مقالة منهجية

قياس اليرقات آخر في ذبابة الفاكهة مراقبة النشاط

DOI:

10.3791/52684

⸱

أبريل 30, 2015

 ,  , 
1Department of Biology, University of New England

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا التقرير طريقة لقياس نشاط يرقات ذبابة الفاكهة باستخدام مراقب نشاط ذبابة الفاكهة TriKinetics. يستخدم الجهاز أشعة الأشعة تحت الحمراء للكشف عن حركات ما يصل إلى 16 فرديا. يمكن تحليل البيانات لتمثيل معلمات الحركة بما في ذلك معدلات ومواقع داخل غرف الفحص.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ذبابة الفاكهة تستخدم اليرقات في العديد من الدراسات السلوكية ، ومع ذلك لم يتوفر جهاز بسيط لقياس المعلمات الأساسية لنشاط اليرقات. يعيد هذا البروتوكول استخدام أداة تستخدم غالبا لقياس نشاط البالغين ، وهي جهاز مراقبة نشاط ذبابة الفاكهة TriKinetics (MB5 Multi-Beam Activity Monitor) لدراسة نشاط اليرقات. يمكن للأداة مراقبة تحركات في 16 أنبوبا فرديا للفحص الزجاجي مقاس 8 سم ، باستخدام 17 شعاعا للكشف عن الأشعة تحت الحمراء لكل أنبوب. يقوم برنامج التسجيل تلقائيا بحفظ البيانات على جهاز كمبيوتر ، وتسجيل المعلمات مثل عدد الحركات ، وأوقات تشغيل المستشعرات ، ومواقع داخل الأنابيب. يمكن بعد ذلك تحليل البيانات لتمثيل الحركة الإجمالية و / أو تفضيل الموضع بالإضافة إلى القياسات الأخرى. يمكن الوصول إلى جميع البيانات بسهولة ومتوافقة مع برامج الرسوم البيانية ومعالجة البيانات الأساسية. سيناقش هذا البروتوكول كيفية استخدام الجهاز وكيفية تشغيل البرنامج وكيفية تشغيل مقايسة نشاط اليرقات من البداية إلى النهاية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أدى استخدام ذبابة الفاكهة كأداة وراثية إلى تحويل المعرفة العلمية للأنظمة البيولوجية. ذبابة الفاكهة تم استخدام يرقات في مجموعة متنوعة من الدراسات بما في ذلك الشعور بالألم1 ، والتطور2 وكنموذج لدراسة جينات الأمراض البشرية3. يشمل نشاط ذبابة الفاكهة مجموعة من السلوكيات التي تختلف في ظل ظروف مختلفة بما في ذلك درجات الحرارة2 والتعرض للأدوية4 وبين الأنماط الجينية المختلفة. ومع ذلك ، على الرغم من الاستخدام الكبير لليرقة ككائن حي نموذجي ، لم تتوفر طريقة بسيطة وموحدة لتحليل نشاط اليرقات. في الوقت الحاضر ، تستخدم العديد من دراسات حركة اليرقات برامج تحليل فيديو متطورة5. على الرغم من قوتها ، إلا أن تعقيد هذه الأدوات الآلية قد يثبط المختبرات غير المجهزة بالفعل لدراسة الحركة من تضمين تحليل معلمات النشاط الإعلامي في دراساتها. في الطرق غير الآلية الحالية الأخرى ، مثل تحليل الزحف الشبكي ، يتم تسجيل الحركة بواسطة مراقب بشري ، مما يقدم إمكانية الذاتية ويحد من الإنتاجية لحيوان واحد في كل مرة6-7. استخدمت دراسة مماثلة اختبار زحف من 5 حارات ، والذي يقيس الوقت الذي تستغرقه اليرقات للسفر لمسافة طوليةمعينة 8. في مثل هذه المقايسات غير الآلية ، يتم قياس الإزاحة ولكن هذا لا يأخذ في الحسبان السفر غير الخطي بين نقطتي البداية والنهاية. كما هو موضح أدناه ، فإن الطريقة الموضحة هنا تمثل المزيد من حركة اليرقات الفعلية ، وهي موضوعية وسهلة التشغيل وتوفر إنتاجية قوية.

لدراسة سلوك نشاط اليرقات بسهولة دون المساومة على الدقة أو الكفاءة أو التكلفة ، تستخدم هذه الطريقة جهاز مراقبة نشاط ذبابة الفاكهة TriKinetics (DAM) ، وهو جهاز يستخدم غالبا لدراسة نشاط البالغين. يعد استخدام جهاز واحد لدراسة كل من نشاط البالغين واليرقات فعالا من حيث التكلفة ، ويسمح بالمقارنة المباشرة لحركة في هاتين المرحلتين من الحياة. يستخدم النظام ، الذي يتميز بأعلى مستوى من الدقة للشركة المصنعة ، 17 شعاعا للكشف عن الأشعة تحت الحمراء لكل أنبوب فحص ، والتي تسجل نشاط اليرقات عند كسر حزم المستشعر داخل 16 أنبوبا فرديا. يقوم النظام بعد ذلك تلقائيا بحفظ المعلومات المسجلة على جهاز كمبيوتر ، مما يجعلها متاحة للتلاعب باستخدام برامج الرسوم البيانية الأساسية. تمثل البيانات التي تم الحصول عليها الحزم التي تم كسرها بواسطة اليرقات الفردية (والتي يمكن تحويلها إلى معدل) ، والحركة عندما تبقى اليرقة داخل شعاع كاشف وموضع داخل غرف الفحص خلال فترة التسجيل (مما يسمح للمرء بحساب تفضيل الموضع). النظام فعال وسهل التشغيل نسبيا ، ويوفر تحليلا أساسيا للنشاط الأساسي قابلا للتكرار بدرجة كبيرة في متناول أي مختبر يدرس يرقات ذبابة الفاكهة.

لإثبات قوة هذا الاختبار ، يتم تقديم البيانات التي توضح استخدامه للتحقق من الاختلافات في النشاط الناتجة عن درجات الحرارة المحيطة المتغيرة ، وكذلك من خلال مقارنة طفرة وصفت سابقا بأنها غير نشطة (iav1)9 مع عنصر تحكم تم تحليله على نطاق واسع (w1118).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد يرقات

  1. لتحليل يرقة المطلوب للتحرك أو موقف تفضيل، وتنمو اليرقات في ظل ظروف قياسية لعمر المطلوبة لفحص 10 باستخدام ذبابة الغذاء القياسية 11.
  2. إجراء التصفية شبكة التي تمتد الشاشة الحريرية الصف النايلون شبكة فوق قمع. تأمين شبكة في الرقبة قمع مع الشريط المطاطي. وضع قمع في كوب.
  3. لجمع اليرقات لتحليلها، مغرفة ملعقة-كاملة من الأغذية التي تحتوي على يرقات تستخدم علفا من زجاجة الثقافة ويغسل بالماء RT الصنبور على تصفية شبكة، وجمع اليرقات الفردية مباشرة من شبكة مع الرسام 10.

2. إعداد الفحص أنابيب

  1. الاستعداد لتوصيل أنابيب الاختبار، وتغلي بعناية 4٪ هلام أجار وتصب في طبق بتري على عمق 1.5 سم. هذا وسوف توفر المكونات لجانبي الأنبوب عندما يتم وضع الحيوان. الحل 4٪ كثيفة بما فيه الكفاية لمنع اليرقات من صenetrating المقابس.
  2. التأكد من أن أنابيب نظيفة واضحة قبل إدخال اليرقة. إذا لم تكن كذلك، وهذا قد منع الحركات من يجري تسجيلها.
  3. لضمان اليرقات لديها ما يكفي من الرطوبة للحركة، وإعداد زجاجة ضغط تحتوي على كمية صغيرة من الماء الساخن. قلب الزجاجة، توجيه بعناية منفذ نحو بالوعة والضغط برفق لطرد الماء من أنبوب صغيرة.
  4. إدراج منفذ زجاجة في أنبوب الاختبار. ضغط على زجاجة لتقديم بخار الماء في أنبوب الاختبار حتى تظهر طبقة رقيقة من التكثيف على جدار الأنبوب. الفيديو 1 يظهر يرقة تتحرك في أنبوب مع كمية مناسبة من الرطوبة.
  5. لاغلاق اليرقة في الأنبوب، وإزالة هلام أجار 1.5 سم سميكة من طبق بتري ومكان على سطح شبكة لتسمح بتدفق الهواء تحت آغار بحيث يمكن إدراج قابس أجار في أنبوب. اضغط احدة من نهاية أنبوب الاختبار في هلام مرتين لإدراج اثنين من المقابس من هلام إلى نهاية واحدة.
  6. مع paintbالاندفاع، ضع يرقة واحدة في أنبوب ما يقرب من 1.5 بوصة العميق وختم الأنبوب عن طريق الضغط على نهاية أقرب اليرقة إلى هلام أجار. فإن الضغط الناتج طرد المكونات الثاني من هلام أجار من الطرف المقابل وختم الحيوان داخل الأنبوب.
  7. أنابيب مكان في الجهاز MB5 متعدد شعاع ذبابة الفاكهة مراقبة النشاط (DAM)، وتعديل المواقف الأنابيب 'حتى أن الحيوانات لا يمكن أن تتحرك خارج نطاق من أجهزة الاستشعار.
  8. للتأكد من أن فحص الأنابيب لا تنزلق من تحت الحمراء إطار القراءة للجهاز أثناء النقل، وعقد أنبوب في مكان بواسطة الربط حلقة من المعجون حول كل أنبوب حيث إنها تجري اتصالات مع جهاز تسجيل.

3. قياس آخر

  1. سجل النشاط في حاضنة لمنع قراءات دقيقة التي قد تحدث بسبب الظلال، ومصابيح الفلورسنت أو لتغيرات درجة الحرارة في المختبر. انظر الشكل 5 لترتيب المقترح للنظام.
  2. مجموعة حاضنة إلى 20 درجة مئوية (انظر الشكل 1). لتجنب تسجيلات كاذبة بسبب تدخل من مصادر الضوء ساطع أثناء التسجيل، إطفاء الأنوار حاضنة الفلورسنت واستخدام مصدر مستقل ضوء LED أثناء التسجيل في الحاضنة. إجراء المحاكمة دون أي الحيوانات لضمان ظروف الإضاءة لا تثير aberrantly أجهزة الاستشعار. يجب أن تكون هناك أية بيانات حركة سجلت بعد هذا الاختبار.
  3. السماح اليرقات حتى يتأقلم إلى 20 ° C إعدادات الحاضنة لمدة 5 دقائق قبل بدء الفحص.
  4. لضبط النظام DAM لفترات التسجيل المطلوب (على سبيل المثال، 1 دقيقة)، تأكد من تحميل DAM برنامج تسجيل نظام لاستضافة الكمبيوتر 12 وفتح ملف النظام DAM قبل ربط غرفة تسجيل واجهة PSIU.
  5. لضبط التردد التسجيل المطلوب الذي سيتم حفظ البيانات، حدد تفضيلات ثم انقر فوق أو تحت خيار الفاصل الزمني القراءة لتحديد الأطر الزمنية المختلفة التي البياناتسيتم تخزين. على سبيل المثال، حدد القراءة الأوقات الفاصلة من 1 ثانية إلى 1 ساعة.
  6. لتحديد المعلمة متفاوتة لتسجيل البيانات، اختر تفضيلات ثم حدد المربعات المقابلة تحت نوع بيانات الناتج (التهم، والتحركات والمواقف ويسكن، انظر الجدول 1). توفر كل معلمة تحليلا فريدا للنشاط اليرقات داخل الأنبوب.
  7. لبدء التسجيل، توصيل جهاز العرض إلى وحدة واجهة التيار الكهربائي (PSIU) باستخدام كابل الهاتف CAB6. ربط PSIU إلى التيار الكهربائي. وهناك ضوء أخضر تشير الاتصال المناسب.
  8. ربط PSIU من خلال الناقل التسلسلي العالمي (USB) برقية إلى ماكنتوش أو جهاز كمبيوتر ويندوز لتسجيل البيانات. فتح برنامج DAM SystemMB1v6x على الكمبيوتر لبدء تلقائيا تسجيل البيانات.
  9. بعد وقت جمع المطلوبة كاملة، حدد إنهاء، ثم قم بإنهاء الآن على الشاشة النشاط DAM. وبعد ذلك يتم حفظ البيانات تلقائيا تحت DAM بيانات النظام. خذ هذا الملف البيانات (على سبيل المثال، مراقبة 1) واسحب في مجلد منفصل. وسوف تخزن البيانات الأولية من برنامج DAM بحيث يمكن بعد ذلك تتم معالجتها.

4. إعداد بيانات للتجهيز (DAM FileScan)

  1. لمعالجة البيانات الخام إلى صيغة مفهومة فتح التطبيق DAM FileScan واختر تحديد مجلد بيانات الإدخال. ثم اختر مجلد البيانات والملف المطلوب، وحدد الخيار المسح الضوئي. وأخيرا تحديد طول بن لفترة القراءة المطلوبة. وهذا تنظيم البيانات الخام إلى المعايير المحددة من قبل المشغل وهذا البرنامج سوف يقدم تقريرا البيانات التي تم جمعها في هذا النطاق معين.
  2. حدد نوع بيانات الناتج لتحليل وضع الحركة المطلوبة (مراقبة التهم، والتحركات، يسكن). ضمن القائمة قراءات إضافية، حدد المبلغ إلى بن (هذا إذا كان طول بن أكبر من نظام الفاصل الزمني للقراءة مختارة).
  3. اسم الملف بشكل مناسب وحفظها. سيتم تخزين الملف في نفس الموقع مثل مجلد من الخطوة 3.9.
_title "> 5. الوصول إلى البيانات لتحليل

  1. من أجل جمع متوسط ​​التحركات، عملية البيانات الخام الناتجة عن الخطوة 4. لإنشاء جدول في برنامج جداول البيانات، فتح ملف تم حفظه سابقا (الخطوة 4.3)، وعندما تظهر نافذة معالج استيراد النص، حدد النهاية لفتح ملفات البيانات في شكل جداول.
    ملاحظة: اعتمادا على نوع البيانات التي تم تحليلها، وسيتم قراءة جدول البيانات بشكل مختلف. عادة لقياس تحركات الشاشة أو التهم الموجهة إليه، وسوف يتم تسجيل الفترة الزمنية للدراسة من الناحية العددية، في حين أن كل أنبوب القراءة الفردية سيحصل بريد إلكتروني معين. عند عرض البيانات في جدول البيانات، والأعمدة KZ تمثل فتحات الأنابيب فحص 16/01 على التوالي. الصفوف تمثل نقاط البيانات التي تم جمعها.
  2. على سبيل المثال، إذا تم جمع التحركات لمدة 20 دقيقة في 1 دقيقة فترات، ومتوسط ​​20 الصفوف لحساب متوسط ​​عدد التحركات / دقيقة وقياسات أخرى.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويبين الشكل 1 نتائج من دراسة استجابة الحرارة من سيطرة الطور الثالث اليرقات، ث 1118، وذلك باستخدام جهاز مراقبة للكشف عن الاختلافات في الحركة اليرقات في سبع درجات حرارة مختلفة. تم غسلها اليرقات ووضعها في الجهاز النشاط DAM كما هو موضح أعلاه، ووضعها في حاضنة لتعيين درجة الحرارة المطلوبة. وبعد ذلك يسمح الجهاز للتأقلم مع البيئة لمدة 5 دقائق قبل بدء التسجيل. تم تحليل كل يرقة بشكل فردي لتنقل أكثر من دقيقة الفترة 20 ومتوسط ​​عدد من التحركات في الدقيقة حسبت لكل ح...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويتأثر النشاط من يرقات ذبابة الفاكهة من قبل مجموعة متنوعة من العوامل بما في ذلك النمط الجيني 8، سن 13 ودرجة الحرارة المحيطة 2. على الرغم من أن وسائل videographic قوية قادرة على تحليل مفصل للغاية تم تطويرها من قبل أولئك الذين يدرسون الحركة 5، هذا المستوى من التفصيل قد تكون زائدة عن الحاجة لأولئك الذين يرغبون في تحديد المعايير الأساسية للنشاط. الطريقة الموصوفة هنا يستخدم الجهاز الذي يتوفر في العديد من المختبرات، من السهل أن تعمل، ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة P20GM103643 إلى I. Meng.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
ذبابة الفاكهة مراقب النشاط ، Multibeam ، 16 أنبوبا ، بما في ذلك الأسلاكTriKinetics Inc.   ؛MB5
واجهة امدادات الطاقة لمراقبة النشاط  شركة TriKinetics Inc. PSIU24
زجاج 80 × 5 مم أنابيب لمراقب النشاط (100)TriKinetics Inc.   ؛PGT 5x80
DAMsystemMB1v6x برامج الحصول على البيانات لنظام التشغيل Macintonsh OSX (Intel)www.trikinetics.com< / a>تحميل مجاني
برنامج DAMFileScan 108x لنظام التشغيل Macintoshwww.trikinetics.com< / a >تنزيل
مجاني لبرنامج USB (PSIUdrivers.zip).www.trikinetics.com< / a>تحميل مجاني
DAMSystem Notes 308www.trikinetics.com< / a>تحميل مجاني
Zeiss Stemi 2000C- خدمات أطياف المجهر الاستريوSP-STEMI2000C-BS
ثاني أكسيد الكربونمين أوكسيالتخدير
ذبابة الوسادةجينيسي59-114سطح لفرز الذباب المخدر
فرشاة طلاء صغيرة   ؛Winsor & نيوتن# 2 جولةأو ما شابه ذلك ، تستخدم لفرز الذباب المخدر
شبكة طباعة الشاشة الحريرية (160)msj-gallery.comSM160W63-3YDحجم المسام المستخدم في هذا البروتوكول كان ~ 0.1 مم
TegoseptGenesee20-258مادة حافظة
للإيثانول (190 برهان) تستخدم111000190 Pharmcoلإذابة Tegosept
6 أوقية زجاجة مربعة القاع (PP)Genesee32-130
"Flugs" لزجاجات الذبابة البلاستيكيةGenesee49-100
قارورة ذبابة الفاكهة ، عريضة (PS)Genesee32-117
Flugs لقوارير بلاستيكيةعريضة Genesee49-101
الميداليةالذهبية لوجبة الذرة الصفراء منزوعة الإنبات
ذبابة الفاكهةأجار LabScientificFLY 8020
خميرة بيكر - ريد ستاركينغ آرثر طحين1270
حبيبات سكر -دومينو
ناعم للغاية

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tracey, W. D. Jr, Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. painless, a Drosophila.gene essential for nociception. Cell. 113, 261-273 (2003).
  2. Ainsley, J. A., Kim, M. J., Wegman, L. J., Pettus, J. M., Johnson, W. A. Sensory mechanisms controlling the timing of larval developmental and behavioral transitions require the Drosophila.DEG/ENaC subunit. Pickpocket1. Dev. Biol. 322 (1), 46-55 (2008).
  3. Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila. melanogaster.and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol. Rev. 63 (2), 411-436 (2011).
  4. Cattaert, D., Birman, S. Blockade of the central generator of locomotor rhythm by noncompetitive NMDA receptor antagonists in Drosophila.larvae. J. Neurobiol. 48 (1), 58-73 (2001).
  5. Caldwell, J. C., Miller, M. M., Wing, S., Soll, D. R., Eberl, D. F. Dynamic analysis of larval locomotion in Drosophila. hordotonal organ mutants. PNAS. 100 (26), 16053-16058 (2003).
  6. Nichols, C. D., Bechnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. J. Vis. Exp. (61), (2012).
  7. Godoy-Herrera, R. The development and genetics of digging behavior in Drosophila. arvae. Heredity. 56, 33-41 (1986).
  8. Sinadinos, C., Cowan, C. M., Wyttenbach, A., Mudher, A. Increased throughput assays of locomotor dysfunction in Drosophila. larvae. Journal of Neuroscience Methods. 203 (2), 325-334 (2012).
  9. Homyk, T., Sheppard, D. E. Behavioral mutants of Drosophila melanogaster. I. Isolation and mapping of mutations which decrease flight ability. Genetics. 87 (1), 95-104 (1977).
  10. Chattopadhyay, A., Gilstrap, A. V., Galko, M. J. Local and global methods of assessing thermal nociception in Drosophila. larvae. J. Vis. Exp. (63), e3837(2012).
  11. Model Organisms I: yeast, Drosophila and C. elegans. Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: https://www.jove.com/science-education-database/3/essentials-of-biology-1-yeast-drosophila-and-c-elegans (2015).
  12. Woods, J. K., Kowalski, S., Rogina, B. Determination of the spontaneous locomotor activity in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (86), e51449(2014).
  13. Troncoso, B., Godoy-Herrera, R., Waldo, M. The development of larval movement patterns in Drosophila). Heredity. 58 (1), 321-329 (1987).
  14. Helfrich, C., Engelmann, W. Circadian rhythm of the locomotor activity in Drosophila. melanogaster.and its mutants ‘sine oculis’ and ‘small optic lobes. Physiological Entomology. 8 (3), 257-272 (1983).
  15. Johnson, A. W., Carder, W. J. Drosophila, ociceptors mediate larval aversion to dry surface environments utilizing both the painless TRP channel and the DEG/ENaC subunit, PPK1. PLoS ONE. 7 (3), (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Drosophila LarvaeTriKinetics DeviceInfrared DetectionAssay TubesData LoggingSoftware AnalysisAuger PlugsLarval Movement

مقالات ذات صلة