التحليل الوظيفي للتغذية اليرقات الدائرة في ذبابة الفاكهة

DOI: 10.3791/51062

November 19, 2013

Parag K. Bhatt¹, Wendi S. Neckameyer¹

¹Department of Pharmacological and Physiological Science,Saint Louis University School of Medicine

ذبابة الفاكهة هو نظام نموذجي قوية للغاية لدراسة تطوير الدوائر العصبية بسبب الوقت جيل السريع والتكلفة المنخفضة التجريبية، والقدرة على التعامل والتحكم في العوامل الوراثية والبيئية. يتم حفظها تكوين الخلايا العصبية، وتقصي مسار الخلايا العصبية وsynaptogenesis بين البشر وذبابة الفاكهة، وبالتالي يتم حفظها الآليات في إنشاء وصيانة وتعديل الدوائر العصبية أيضا.

يمكن الناقلات العصبية الكلاسيكية، مثل السيروتونين (5 هيدروكسي، أو 5-HT) بمثابة عوامل النمو قبل اعتماد أدوارهم كما يشير الجزيئات في الدائرة العصبية الناضجة ^1-3 وقد أظهرت دراسات سابقة أن المستويات منزعجة من 5-HT خلال مرحلة التطور الجنيني تغيير التواصل بين الخلايا العصبية الناضجة ^4. وقد أظهرت آخرون أن تطبيق خارج الرحم من 5-HT إلى الخلايا العصبية مثقف Helisoma قمع ثمرة neurite وكذلك synaptogenesis ^5-7. في Drosophila والتنموية مستويات 5-HT ترتبط عكسيا مع عدد دوالي والحجم، وكذلك درجة aborization، على طول neurites التي توقع على المعى الأمامي من الجهاز العصبي المركزي ^8.

وقد تبين العصبي السيروتونين لتعديل السلوكيات التغذية في الأنواع المختلفة، بما في ذلك ذبابة الفاكهة ^8-9. دائرة التغذية في ذبابة الفاكهة هو دائرة بسيطة نسبيا والتي يمكن استخدامها كنموذج لربط المخرجات الوظيفية (التغذية) مع بعض التعديلات في تطوير التوقعات محور عصبي من الدماغ إلى المعى الأمامي. Schoofs وآخرون. وقد أظهرت أن التغذية اليرقات ذبابة الفاكهة والتي تنظمها مولدات نمط المركزية التي تؤثر على الجهاز العضلي ^10. في حين أن التشريح العضلي محددة ليست مفهومة تماما، فقد تبين أن العصب antennal، العصب الفكي، والعصبية التبعي prothoracic هي المسؤولة عن أهداف العضلات المشاركة فيتغذية السلوك. معظم البيانات التي تنطوي على العضلات والأعصاب وعلم التشريح التغذية اللافقارية يقتصر على خوتع اليرقات.

يمكن تقييم معدل تغذية يرقات العمر الثاني من قبل التراجع من sclerites cephalopharyngeal (الفم السنانير)، واستنساخه وعالية الإنتاجية. ومعصب لوحات cephalopharyngeal بواسطة ألياف من الخلايا العصبية المركزية 5-HT عبر العصب الجبهي. على مقدم المعدة أو المعى الأمامي، ومعصب ألياف هرمون السيروتونين (الراجع العصبية) التي fasciculate في المعي المتوسط، ومسؤولة عن تقلصات في المعى الأمامي (الشكل 1) ^11-12. التغييرات في المتفرعة محور عصبي، وعدد وحجم دوالي على طول محوار، يمكن quantitated باستخدام تقنيات المناعى. يمكن التلاعب العصبية 5-HT خلال التنمية، سواء بشكل مباشر أو غير مباشر، تغيير الانتاج وظيفية من هذه الدائرة التغذية، والتي يمكن تقييمها وترتبط مع التغيرات في morpholoغراي من العمارة محوار.

1. صيانة أقفاص السكان

1. الحفاظ على أقفاص السكان عند 25 درجة مئوية على دورة ضوء الظلام 12 ساعة. طالما تتعرض مجموعات المراقبة والتجريبية لظروف الإضاءة نفسه، ثم هذا الأسلوب لا يمكن أن يؤديها في إعداد مختبر القياسية.
2. تسمح الإناث لوضع البيض بين عشية وضحاها على التفاح عصير لوحات أجار.
3. جمع اليرقات حديثة الفقس من خلال الحفاظ على لوحات مع البيض المودعة حديثا في 25 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. وضع الكمشه صغيرة من الخميرة في وسط لوحة لجذب اليرقات.
4. 1 ^شارع الطور جمع اليرقات التي هاجرت إلى عجينة الخميرة في وسط لوحة عصير التفاح. استخدام ملعقة معدنية لتحويلها إلى لوحة عصير التفاح الطازج. ويمكن أن يضاف معجون الخميرة إضافية لضمان وجود الغذاء الكافي حتى يتم تنفيذ المقايسات. ويمكن أيضا لوحات عصير العنب أن تستخدم بدلا من لوحات عصير التفاح.
5. الحصول الراحل ^{الثانية} 2 في وقت مبكر طور مرحلي ^{الثالثة} 3 لترarvae من خلال السماح 1 ^شارع الطور للسن 40-48 ساعة. ضمن هذا النطاق معدلات التغذية ثابتة ^13. ويمكن التأكد عن طريق الفحص من سن السنانير الفم كما أن هناك تغييرات واضحة في هذا الهيكل مع كل تساقط اليرقات.
6. يتم جمع الراحل ^{الثانية} 2 في وقت مبكر 3 اليرقات طور مرحلي ^{الثالثة} لفحوصات السلوك حسب بلطف وعلى نطاق واسع غسل لوحات عصير التفاح مع الماء وجمع اليرقات على تصفية شبكة. ثم يتم نقل اليرقات إلى لوحة آغار.
7. يتم تنفيذ كافة التحليلات بالتوازي باستخدام السيطرة وحيوانات التجارب.

2. بارادايم السلوكية - تحرك

1. وضع واحد 3 يرقة طور مرحلي ^{الثالثة} على 2٪ أجار الركيزة في 100 ملم الأنسجة طبق الثقافة وتسمح لليرقة حتى يتأقلم لمدة 30 ثانية. اليرقات استخدام sclerites cephalopharyngeal بهم (الفم السنانير) لدفع أجسادهم عبر سطح الركيزة أجار. يتم ذلك على لوحة منفصلة لأننير هو أكثر صعوبة لتصور تقلصات الجسم في حل الخميرة كما الحيوان هو تقريبا نفس لون الخميرة.
2. مراقبة وتسجيل كل حركة الأمامي الخلفي لأكثر من الركيزة لمدة 1 دقيقة. ن = 20 لكل الوراثي. يجب أن يعاير لا يزيد عن 10 لوحة في الحيوانات.

3. سلوك النموذج - تغذية

1. باستخدام حادة اينوكس # 5 ملاقط، ونقل بعناية 3 يرقة طور مرحلي ^{الثالثة} من لوحة الحركي أجار إلى مركز لوحة أجار شغل مضافين مع 5 مل من محلول الخميرة 2٪ الخباز تفعيلها لل. تأكد من أن الحل هو متجانسة مثل الخميرة سوف يستقر مع مرور الوقت. عندما تكون في حل الخميرة، وسوف تظل اليرقات إلى حد كبير في المكان والأعلاف، وتسهيل مراقبة السلوك. معدل الفم تقلصات هوك يرتبط بشكل مباشر مع كمية من المواد الغذائية بلعها ^14.
2. تسمح اليرقة حتى يتأقلم لمدة 30 ثانية.
3. مراقبة وتسجيل عددالفم تقلصات هوك لمدة 1 دقيقة. ن = 20 لكل الوراثي.

4. التشريح غوت اليرقات

1. جعل 4٪ EM-الصف حل الفورمالديهايد التثبيت في الفوسفات مخزنة المالحة 1X (PBS) ووضعه في كوب بقعة 3 جيدا.
2. تشريح بعناية يتجول في وقت متأخر 3 طور مرحلي ^{الثالثة} الشجاعة اليرقات في طبق زجاج 3 جيدا باستخدام الحل برنامج تلفزيوني 1X، والتأكد في كل مرة أن يتم ترك مقدم المعدة سليمة. مع forcep واحدة، وعقد نهاية الخلفي، ومع الآخر، مع الاستمرار على السنانير الفم. في حين عقد ثابت نهاية الخلفي، وسحب بلطف على السنانير الفم للوصول إلى الشجاعة. إزالة أي أنسجة المرتبطة (الغدد اللعابية والدماغ والجسم من الدهون، الخ)، ثم نقل كل الأمعاء إلى الطبق 3 جيدا يحتوي على الفورمالديهايد الإصلاح. يتجول 3 ^{الثالثة} طور مرحلي اليرقات تستخدم لأنه في هذه المرحلة من التنمية، ووقف تغذية اليرقة تمهيدا لpupariation، ويتم مسح مقدم المعدة من الخميرة.
<لى> احتضان الشجاعة في 4 درجات مئوية خلال الليل في مربع مبهمة زراعة الأنسجة.
3. قبل إزالة الحل الفورمالديهايد التثبيت من الآبار، وإزالة الجبل في المعدة والمعي المتوسط ​​كليب ~ 150 ميكرون ² من مقدم المعدة بحيث يمكن بوضوح أن ينظر التوقعات دون عائق.
4. إزالة الإصلاح الفورمالديهايد من الآبار واستبدال PBT 1X (1X PBS، 0.1٪ خالية من ألبومين المصل البروتيني الأبقار، 0.1٪ تريتون X-100) حل العازلة. اغسل الشجاعة 6X لمدة 10 دقيقة في PBT 1X. وضع عينات الأنسجة على محور دوار الميكانيكية أثناء القيام يغسل.
5. احتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة في 10 ^-6 M 5-HT لتعزيز السيروتونين الإشارة. اغسل الشجاعة 6X لمدة 10 دقيقة في PBT 1X. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن هذا تركيز الخارجية 5-HT لا يؤثر العمارة العصبية أو الكثافة دوالي في التحليلات المناعى وببساطة يعزز إشارة إلى نسبة الضوضاء ^15-16.
6. احتضان عند 4 و# 176؛ مئوية خلال الليل في الأجسام المضادة الأولية مكافحة السيروتونين (وحيدة النسيلة التي أثيرت في الماوس أو بولكلونل أثيرت في الأرنب). اغسل الشجاعة 6X لمدة 10 دقيقة في PBT 1X. وضع عينات الأنسجة على محور دوار الميكانيكية أثناء القيام يغسل.
7. احتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة في الضد الثانوية (اليكسا فلور 568 الماعز المضادة للماوس أو المضادة للأرنب مفتش؛ 1:400 تمييع). اغسل الشجاعة 6X لمدة 10 دقيقة في PBT 1X. وضع عينات الأنسجة على محور دوار الميكانيكية أثناء القيام يغسل.
8. احتضان في 4 ملي كربونات الصوديوم لمدة 10 دقيقة على محور دوار الميكانيكية، ثم جبل في 4٪ ن ن gallate/20 ملي كربونات الصوديوم، وعرض تحت مضان. ويستخدم كربونات الصوديوم لتحويل العينات إلى المخزن المؤقت ودرجة الحموضة المستخدمة في وسائل الإعلام مرس.
9. التقاط الصور من عينات الأنسجة immunostained في التكبير 400X لتحليلها.

5. تحليل الدارات العصبية

1. وتم قياس كمية الألياف محوار (عدد وحجم دواليودرجة التفرع) باستخدام Neuroleucida وNeuroexplorer. ومع ذلك، وهذا يمكن أيضا أن يتحقق يدويا أو باستخدام بسيطة محوار الراسم (تطبيق الحرة التي يمكن تحميلها عبر الإنترنت).
2. تتبع التوقعات الألياف الفردية من الدماغ إلى مقدم المعدة وتحديد عدد دوالي والفروع وعدد من دوالي كبيرة لكل وحدة طول. هي واحدة من الألياف محور عصبي إسقاط من المخ إلى الأعصاب والراجع لا يمكن الوصول إليها لتحليلها حتى تصل إلى مقدم المعدة حيث فصل وfasciculate.

دائرة التغذية هرمون السيروتونين في يرقة ذبابة الفاكهة يمكن أن تكون بمثابة نموذج فعال للغاية لمراقبة تأثير العوامل بشكل خاص على تطوير النظام العصبي. بواسطة quantitating معدل التغذية، فمن الممكن لربط العمارة محور عصبي من الدائرة التغذية مع الانتاج الفنية للمجلس (الشكل 1). يستخدم الفحص الحركي كوسيلة لمراقبة الفسيولوجية للالتراجع عنها من السنانير الفم، لأن يرقات استخدام خطاطيف أفواههم لدفع أنفسهم عبر السطح من أجار. ينبغي أن يكون هناك أي اختلاف في الردود الحركي بين السيطرة والمورثات الطافرة إذا كانت الطفرات تؤثر فقط على دائرة التغذية 8 (الشكل 2A). إذا فروق ذات دلالة إحصائية القيام تحدث، فمن الممكن تعرض للخطر سلوك اليرقات التي كتبها سوء التعامل. إذا توقف اليرقات خلال الفحص في محاولة لتحفر من خلال الركيزة أجار، فإنها قد تكون قديمة جدا، ويرجح الانتقال إلى الطور تجول.فمن الممكن أيضا قد تكون الركيزة أجار من الصعب جدا، مما يجعل من الصعب على اليرقات السنانير الفم للاستيلاء على الركيزة أجار، وهذا يمكن أن تعالج عن طريق تبليل سطح أجار.

هذا الاختبار يمكن استخدامها لتقييم ما إذا كانت سلالات ذبابة الفاكهة مع العيوب التشريحية العصبية تؤثر على التنمية من دائرة التغذية هرمون السيروتونين. الجسم الإهليلجي متحولة المفتوحة (ايبو 3) لديه الخلل الهيكلي في الجسم الإهليلجي للمجمع المركزية. مقارنة مع البرية من نوع السلالة الأبوية كانتون-S، CS وو، يكشف عن أن هذه العيوب التشريحية خلال نتيجة نمو المخ في التغذية الاكتئاب بينما تنقل تتأثر (الشكل 2B).

العيوب التشريحية في ايبو تظهر 3 المسوخ لتغيير وتطوير البنية محوار للامعاء. الشكل 3 يبين التغيرات في بنية الألياف في اليرقات المقارنة ايبو 3أحمر مع CS وو، وهذه اليرقات عرض زيادة في المتفرعة وكذلك زيادة في عدد كل من دوالي الصغيرة والكبيرة على طول محوار. ملاحظة يمثل العقد فرع (الأسهم)، دوالي (السهام)، ودوالي كبيرة (النجمة). الشكل 4 الكميات من هذه الصور.

الكميات المناسبة من بنية محور عصبي يتطلب أن الصور تكون واضحة للغاية. يمثل الشكل 5A صورة مناسبة للتحليل. وسوف صور أقل جودة تجعل من الصعب التمييز بين الألياف ودوالي (الشكل 5B). عند تصوير العمارة الألياف، وتجنب أخذ الصور التي تشمل التوقعات في الجزء الأمامي من مقدم المعدة، لأن الألياف هي واحدة بإحكام ويتم فصل من بعضها البعض ويمكن أن تظهر كما لو أنها تشعبت و. وأكثر تشعبت أكثر ألياف الخلفي داخل المعي المتوسط ​​لأنها fasciculate مرة واحدة لديهم إعادة في داخل هذا النسيج. الكميات من الفروع وعدد دوالي، وحجم دوالي، يمكن تحليلها يدويا أو عن طريق برنامج مصمم لغرض دراسة مورفولوجيا محوار، مثل Neuroleucida. طالما لا تلف مقدم المعدة خلال بروتوكول المناعى، والصورة هو في التركيز، فإن الاستعدادات تكون مقبولة للتصوير والتحليل. فإذا كانت بنية الألياف بشكل واضح يمكن تمييزها عن الخلفية، وإذا كان من الممكن تحديد دوالي الفردية على طول محوار، وإعداد مناسب للتحليل. أيضا، إذا يمكن تحديد دوالي الفردية عن بقية الألياف، وهذا هو أيضا مؤشر آخر على جودة الصورة للتحليل. ويتم تحليل جميع الألياف باستثناء تلك التي خارج نطاق التركيز (في بعض الحالات الألياف سوف منحنى بين الطائرات متعددة من التركيز).

es/ftp_upload/51062/51062fig1.jpg "العرض =" 500px "/>
الشكل 1. دائرة التغذية اليرقات. فيليه من 3 يرقة طور مرحلي الثالثة تبين أنسجة المخ والقناة الهضمية (A). و immunostained أنسجة القناة الهضمية من تشريح 3 اليرقات طور مرحلي الثالثة مع الأجسام المضادة التي أثيرت ضد ذبابة الفاكهة هيدروكسيلاز التربتوفان العصبية (DTRH، B) أو 5-HT ( C). A، B. E والمريء؛ متولى حسن والفم السنانير؛ العلاقات العامة، ومقدم المعدة؛ برازيلي والدماغ (لاحظ نمط من الخلايا العصبية 5-HT). رأس السهم يعين العصب الجبهي؛ سهم، العصب الراجع C. مقدم المعدة تظهر الألياف محور عصبي (السهام). مقياس بار = 20 ميكرومتر. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

<ر /> الشكل 2. العيوب التشريحية خلال النتائج نمو الدماغ في سلوك التغذية الاكتئاب. ويعاير الحيوانات لالحركي (A) والسلوكيات التغذية (B). وكان تحرك تتأثر. ن = 20 لكل فحص السلوكية، 2-3 تجارب مستقلة. **** ع <0.0001، المفردة اختبار t. خطوط فوق الرسم البياني تصور الخطأ المعياري للمتوسط. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

الرقم 3. العيوب التشريحية خلال تطوير نتائج CNS في انحراف في العمارة الألياف الأمعاء. الأنسجة تشريح الأمعاء من 3 طور مرحلي الثالثة اليرقات وimmunostained مع anti-5-HT. السهم يدل على عقدة الفرع. رأس السهم يدل على دوالي الصغيرة. النجمة ديتلاحظ دوالي كبيرة. مقياس بار = 40 ميكرومتر. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

الشكل 4. العيوب التشريحية خلال نتيجة نمو الدماغ الشاذة في العمارة الألياف الأمعاء. تحليل الأنسجة proventricular من 3 اليرقات طور مرحلي الثالثة تشريح وحضنت مع مكافحة-5-HT. محوار المتفرعة (A)، وعدد من الكل دوالي في 0.1 ملم طول محوار (B) وعدد من دوالي كبيرة (> 1μm 2) لكل 0.1 ملم طول (C). CS وو، 20 ألياف من 17 الشجاعة من 2 تجارب مستقلة؛ ايبو 3، 20 ألياف من 18 الشجاعة من 3 تجارب مستقلة. **** ع <0.0001، ** ع <0.01، * ع <0.05، TT المفردةخطوط الرسم البياني أعلاه طبقا لتقديرات عام تصور الخطأ المعياري للمتوسط. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

الرقم 5. جودة الصور مهم لتحديد الكميات المناسبة من بنية الألياف الأمعاء. أنسجة الأمعاء تشريح من CS وو 3 طور مرحلي اليرقات وimmunostained مع anti-5-HT. (A). صورة ذات نوعية جيدة. (B). ضعيف جودة الصورة. مقياس بار = 40 ميكرومتر. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.