دوامة العقدة العصبية يزدرع الثقافة والكهربية على موضوع الكهربائي صفائف

وفقا لمنظمة الصحة العالمية ، يعاني 360 مليون شخص في جميع أنحاء العالم من فقدان السمع مع عواقب وخيمة على الحياة المهنية والخاصة. يمكن للمعينات السمعية استعادة الوظيفة الحسية في أشكال معتدلة من فقدان السمع. ومع ذلك ، في الحالات الأكثر شدة ، فإن خيار العلاج الأكثر فعالية هو جهاز اصطناعي يسمى غرسة القوقعة الصناعية (CI). تحتوي CIs على مصفوفة أقطاب كهربائية خطية تصل إلى 24 قطبا كهربائيا ، والتي يتم إدخالها جراحيا في scala tympani للقوقعة. تحفز الأقطاب الكهربائية بشكل مباشر الخلايا العصبية العقدية الحلزونية ، وتشكل العصب السمعي ¹.

مع أكثر من 300,000 جهاز تم زرعها في جميع أنحاء العالم ، تعد CIs غرسات طبية ناجحة للغاية وتصنف من بين أكثر الإجراءات فعالية من حيث التكلفة التي تم الإبلاغ عنها على الإطلاق. على الرغم من نجاحها ، لا تزال غرسة القوقعة الصناعية تعاني من قيود مثل انخفاض دقة التردد مقارنة بالسمع الفسيولوجي. يمكن أن يؤدي ذلك إلى عجز في التواصل الفعال في المجموعات أو البيئات الصاخبة ، والقدرة على فك تشفير الأصوات المعقدة للغاية مثل الموسيقى. من المحتمل أن يكون هذا التردد المنخفض بسبب الفجوة بين أقطاب CI والخلايا العصبية العقدية الحلزونية ، مما يؤدي إلى تحفيز مجموعات كبيرة من الخلايا العصبية. هذه الفجوة في حدود مئات الميكرومتر ^2،3. سيؤدي القضاء على هذه الفجوة إلى تسهيل تحفيز مجموعات أصغر من الخلايا العصبية لكل قطب كهربائي ، وبالتالي زيادة دقة التردد والأداء العام للجهاز ⁴.

لدراسة تأثير الفجوة بين القطب الكهربائي والخلايا العصبية وتأثير بروتوكولات التحفيز المحسنة المختلفة ، قمنا بتطوير اختبار حيوي في المختبر بناء على توصيف الفيزيولوجيا الكهربية غير الغازية ل SGNs على مصفوفات متعددة الأقطاب الكهربائية (MEAs) ⁵. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تعديل MEAs بسهولة لتغيير شكل القطب والحجم والمواد وخشونة السطح ، لتحسين واجهة الخلايا العصبية والقطب. فيما يلي بروتوكول خطوة بخطوة للحصول على تسجيلات من مزارع الخلايا العصبية العقدية الحلزونية للفئران وتقييم الاعتماد على المعلمات المذكورة أعلاه.

وقد أجريت رعاية الحيوان والتجريب وفقا للمبادئ التوجيهية للسلطات المحلية سويسري (آمت FÜR Landwirtschaft اوند الناطور قصر Kantons برن، سويسرا).

1. إعداد حلول للتجارب

1. تحضير محلول طلاء المصفوفة خارج الخلية (ECM) (انظر المواد جدول، أشر 6): مزيج ذوبان ECM على الجليد. تمييع مزيج ECM 01:10 في مستنبت الأساسي (بدون عوامل عصبية أو الجنين مصل بقري (FBS)) وتخزينها على الجليد.
2. إعداد مستنبت (انظر المواد جدول، أشر 1): إعداد المخزون المتوسطة Neurobasal لا تحتوي على FBS أو الدماغ مشتقة التغذية العصبية عامل (عامل التغذية العصبية). تكملة وسائل الإعلام neurobasal مع FBS الطازجة (10٪) وعامل التغذية العصبية الدماغي (5 نانوغرام / مل) فقط قبل إضافة إلى زراعة الخلايا.
3. إعداد حل خارج الخلية (انظر المواد جدول، أشر 2).

2. غسل وتعقيم الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف

معشوقة = "jove_content"> ملاحظة: الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف المستخدمة في التجارب تحتوي على 68 الأقطاب مرتبة في شبكة مستطيلة الشكل (1E). كل قطب كهربائي لديها حجم 40 × 40 ميكرون ² مع تباعد من 200 ميكرون من مركز لآخر. مصنوعة أقطاب من البلاتين. يتم توصيل الأقطاب الكهربائية إلى جهات الاتصال المقابلة من قبل دائرة مصنوعة من أكسيد الإنديوم القصدير. معزول هذه الدائرة من قبل طبقة 5 ميكرون من SU-8. انظر الجدول المواد للاطلاع على تفاصيل الموفر. قد تكون تخطيطات MEA أخرى مناسبة لهذه التجارب.

1. الاتفاقات البيئية متعددة الأطراف جديدة: شطف لهم من قبل الغطس في الايثانول 70٪ لمدة 30 ثانية، ويغسل بالماء المقطر لمدة 30 ثانية. العمل في غطاء تدفق الصفحي.
2. اسمحوا الجافة الشرق الأوسط وأفريقيا لمدة 30 دقيقة في غطاء تدفق الصفحي.
3. وضع كل الشرق الأوسط وأفريقيا في طبق بتري معقمة فردي (35 ملم × 10 ملم)، وختم مع احباط. ويمكن تخزين الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف حتى استخدامها.
4. الاتفاقات البيئية متعددة الأطراف المستخدمة: احتضان الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف في طبق بيتري (35 ملم × 10 ملم) التي تحتوي على 1 مل من solut الأنزيميأيون (انظر المواد جدول، أشر 6) O / N على شاكر المداري في RT لإزالة المواد البيولوجية. ثم تابع كما في الخطوة 2.1.
   ملاحظة: التعامل مع الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف مع الرعاية باستخدام ملقط مع نصائح المغطاة بالمطاط.

3. إعداد الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف لتجارب الثقافة

1. إزالة احباط الختم وترك الشرق الأوسط وأفريقيا في طبق بيتري (35 ملم × 10 ملم) في كامل التجربة.
2. معطف الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف مع الحل أعد 1.1: استخدام بارد 200 ميكرولتر ماصة (المخزنة في -20 درجة مئوية) لالماصة 50 ميكرولتر من محلول طلاء على كل الشرق الأوسط وأفريقيا، والتي تغطي منطقة القطب كلها.
3. تسمح الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف لمعطف لمدة 30 دقيقة إلى 1 ساعة على RT.
4. إزالة حل طلاء باستخدام ماصة. تطبيق 100 ميكرولتر من مستنبت تستكمل مع 10٪ FBS و5NG / مل عامل التغذية العصبية ونترك الامر عند RT حتى الطلاء والأنسجة.
5. ضع 2 أطباق بتري تحتوي على الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف المغلفة في طبق بتري كبير (94 ملم × 16 ملم) وإضافة طبق بتري صغيرة ثالث يحتوي على 1.5مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) لالترطيب.
   ملاحظة: إضافة طبق بتري صغيرة (الخطوة 3.5) تحتوي على برنامج تلفزيوني أمر حاسم للحد من تبخر مستنبت بشكل كبير.

4. لولبية العقدة تشريح

ملاحظة: تشريح الإجمالي يمكن أن يتم خارج غطاء تدفق الصفحي (الخطوة 4،1-4،4). لظروف معقمة تشريح غرامة (الصفحي غطاء تدفق) إلزامية (من الخطوة 4.5).

1. الموت ببطء الحيوانات (5-7 اليوم الفئران القديم) قطع الرأس دون تخدير مسبق.
2. تعقيم رئيس عن طريق الرش مع الايثانول 70٪.
3. من خلال عقد الرأس، وقطع الاتصال بين الجلد والجمجمة مع مقص حاد / حاد على طول خط السهمي.
4. قطع الجمجمة sagittally وإزالة المخ باستخدام مقص حاد / حادة.
5. قطع عظم صدغي من الجمجمة ووضع تلك في طبق بتري تحتوي على معقم الجليد الباردة هانكس "محلول الملح المتوازن (HBSS).
6. باستخدام dissecنشوئها المجهر، تشريح الفقاعة الطبلية باستخدام ملقط غرامة وعزل الأذن الداخلية.
7. إزالة العظام من القوقعة، وذلك باستخدام ملقط غرامة.
8. إزالة الرباط دوامة وعائي السطر (SV) معا من خلال عقد مع ملقط الجزء القاعدي من العقدة الحلزونية (SG) وSV وينحل ببطء SV من قاعدة -to-قمة
9. عزل جهاز كورتي (OC)، وسان جرمان وعماد القوقعة (الشكل 1A - C)
10. فصل OC من سان جرمان وعماد القوقعة من خلال عقد مع ملقط الجزء القاعدي من سان جرمان وOC وينحل ببطء OC من القاعدة إلى القمة.
11. إإكسبلنتس الجانبية المقطعة (200-500 ميكرون في القطر) من العقدة دوامة لا تزال تعلق على عماد القوقعة (1D الشكل) باستخدام ملقط ومشرط الجزئي.

5. لولبية العقدة يزدرع الثقافة على الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف

1. وضع اثنين إإكسبلنتس العقدة الحلزونية القادمة إلى الأقطاب في الشرق الأوسط وأفريقيا معدة مسبقا مع 100 ميكرولتر من مستنبت.
2. وضع جهاز كورتي حوالي 5 ملم بعيدا عن منطقة القطب.
3. استخدام ملقط لدبوس إإكسبلنتس وجهاز كورتي على الشرق الأوسط وأفريقيا مع تجنب إتلاف الأنسجة.
4. وضع الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف بعناية في الحاضنة والثقافة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO _2. في اليوم التالي، بفحص بصريا أن إإكسبلنتس وتعلق على الشرق الأوسط وأفريقيا.
   ملاحظة: إذا لم إإكسبلنتس تعلق O / N، فإنها نادرا ما يفعل ذلك خلال الايام القليلة المقبلة. يتم وضع OC المتاخمة للثقافة لدعم الغذائي / التغذية العصبية.
5. إضافة 100 ميكرولتر من مستنبت تحتوي على 10٪ FBS وBDNF يوميا لمدة 5 أيام متتالية.
6. في يوم 6 إضافة 2 مل من مستنبت تحتوي على 10٪ FBS و5NG / مل عامل التغذية العصبية والثقافة الأنسجة لمدة 13 يوما إضافية.

6. تسجيلات الكهربية المعنية بالتحقيق في العفوي والكهربائي تحفيز آخر تابع

1. غسل ثقافة الشرق الأوسط وأفريقيا مع خارج الخلية حتىأعد lution في الخطوة 1.3، في RT.
2. تجفيف اتصالات مع الأنسجة وجبل الشرق الأوسط وأفريقيا على إعداد الشرق الأوسط وأفريقيا.
   ملاحظة: للحفاظ على الثقافة الرطبة خلال التركيب، إضافة قطرة صغيرة من حل خارج الخلية إلى الثقافة.
3. إضافة 300 ميكرولتر من حل خارج الخلية والانتظار لمدة 10 دقيقة قبل ان يسجل، للسماح للنظام لتحقيق الاستقرار.
4. سجل النشاط العفوي لمدة 2 دقيقة من كل الأقطاب عن طريق الضغط على تسجيل / الحصول على زر من البرنامج وتحديد أقطاب تسجيل.
5. الشرق الأوسط وأفريقيا القطب التحفيز: حدد السعة / مدة / شكل حافزا على البرامج المناسبة وتنطبق على العديد من الأقطاب الكهربائية على التوالي كما هو موضح ^13. تحديد الأقطاب على أساس تلك التي تبين النشاط العفوي (كما في الخطوة 6.4). سجل من كل من الأقطاب الكهربائية المتبقية.
6. استبعاد التحفيز قطعة أثرية، وتحفيز من نفس القطب 10 مرات. إذا كانت الثقافة يستجيب لا يقل عن 8 من أصل 10 مرات، ويمكن الافتراض بأنهردا ايجابيا على التحفيز الكهربائي المستحث.
7. لتحديد الضوضاء الخلفية، وتطبيق سم الأسماك الرباعية الأسنان (TTX) إلى cultureat تركيز 1 ميكرومتر، لمنع قنوات الصوديوم الجهد بوابات وسجل لمدة 2 دقيقة. استخدم هذا لإجراء الكشف ارتفاع (7.1 و 7.2).

تحليل 7. البيانات

وقد وصفت تحليل البيانات سابقا بالتفصيل في ⁶ و ^5: ملاحظة. للحصول على تفاصيل عن البرامج المستخدمة في هذه الدراسة معرفة المواد جدول، أشر 7.

1. باستخدام البرنامج المناسب الكشف عن النشاط العفوي لكل القطب توظيف كشف على أساس الانحرافات المعيارية والممي لاحق. يتم وصف هذا الإجراء في ^6. يبدو النشاط العابرين الجهد سريع كما (<5 ميللي ثانية).
2. اختيار عتبة التي ينتج عنها أي نشاط عند تحليل TTX تعامل samples.Adapt قيمة العتبة لكل تجربة للتمييز بين ايجابيات كاذبةه والمكتشفة السلبية الكاذبة.
3. باستخدام البرمجيات المناسبة مراقبة نشاط الخلايا العصبية الكشف عن كل قطب باعتباره مؤامرة النقطية وفقا للإجراءات القياسية (انظر الشكل 2A - C).
4. تحديد وعرض نشاط الشبكة الكلي من خلال تلخيص كل الأحداث الكشف ضمن إطار انزلاق من 10 ميللي ثانية، تحول من 1 الخطوات ميللي ثانية.
5. كشف النشاط الناجم عن التحفيز عن طريق عرض البيانات الأولية باستخدام برامج التحليل المناسب. تحديد طفرات واحدة حاليا يدويا. تظهر المسامير واحد العابرين الجهد سريع كما، والتي تحدث بعد قطعة أثرية التحفيز (رأس السهم في الشكل 2E). يتم عرض مثال في الشكل 2E.
6. اعتمادا على التجربة، وتحليل عدد من الأقطاب الكهربائية الاستجابة، العتبة اللازمة لتحقيق استجابة، وعدد من إمكانات العمل في الأقطاب الكهربائية وغيرها من المعالم التي تهم ^5.

8. الأنسجة التثبيت وإمunohistochemistry

ملاحظة: إن عملية تلطيخ تدمير الشرق الأوسط وأفريقيا. انظر المواد جدول رقم (النقطة 4) للمواد.

1. مباشرة بعد تسجيل غسل الثقافات مع 37 درجة مئوية الحارة برنامج تلفزيوني ثلاث مرات. تجاهل برنامج تلفزيوني وتطبيق 4٪ لامتصاص العرق (PFA) (في برنامج تلفزيوني)، مسخن الى 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
   تنبيه: PFA سامة. العمل في غطاء الكيميائية مع الحماية المناسبة والحل تجاهل فقا للمبادئ التوجيهية.
2. غسل الثقافات ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني ومنع مع 2٪ الأبقار مصل الزلال (BSA) في برنامج تلفزيوني (0.01٪ تريتون-X100) لمدة 2 ساعة.
3. إضافة الجسم المضاد الأول (مكافحة βIII تويولين، TUJ الضد) المخفف في برنامج تلفزيوني (2٪ BSA و 0.01٪ تريتون-X100) وترك O / N عند 4 درجات مئوية. غسل ثقافة ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
   ملاحظة: من الآن فصاعدا حفاظ على عينة في الظلام كلما كان ذلك ممكنا للحد من التبييض من الأجسام المضادة fluorescently المسمى الثانوي.
4. إضافة الضد الثانوية، مخففة في برنامج تلفزيوني (2٪ BSA لد 0.01٪ تريتون-X100)، واحتضان ل1-2 ساعة على RT. وصمة عار نوى إضافة 1: 10،000 دابي (1 ملغ / مل الأسهم) لمدة 10 دقيقة.
5. يغسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني وتركيب عينات الوراء لزلات غطاء رقيقة (24 × 50 مم ²⁾ باستخدام المتوسطة المتزايدة (انظر المواد الجدول، النقطة 4). صورة باستخدام مجهر فلوري مع 5X و20X التكبير.

ويلخص الشكل 1 الإجراء لعزل الأنسجة، وإعداد والثقافة في الشرق الأوسط وأفريقيا. نقدم لك مجموعة من الخطوات متتالية من تشريح الأنسجة لعزل العقدة الحلزونية (SG) من الظهارة الحسية من جهاز كورتي (OC) وعائي السطر (SV) وضمتها الرباط الحلزوني (الشكل 1 A - C). يتم قطع إإكسبلنتس العقدة الحلزونية (3-4 في العدد) مع مقص الصغرى من العقدة كما هو موضح تخطيطي في الشكل 1D وضعت على الشرق الأوسط وأفريقيا (الشكل 1E)، فوق منطقة القطب المحتلة (2.2 ملم 2). يتم وضع OC في القرب، خارج سطح القطب. يمكن مراقبة نمو ثقافة على مر الزمن (الشكل 1G). ويظهر رسم تخطيطي للبروتوكول في الشكل 1F. ويمكن الكشف عن النشاط الكهربية بعد 6 أيام من الثقافة، والتي تزيد مع مرور الوقت ثقافة لفترة طويلة. نحن صecommend تقييم 18 الثقافات اليوم التي تنتج الأرقام أعلى بكثير من أقطاب تسجيل مقارنة نقاط وقت سابق 5.

الشكل 1. إعداد خلية ثقافة. (A) تشريح طازجة الماوس الأذن الداخلية. متقطع الأبيض خط يشير إلى موقع القوقعة، يشير خط متقطع الأسود المنطقة الدهليزي. (ب) ماوس الأذن الداخلية بعد إزالة الجدار عظمي القوقعة. يشار يتحول قوقعة بخطوط متقطعة البيضاء. (ج) لولبية العقدة (SG) وعماد القوقعة، وترد جهاز كورتي (OC) وعائي السطر (SV) والرباط الحلزوني بعد تشريح. (د) رسم تخطيطي للسان جرمان وتشريح OC وإعداد سان جرمان يزدرع {شخصية مقتبسة من 5 بموافقة من الناشر}. (E) رسم توضيحي لمجموعة القطب متعددة المستخدمة في هذه الدراسة. إعادة ترميز ويتم تنظيم أقطاب في شبكة مستطيلة في الوسط وتحتل مساحة 2.2 مم 2. ويوضح أقطاب 4 الأرضي واتصالات جانبية. (F) رسم تخطيطي للبروتوكول الثقافة. وتجرى التسجيلات في اليوم 18. (G) الصور التمثيلية (مشرق صور الميدان) ومخططات إإكسبلنتس سان جرمان في الشرق الأوسط وأفريقيا رصدها في الثقافة في يوم 1 و 6 و 18. مقياس الحانات = 400 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

يمكن الكشف عن النشاط العفوي في الشرق الأوسط وأفريقيا وكما هو مبين مؤامرة النقطية حيث كل سطر من مؤامرة يمثل ارتفاعا الكشف. ويرد مثال ممثل تظهر النشاط العفوي الكشف من عدة أقطاب (ألوان مختلفة في الرسوم البيانية) (الشكل 2A، 2B، و2C).

-together.within الصفحات = "1"> بالإضافة إلى ذلك، أقطاب الشرق الأوسط وأفريقيا يمكن أن تستخدم لتحفيز الثقافة. وأبرز مثال يظهر نبض ثنائي الطور تستخدم لتحفيز (الشكل 2D)، ويرد 5 أقطاب الاستجابة (آثار حمراء اللون) والأقطاب الكهربائية غير الاستجابة (آثار الزرقاء) في الشكل 2E. لهذه التجارب تم استخدام القطب واحد لتحفيز وسائر الأقطاب للتسجيل. ظهرت إمكانات العمل واحدة 1 ميللي ثانية بعد قطعة أثرية التحفيز (أسود رأس السهم). يمكن immunostained الشرق الأوسط وأفريقيا في نهاية هذا الإجراء من أجل تقييم تغطية العمليات العصبية على منطقة القطب. تم استخدام القطب أشار باللون الأخضر في الشكل 2F لتحفيز، واستخدمت الأقطاب هو مبين في الحمراء لتسجيل استجابات (الشكل 2E).

الشكل 2. تسجيلات البيانات في الشرق الأوسط وأفريقيا. (A </ قوي>) آثار التسجيلات الأصلية لستة من أصل 63 الأقطاب تظهر النشاط العفوي. (ب) النقطية مؤامرة من الأقطاب ستة من الشكل 2A بعد اكتشاف ارتفاع. يمثل كل شريط إمكانية عمل واحد. يتم تسجيل (C) مؤامرة النقطية بما في ذلك جميع أقطاب (كما في ألف وباء) آخر من 63 الأقطاب الكهربائية (قنوات رقم 0-63) لمدة 2 دقيقة. (D) والتحفيز ثنائي الطور مع إجمالي مدة 80 μsec وسعة 80 أمبير كان يستخدم لتحفيز الثقافة من القطب واحد (E58 في الشكل 2F). (E) مثال توضيحي من آثار البيانات الخام التي تم الحصول عليها بعد التحفيز من القطب 58 تظهر امكانات العمل (آثار الحمراء) أو بدون ردود (آثار الزرقاء) بعد التحفيز (الأسود السهم الرأس). (F) ثقافة العقدة لولبية في الشرق الأوسط وأفريقيا immunostained للعلامة العصبية TUJ (الأخضر) في نهاية التجربة لتصور العصبية تغطية نال من منطقة القطب {شخصية مقتبسة من 5 بموافقة من الناشر}. يشار إلى القطب 58 تستخدم لتحفيز باللون الأخضر، وأشار أقطاب الاستجابة باللون الأحمر. شريط النطاق = 50 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

وأخيرا، فإن الإعداد الشرق الأوسط وأفريقيا يسمح لدراسة إمكانية تعديل سطح القطب التي قد تزيد حساسية تسجيل. واستخدمت قطبين الشرق الأوسط وأفريقيا المتاحة تجاريا في هذه الدراسة مع اثنين من مختلف السطوح البلاتين: رمادي البلاتين (رمادي حزب العمال)، ويتكون من 150 نانومتر طبقة سميكة حزب العمال (مقاومة: 400 أوم / 1 كيلو هرتز) والأسود البلاتين، (الأسود، وحزب العمال)، التي حصلت عليها ترسب الكهروكيميائية من حزب العمال في نهاية عملية تصنيع دقيق (مقاومة: 20 أوم / 1 كيلو هرتز). انظر المواد جدول رقم (6 نقاط) للحصول على التفاصيل.

الشكل 3. مقارنة رمادي مقابل الأقطاب الأسود حزب العمال. وهناك نوعان من الأقطاب الكهربائية (رمادي واسود حزب العمال) وتمت مقارنة جنبا إلى جنب باستخدام 12 الثقافات الشرق الأوسط وأفريقيا المستقلة، 6 على كل نوع الشرق الأوسط وأفريقيا. (أ) العدد الإجمالي للإعادةويرد أقطاب sponding في التجربة. ويرد (B) عتبة الإتساع للحصول على رد، وتقاس باستخدام 30-35 أزواج القطب مستقلة في 6 التجارب الشرق الأوسط وأفريقيا المستقلة. وتظهر البيانات كما يعني + SD. (الطلاب ر اختبار ف <0.001) الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.