسادة ثاني أكسيد الكربون ₂ }. تحت نطاق التشريح ، اختر دبوس Minutien مستقيم بنقطة حادة.
   ملاحظة: سيؤدي استخدام دبوس Minutien واحد للتجربة إلى تقليل التباين. أعد استخدام المسامير الحادة. ضع المسامير التالفة أو الحادة في أنبوب منفصل للطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل يحتوي على 70٪ إيثانول للتخلص الآمن.
6. إذا كنت تعمل مع الذباب من الصليب القياسي ، فقم بتشغيل مصباح الصمام الثنائي الباعث للضوء (LED) المجهر الاستريو المزود بمرشحات الإثارة والانبعاث المناسبة لبروتين التألق الأخضر (GFP). هذا يسمح بالإثارة عند 440-460 نانومتر ويسمح بتصور 500-560 نانومتر.
   ملاحظة: باستخدام مجموعة المصابيح والمرشحات هذه ، سوف تتألق أجسام خلايا جسم الفطر باللون الأخضر من خلال بشرة الرأس ( الشكل 1C ). بالنسبة للذباب التوأم الدائم أو الذباب من الأنماط الجينية الأخرى ، يمكن استخدام مصباح الضوء الأبيض القياسي للمجهر الاستريو لتصور المعالم على بشرة الرأس لاستهداف إصابة جسم الفطر ( الشكل 1C ).
7. استخدم الملقط لالتقاط وإمساك دبوس Minutien المحدد بيد واحدة (بالنسبة للأشخاص الذين يستخدمون اليد اليمنى ، عادة ما تكون هذه هي اليد اليمنى) وفرشاة الرسم في اليد الأخرى (عادة اليسرى). اختر ذبابة من المجموعة التجريبية ووضع الذبابة بحيث يكون لديك رؤية ظهرية لكبسولة الرأس مع رأس الذبابة إلى اليمين. ضع الفرشاة على الجزء الأمامي من الصدر الظهري وادفعها برفق لتثبيت الذبابة.
8. صوب طرف دبوس Minutien على أجسام خلايا جسم الفطر على الجانب الأيمن من الرأس واخترق كبسولة الرأس. في حالة استخدام المعالم ، استهدف بشرة الرأس الظهري بين العوج والحافة الظهرية للعين ( الشكل 1 ).
9. بعد الانتهاء من الإصابة ، استخدم فرشاة الرسم لدفع الرأس بعيدا عن دبوس Minutien برفق.
10. إذا كنت تستخدم الدماغ ل RNA-Seq أو qRT-PCR ، فقم بإصابة ثانية في الجانب الأيسر من الرأس.
11. كرر الخطوات 2.8-2.10 لإصابة جميع الذباب في المجموعة التجريبية.
12. بمجرد إصابة جميع الذباب ، ضع الذباب الضابط والمصابين في قوارير منفصلة مصنفة تحتوي على طعام. ضع القوارير أفقيا (أي على جانبيها) بينما يتعافى الذباب من التخدير وأثناء الشيخوخة اللاحقة لمنع الذباب من الوقوع في الطعام.
13. ضع الذباب المتقاطع القياسي عند 25 درجة مئوية ، والذباب المزدوج الثابت عند 30 درجة مئوية للعمر.
14. بالنسبة للذباب الذي يزيد عمره عن 24 ساعة ، ضعه على طعام نظيف كل 1-2 أيام.

الشكل 1: اختراق إصابات الدماغ الرضحية (PTBI) للدماغ المركزي ذبابة الفاكهة البالغ. (أ) تخطيطي للجزء الخارجي لرأس ذبابة بالغ. هذا هو المنظر الأمامي. وبالتالي ، فإن الجانب الأيمن من هو على يسار المشاهد. (ب) تخطيطي للجزء الداخلي من رأس ذبابة الفاكهة البالغ مع مسار الإصابة المبين باللون الرمادي. هذه وجهة نظر خلفية. وهكذا ، في هذه الصورة والأشكال اللاحقة ، يكون الجانب الأيمن من الدماغ على اليمين. يؤثر PTBI المركزي في الدماغ على هياكل دماغية متعددة ، بما في ذلك جسم الفطر (الأخضر) والأنسجة خارج الدماغ ، بما في ذلك الجسم الدهني (الأزرق) والخلايا الدموية (الحمراء). CB = منطقة الدماغ المركزية. OL= منطقة الفص البصري. (ج) منظر ظهري لرأس بالغ حي حيث يتم تمييز أجسام الفطر (رؤوس الأسهم) ببروتين فلوري أخضر (GFP). هذا هو "النمط الجيني القياسي" (انظر النص للحصول على التفاصيل). ينتج عن بروتوكول PTBI بشكل متكرر إصابة أجسام الفطر.