يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

طرق لتصنيف البؤر السيتوبلازمية كما حبيبات الإجهاد الثدييات

14.3K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/55656

⸱

مايو 12, 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Rheumatology, Immunology, and Allergy, Brigham and Women's Hospital, 2Department of Medicine, Harvard Medical School, 3Department of Histology and Embryology, Poznan University of Medical Sciences, 4The Broad Institute of Harvard and M.I.T.

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

حبيبات الإجهاد (سغس) هي الهياكل السيتوبلازمية غير الغشائية التي تشكل في الخلايا المعرضة لمجموعة متنوعة من الضغوط. سغس تحتوي على مرناس، والبروتينات ملزم رنا، الوحدات الفرعية الريباسي الصغيرة، العوامل المرتبطة الترجمة، والبروتينات خلية إشارة مختلفة. يصف هذا البروتوكول سير العمل الذي يستخدم العديد من النهج التجريبية للكشف عن، وتحديد، وتحديد الكميات سغس حسن النية .

الملخص

وغالبا ما تتحدى الخلايا التغيرات البيئية المفاجئة. حبيبات الإجهاد (سغس)، المجمعات ريبونوكلوبروتين السيتوبلازمية التي تشكل في الخلايا المعرضة لظروف الإجهاد، متورطة في جوانب مختلفة من استقلاب الخلية والبقاء على قيد الحياة. تقوم سغس بتعديل مسارات الإشارات الخلوية، التعبير الجيني بعد النسخي، وبرامج الاستجابة للإجهاد. تشكيل هذه الحبيبات التي تحتوي على مرنا يرتبط مباشرة إلى الترجمة الخلوية. يتم تشغيل الجمعية سغ من قبل بدء الترجمة المثبطة، ويتم تشجيع التفكيك سغ عن طريق تفعيل الترجمة أو عن طريق استطالة الترجمة المثبطة. ويبرز تكوين لجنة الدراسات هذه العلاقة. مكونات سغ الأساسية توقفت مجمعات ما قبل البدء في الترجمة، مرنا، والبروتينات ملزمة رنا مختارة (ربس). والغرض من الجمعية سغ هو الحفاظ على الطاقة الخلوية عن طريق عزل مرناس التدبير المنزلي المتوقفة ترانزلاتيونالي، مما يسمح للترجمة المحسنة للبروتينات تستجيب للضغط. في أديتيعلى المكونات الأساسية، مثل المجمعات الترجمة الأولية المتوقفة، سغس تحتوي على عدد كبير من البروتينات الأخرى وجزيئات الإشارة. العيوب في تشكيل سغ يمكن أن يضعف التكيف الخلوي إلى الإجهاد، وبالتالي يمكن أن تعزز موت الخلايا. وقد ربطت سغس والحبيبات التي تحتوي على الحمض النووي الريبي مماثلة لعدد من الأمراض البشرية، بما في ذلك الاضطرابات العصبية والسرطان، مما أدى إلى الاهتمام الأخير في تصنيف وتعريف الأنواع الفرعية الحبيبية الحمض النووي الريبي. يصف هذا البروتوكول فحوصات لتوصيف وتحديد سغس الثدييات.

المقدمة

الخلايا توظف العديد من الآليات للرد على الإجهاد. تحدث بعض الردود على مستوى ما بعد النسخي وتشمل تنظيم ترجمة مرنا و / أو الاستقرار 1 ، 2 . يرتبط ترانزلاتد مرنا اعتقال متعدية وتدهور مع تشكيل بؤر الخلوية غير الغشائية محددة، والأكثر تميزا كونها حبيبات الإجهاد (سغس) 3 . سغس هي البؤر السيتوبلازمية التي تركز ترانزلاتس نونترانزلاتينغ في ترانزلاتيونالي-القبض على خلايا الاستجابة للضغط (على سبيل المثال، الأكسدة، صدمة الحرارة، المغاعة المغذية، والعدوى الفيروسية) 4 . بالإضافة إلى مرناس نونترانزلاتينغ، سغس تحتوي على عوامل بدء الترجمة، والبروتينات ملزمة رنا، والبروتينات التشوير المختلفة 5 . سغس هي المؤشرات الحيوية لترجمة البروتين تحولت وتغيير الأيض رنا وتم ربطها إلى بقاء الخلية وموت الخلايا المبرمج، مسار إشارةs، والعمليات النووية 5 .

سغس هي الكيانات الحيوية، وتشكيلها يرتبط ارتباطا وثيقا بحالة الترجمة الخلوية 6 . على الرغم من مظهرها على ما يبدو الصلبة، معظم مكونات البروتين سغ المكوك بسرعة داخل وخارج، مع وقت الإقامة ثانية. في حين تستمر سغس لمدة دقائق إلى ساعات، معظم مكوناتها في التدفق السريع. تثبيط بدء الترجمة وما يترتب على ذلك من تفكيك بوليسوميس ترجمة تعزيز تشكيل لجان الدراسات؛ وبالتالي، سغس هي في حالة توازن مع ترجمة بوليسوميس. هذا التوازن بوليسوم / سغ هو المفتاح لتمييز سغس حسن النية من غيرها من بؤر التوتر الناجم 6 ، 7 .

ويستتبع توقيف بدء الترجمة تحويل مجمعات ما قبل الشروع في الترجمة المؤهلة التي تحتوي على مرنا، وعوامل بدء الترجمة (إيف)، و 40 S وحدات فرعية ريبوسومية س يسمى المجمعات 48S) في المجمعات المتوقفة ترانزلاتيونالي (ما يسمى 48S * المجمعات) التي يمكن أن تتجمع في سغس 4 ، 6 . يتم تشجيع سغس عن طريق الاعتقال متعدية في خطوتين مختلفتين المنبع من تشكيل 48S معقدة: التدخل مع وظائف مجمع EIF4F ملزمة ملزمة (على سبيل المثال، استهداف الوحدة الفرعية eIF4A) أو فسفرة من وحدة α من عامل بدء الترجمة eIF2، بوساطة واحدة أو أكثر من كيناسيس eIF2 الأربعة. وجود المجمعات 48S المتوقفة ( أي 40S الوحدات الفرعية الريباسي وعوامل بدء الترجمة المختارة) هي سمة من سغس 8 ، 9 .

وقد تم ربط سغس إلى حالات المرضية المختلفة، مثل العدوى الفيروسية، التنكس العصبي، المناعة الذاتية، والسرطان 3 ، 10 ، 11 ،سس = "كريف"> 12 ، 13 . وترتبط أشكال متغيرة من العديد من مكونات سغ مع الأمراض العصبية التناسلية (على سبيل المثال، التصلب الجانبي الضموري) التي الخلايا العصبية عرض الإدخالات المرضية داخل الخلايا التي قد تلعب أدوارا نشطة في وفاة الخلايا العصبية 13 . بعض الفيروسات خطف مكونات سغ لتمنع تشكيل سغ وتعزيز تكاثر الفيروس 14 . وتربط الدراسات الحديثة أيضا بين سغس والسرطان 15 وبقاء الخلايا السرطانية تحت العلاج الكيميائي والعلاج الإشعاعي 10 و 16 و 17 و 18 و 19 و 20 . في حين أن هذه النتائج قد أثارت اهتماما كبيرا في علم الأحياء سغ، العديد من التقارير المنشورة تفتقر إلى ضوابط هامة للتمييز بين تشكيل لجان الدراسات النية الحسنة من بؤر أخرى الناجم عن الإجهاد.

وقد وصفت سغس في البداية على أنها بؤر السيتوبلازمية غير الغشائية تتألف من البروتينات مرنا ملزم مختارة (ربس)، بما في ذلك مستضد الخلايا التائية الخلايا التائية 1 (تيا-1) والبولي ملزم A- البروتين (باب). عوامل بدء الترجمة؛ مرنا بوليادينيلاتد؛ ووحدات صغيرة ريبوسومية 4 ، 6 ، 21 ، 22 . تقليديا، وقد تم تحديد تكوينها من خلال تقنيات مثل إمونوستينينغ والتعبير خارج الرحم من البروتينات الموسومة فلورزنتلي 23 ، 24 . نظرا لطبيعة دينامية للغاية، و إمونولوكاليزاشيون من البروتينات سغ و / أو مرناس لا تزال منهجية تحديد للكشف عن سغس 23 ، 24 . حتى الآن، يتم وصف العديد من الممارسات التجارية التقييدية والبروتينات الأخرى (أكثر من 120 بروتينات متميزة) كمكونات سغ 11 . كما العديد من Sالبروتينات G محلية تغيير توطينها في كل من تعتمد على الإجهاد ومستقلة ويمكن أن تتراكم في مقصورات داخل الخلايا والبؤر الأخرى، فمن المهم اختيار علامات سغ الصحيح وتوظيف معايير وظيفية للتمييز سغس من أنواع أخرى من الإجهاد الناجم عن البؤر. تحتوي سغس حسن النية على مرنا، عوامل بدء الترجمة، وحدات فرعية ريبوسومية صغيرة وهي في توازن ديناميكي مع الترجمة.

تم تصميم هذا سير العمل البسيط لتحديد ما إذا كانت بؤر التوتر الناجم عن سغس حسن النية . ويشمل هذا العمل عدة نهج تجريبية باستخدام خلايا U2OS، والخلايا التي تستخدم عادة لدراسة لجان الدراسات. هذه الخلايا مثالية، كما أن لديها السيتوبلازم كبير، هي مسطحة نسبيا، ونعلق بقوة على كوفرسليبس الزجاج. أنواع الخلايا الأخرى يمكن استخدامها لدراسة سغس، ولكن من المهم أن ندرك أن الاختلافات في توقيت وتركيز الدواء، وفرة من البروتينات سغ نواة يمكن أن يغير حركية و كومبوsition. بالإضافة إلى ذلك، بعض الخلايا تستجيب لتثبيت بارافورمالدهيد من خلال تشكيل بقايا سطح الخلية، وإعطاء ثم مظهر تكدرت أن يسبب توطين منقط بعض علامات سغ. دون تحليل دقيق، وهذه يمكن أن تصنف على أنها سغس. وهذا يسلط الضوء على ضرورة تقييم جميع المعايير المطلوبة لتحديد البؤر التي يسببها التوتر كما سغس حسن النية . يستخدم فينورلبين (فرب)، والعلاج السرطان الذي يعزز سغس 20 ، فضلا عن أرسينايت الصوديوم (سا)، قوية ومميزة سغ محرض، كضغوط للتجارب في هذا البروتوكول.

سغس الكنسي تحتوي على علامات سغ متعددة (كل من البروتينات و مرناس) أن كولوكاليز في البؤر السيتوبلازم. يستخدم هذا البروتوكول على حد سواء المناعي والمضان في التهجين الموضعي (فيش) للكشف عن توطين علامات البروتين و مرنا بوليادينيلاتد 22 ، على التوالي. باختصار، المناعي غير المباشر يستخدم الأجسام المضادة ( ط.ه. الأجسام المضادة الأولية) محددة لبروتين معين للكشف عن ذلك داخل الخلية. ثم، الأجسام المضادة الثانوية (عادة الأنواع محددة) تعلق على فلوروكروميس التعرف على الأجسام المضادة الأولية وتكشف عن توطين البروتين المستهدف. يستخدم الفلورسنت المجهري للكشف عن إشارة مترجمة داخل الخلية. استخدام الأجسام المضادة المنتجة في أنواع مختلفة والكشف عنها مع الأجسام المضادة الثانوية الملونة بشكل مختلف يسمح للكشف عن كولوكاليزاتيون من الأجسام المضادة متعددة، مشيرا إلى أن أهداف البروتين وجدت في نفس الموقع 23 . من المهم تحديد علامات التي تم التحقق منها إلى كولوكاليز في سغس حسن النية .

يستخدم فيش مسبار المسمى أن قاعدة أزواج لتسلسل الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي محددة 25 . للكشف عن مرنا، يستخدم هذا البروتوكول قليل البيروكسيديز (دت) 40 التحقيق التي تهجين (أو قاعدة أزواج) إلى ذيل بوليا من مرنا ( أي بوليا فيSH). ثم يتم الكشف عن التحقيق البيروكسيديز باستخدام ستريبتافيدين مترافق فلورزنتلي، كما ستريبتافيدين لديه تقارب عالية لالبيوتين. عند تقييم سغس، من المهم للزوجين بوليا فيش مع المناعي الكشف عن علامة سغ، كما هو الحال في سغس حسن النية ، يجب أن إشارات اثنين كولوكاليز.

باستخدام هذا البروتوكول، يتم تقييم كولوكاليزاشيون بطرق متعددة. في صورة متعددة القنوات ( أي رغب: الأحمر والأخضر والأزرق)، سوف كولوكاليزاتيون تغيير لون إشارة متداخلة (على سبيل المثال كولوكاليزد الأحمر والأخضر تظهر الصفراء) 23 . بالإضافة إلى ذلك، يتم قياس كولوكاليزاتيون بيانيا باستخدام تحليل المسح خط، حيث يتم قياس كثافة كل لون عبر خط معين 8 ، 20 . يصف هذا البروتوكول خطين إجراءات تحليل المسح الضوئي باستخدام إيماجيج 26 . إجراء واحد هو دليل ويذهب من خلال العملية برمتها، ويلو الآخر يستخدم ماكرو، أو برنامج بسيط أن أتمتة الخطوات اليدوية. من المهم أن تذهب من خلال البرنامج اليدوي لفهم الإجراء الكلي.

سغس تشكل في الخلايا حيث يتم قمع الترجمة؛ وبالتالي، يجب أن الخلايا مع سغس عرض مستويات منخفضة من الترجمة العالمية مقارنة مع الخلايا غير المعالجة. تجريبيا، يتم استخدام ريبوبوروميسلاتيون. ويضاف بوروميسين و إميتين إلى خلايا لفترة قصيرة قبل التثبيت، والسماح لل بوروميسين لدمج في بولي ببتيدس تشكيل بنشاط، مما تسبب في إنهاء 27 ، 28 . العلاج مع إميتين مطلوب لمنع إعادة بدء 29 . يمكن بعد ذلك الكشف عن بوروميسين باستخدام الأجسام المضادة لمكافحة بوروميسين، وإعطاء لقطة من الترجمة النشطة. يستخدم هذا الأسلوب لأنه سريع، لا يتطلب ما قبل الجوع مع وسط تفتقر إلى حمض أميني معين (ويحتمل أن تكون مسبقة الخلايا)، ويكشف عنالتوطين تحت الخلوية للترجمة البروتين. وقد استخدمت طرق أخرى، لا سيما باستخدام النظير الأحماض الأمينية المعدلة، مثل الميثيونين التناظرية L-أزيدوهوموالين (أها)، إلى جانب "كليك-إيت" الكيمياء 30 ، لإظهار أن الخلايا التي تحتوي على سغس تظهر ترجمة أقل بكثير من الخلايا المجاورة 31 . ومع ذلك، يتطلب هذا الأسلوب جوعا ميثيونين تليها النبض العلامات لمدة 15-30 دقيقة. يشكل المجاعة ميثيونين ضغوطا إضافية، في حين أن الوقت الطويل وضع العلامات ( أي 15-30 دقيقة) يؤدي إلى قياس الترجمة التراكمية بدلا من الترجمة الجارية ويسمح أيضا البروتينات حديثا توليفها للانتقال من موقع تخليق إلى وجهتهم النهائية داخل خلية - زنزانة. في المقابل، ريبوبوروميسيلاتيون هو أسرع بكثير ومتوافق مع أي وسيلة، مثل المتوسطة الخالية من الجلوكوز المستخدمة للحث على سغس عن طريق المجاعة الجلوكوز.

سغس الكنسي هي في التوازن الديناميكيمع ترجمة نشطة بوليسوميس. ويمكن تقييم هذا تجريبيا من خلال علاج العينات مع الأدوية التي استقرار أو زعزعة بوليسوميس، وبالتالي تحريك التوازن بين سغس و بوليسوميس 23 . سيكلوهكسيميد (أو إميتين، الذي يتصرف على نحو مماثل) كتل استطالة عن طريق "تجميد" ريبوسوم على مرنا، وبالتالي تقليل مجموعة من مرنبس غير بوليسومال قادرة على تشكيل سغس. من الناحية التجريبية، يمكن استخدام ذلك بطريقتين: عن طريق إضافة سيكلوهيكسيميد (أو إميتين) قبل الإجهاد لمنع تشكيل سغ أو بإضافة سيكلوهيكسيميد (أو إميتين) بعد تشكيل سغس، حتى من دون إزالة عامل تشديد، مما تسبب في تفكيك سغ، كما توقف يتم إدخال مجمعات برينيتياتيون ببطء في جزء بوليسوم. في المقابل، بوروميسين يسبب إنهاء سابق لأوانه ويعزز التفكيك بوليسوم، وزيادة مجموعة من مرناس بدء قادرة على تجميع في سغس. من الناحية التجريبية، والعلاج بوروميسين يزيد من عدد سغس أو يخفض ثريشولد التي تشكل في استجابة للضغط متدرج أو جرعة الدواء. عند تقييم تأثير البوروميسين، فمن المهم استخدام مستوى دون الحد الأقصى للدواء من الفائدة، كما من المتوقع بوروميسين لزيادة تأثير الدواء وزيادة النسبة المئوية للخلايا عرض سغس - وهذا لا يمكن أن يحدث إذا كان الدواء / الإجهاد يسبب سغس في 100٪ من الخلايا في البداية. هذا يتناقض مع العلاج سيكلوهكسيميد، الذي يفكك سغس ويعمل بشكل أفضل عندما ~ 95٪ من الخلايا في البداية عرض سغس بحيث يمكن ملاحظة أكبر انخفاض ممكن وكمية بدقة.

يوفر هذا البروتوكول إطارا لدراسة سغس في خلايا الثدييات. وتشمل الطرق: (1) تلطيخ إمونوفلورزنت وتحليل إيماجيج لتقييم كولوكاليزاتيون الكلاسيكية سغ المرتبطة علامات eIF4G، eIF3b، و راس غتباز تفعيل البروتين ملزمة البروتين 1 (G3BP1) في سغس المفترضة. (2) أوليغو (دت) مضان في الموقع التهجين (بوليا فيش) للكشف عن مرنا بوليادنيلاتد. (3) سيكلوهيكسيميد والعلاج بوروميسين لتحديد ما إذا كان البؤر الناجم عن التوتر في التوازن الديناميكي مع بوليسوميس. و (4) ريبوبوروميلاتيون لتقييم الوضع متعدية من الخلايا التي تحتوي على سغس المفترض. معا، يمكن لهذه المقايسات تحديد ما إذا كان يمكن أن تصنف بؤر التوتر الناجم عن سغس حسن النية .

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إعداد الخلية

  1. إضافة كوفرسليبس تعقيمها إلى 12 بئرا من لوحة 24 جيدا، كما هو مبين في الشكل 1A . وهذا يمكن القيام به باستخدام ماصة باستير العقيمة تعلق على فراغ لالتقاط كل ساترة. اضغط بلطف ساترة على جانب البئر للافراج عن شفط، والسماح ساترة الوقوع في البئر.
  2. لوحة 1 × 10 5 U-2 أوس (U2OS) الخلايا العظمية لكل بئر في الحجم النهائي من 500 ميكرولتر من المتوسط. نقل الجانب لوحة إلى الجانب وصعودا وهبوطا عدة مرات للتأكد من أن الخلايا موزعة بالتساوي.
  3. اضغط بلطف كوفرسليبس أسفل مع طرف P1000 نظيفة لضمان أن ساترة هو في الجزء السفلي من البئر وأنه لا توجد فقاعات تحت ساترة.

2. تشديد الخلايا

  1. في اليوم التالي، والتحقق بصريا لوحة لضمان أن الخلايا موزعة بالتساوي ومتوازنة بالتساوي عبر ساترة، كما الاختلافات بين ساقد تؤثر على التأثيرات السلبية سلبا على استنساخ النتائج. استخدام هدف 10X على مقلوب ثقافة الأنسجة المجهر.
  2. سخن المتوسطة إلى 37 درجة مئوية. تجنب استخدام وسائل الإعلام الباردة أو الساخنة إلى الخلايا، وهذه تسبب صدمة باردة أو صدمة الحرارة، على التوالي.
  3. تمييع المخدرات في وسائل الإعلام مسخن. لكل تركيز الدواء المختلفة، وإعداد 2 الآبار التي تحتوي على 500 ميكرولتر من المتوسط. إعداد 500 ميكرولتر إضافية للسماح للخسارة في حين بيبتينغ. قسامة 4 أنابيب، تحتوي كل منها 1.5 مل.
    1. لزرنيخ الصوديوم: إلى كل بئر تحتوي على 500 ميكرولتر، إضافة 1.5 ميكرولتر من 100 ملم زرنيخ الصوديوم (التركيز النهائي: 100 ميكرومتر) أو إضافة 0.75 ميكرولتر من 100 ملي زرنيت الصوديوم (التركيز النهائي: 50 ميكرومتر).
    2. ل فينورلبين: لكل بئر تحتوي على 500 ميكرولتر، إضافة 22.5 ميكرولتر من 10 ملم فينورلبين (التركيز النهائي: 150 ميكرومتر) أو إضافة 18.75 ميكرولتر من 10 ملم فينورلبين (التركيز النهائي: 100 ميكرومتر).
      ملاحظة: زرنيخ الصوديوم هو جيدا-- تتميز وتستخدم عادة الإجهاد الحبيبية المحرض، وبالتالي تستخدم بشكل كلاسيكي باعتبارها السيطرة الإيجابية.
  4. إزالة وتجاهل وسائل الإعلام من الآبار B1 - 4 و C1 - 4. إضافة وسائل الإعلام مع الأدوية والانتظار لمدة 60 دقيقة (الشكل 1A).
    1. إضافة 500 ميكرولتر من المتوسطة مع 100 ميكرومتر الزرنيخ الصوديوم لآبار B1 و B2. إضافة 500 ميكرولتر من المتوسط ​​مع 50 ميكرومتر الزرنيخ الصوديوم لآبار B3 و B4.
    2. إضافة 500 ميكرولتر من المتوسطة مع 150 ميكرومتر فينورلبين لآبار C1 و C2. إضافة 500 ميكرولتر من المتوسط ​​مع 125 ميكرومتر فينورلبين لآبار C3 و C4.
  5. 30 دقيقة قبل التثبيت، وعلاج الآبار في العمود 2 مع 5 ميكرولتر من سيكلوهكسيميد (1 ملغ / مل الأسهم) والآبار في العمود 4 مع 2 ميكرولتر من البوروميسين (1.25 ملغ / مل الأسهم). بلطف الصخرة لوحة لخلط قبل وضع لوحة مرة أخرى في حاضنة 37 درجة مئوية.

3. تثبيت الخلية ومناعي

نت "> قبل التجربة، تأكد من تبريد الميثانول إلى -20 درجة مئوية، وجعل المخازن المؤقتة، بما في ذلك الفوسفات مخزنة المالحة (بس)، 5٪ مصل الحصان العادي (نهس) في برنامج تلفزيوني، و بارافورمالدهيد 4٪ (بفا ) في برنامج تلفزيوني.

  1. تجاهل وسائل الإعلام وغسل الآبار التي تحتوي على كوفرسليبس مع برنامج تلفزيوني. اعتمادا على الأدوية المستخدمة، قد يكون من المهم التخلص بشكل صحيح من الأدوية التي تحتوي على المخدرات. اتصل بمكتب السلامة البيئية المحلي للحصول على تعليمات محددة. لغسل بكفاءة، وملء زجاجة الضغط مع برنامج تلفزيوني، وقطع الظهر غيض من أجل السماح لتدفق لطيف بدلا من تيار ضيق، واستخدام هذا لإضافة برنامج تلفزيوني إلى كل بئر بعد الشفط برنامج تلفزيوني الأصلي.
  2. إصلاح الخلايا باستخدام ~ 250 ميكرولتر من 4٪ بفا لمدة 15 دقيقة في رت تحت الإثارة لطيف. تغطية تماما الجزء العلوي من ساترة مع بفا. 250 ميكرولتر يجب أن تكون كافية، ولكن إذا لم يكن كذلك، إضافة أكثر من ذلك. تجنب دائما بيبتينغ مباشرة على كوفرسليبس، وبعض الخلايا (أو علاجات الإجهاد من الخلايا) يمكن تغيير المرفق، و tوقال انه قوة من بيبتينغ يمكن طرد الخلايا.
  3. إزالة بفا وتجاهل بشكل صحيح. اتصل بمكتب السلامة البيئية المحلي للحصول على تفاصيل حول كيفية التخلص بشكل صحيح من بارافورمالدهيد.
  4. إضافة ~ 250 ميكرولتر من الميثانول (-20 درجة مئوية) واحتضان لمدة 5 دقائق في رت تحت هزاز لطيف، هذا على حد سواء بيرمابيليزس ويسطح الخلايا.
  5. إزالة وتجاهل الميثانول ومنع الخلايا عن طريق تطبيق ~ 250 ميكرولتر من 5٪ نهس لمدة 1 ساعة في رت O / N عند 4 درجات مئوية. اتصل بمكتب السلامة البيئية المحلي للحصول على تفاصيل حول كيفية التخلص من الميثانول بشكل صحيح.
  6. للأجسام المضادة الأولية، وتمييع الأجسام المضادة في 5٪ نهس.
    ملاحظة: استخدام علامات سغ متعددة هو المفتاح للتأكد مما إذا كانت الحبيبات لاحظ هي سغس حسن النية . عدد علامات سغ التي يمكن استخدامها يعتمد على المرشحات المتاحة في المجهر. في حالة توفر مجموعات مرشح خضراء وأحمر وبعيدة حمراء، استخدم G3BP1 و eIF4G و eIF3b عند تخفيف 1/250.
    1. لهذه التجربة (12 كوفرسليبس في 250 ميكرولتر لكل توتال: 3 مل من 5٪ نهس)، إضافة 12 ميكرولتر من كل مما يلي: مكافحة G3BP1، ومكافحة eIF3b، ومكافحة eIF4G. احتضان الأجسام المضادة الأولية باستخدام التحريض لطيف لمدة 1 ساعة على الأقل في رت أو O / N عند 4 درجات مئوية.
  7. غسل الآبار 3X مع برنامج تلفزيوني، واحتضان كل غسل لمدة 5 دقائق.
  8. للأجسام المضادة الثانوية، وتمييع جميع الأجسام المضادة الثانوية (1/250 التخفيف) وصبغ هويشت (1 / 1،000 التخفيف) في 5٪ نهس.
    1. لهذه التجربة (12 كوفرسليبس في 250 ميكرولتر لكل توتال: 3 مل من 5٪ نهس)، إضافة 12 ميكرولتر من كل مما يلي: Cy2 ماوس، Cy3 الأرنب، و Cy5 الماعز (تخفيف 1/250 من كل ) وإضافة 3 ميكرولتر من هويشت صبغ.
    2. احتضان كوفرسليبس مع الأجسام المضادة الثانوية لمدة 1 ساعة في رت. خلال هذا والخطوات التالية، وحماية العينات من الضوء من خلال تغطية لوحة مع مربع أو عن طريق وضع احباط على الجزء العلوي من طبق زراعة الأنسجة.
  9. غسل نحنيس ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منهما.
  10. جبل كوفرسليبس على الشرائح الزجاج المسمى باستخدام تصاعد المتوسطة. تسخين وسط تصاعد في كتلة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. وهذا يقلل من اللزوجة ويجعل من السهل ماصة. مع قطع طرف P200، ماصة 25 ميكرولتر من تصاعد المتوسطة لكل ساترة على شريحة زجاجية. 4-8 كوفرسليبس يمكن أن يصلح على شريحة زجاجية واحدة، على افتراض أن مرحلة المجهر يسمح هذا. باستخدام ملقط غرامة، ونقل ساترة من البئر إلى الشريحة، والتأكد من وضع الجانب الخلية لأسفل على وسط تصاعد. باستخدام طرف P200 نظيفة، اضغط على ساترة أسفل.
  11. مرة واحدة وقد تم تركيب جميع كوفرسليبس، استخدام الأنسجة المخملية مطوية لتنظيف زيادة تصاعد المتوسطة عن طريق الضغط على الأنسجة المختبرية بقوة بقوة على الشريحة. استخدام زجاجة ضغط تحتوي على H 2 O لطرد قبالة متزايدة تصاعد المتوسطة ثم كرر النشاف مع الأنسجة المخملية مطوية لإزالة الماء.

4. فلورزنس في الموقع </ إم> التهجين (فيش)

  1. لوحة وعلاج الخلايا، وذلك باستخدام الخطوات 1 و 2.1-4 كدليل؛ فمن الضروري فقط لوحة الخلايا في العمود 1، كما هو مطلوب فقط 3 كوفرسليبس في التجربة التالية.
  2. تأكد من إعداد جميع المخازن المؤقتة ( أي 4٪ بفا في برنامج تلفزيوني، و 70٪ من الإيثانول في الماء، 2X المالحة الصوديوم سيترات (سك)، و 5٪ نهس)، أن يتم تبريد الميثانول إلى -20 درجة مئوية، يتم تسخين الفرن التهجين تصل إلى درجة الحرارة المناسبة.
  3. تنفيذ الخطوات 3.1-3.3 لغسل وإصلاح الخلايا.
  4. بيرمابيليز الخلايا عن طريق إضافة -20 درجة مئوية الميثانول لمدة 10 دقيقة.
  5. إزالة الميثانول واحتضان كوفرسليبس في الايثانول 70٪. وضع لوحة في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. ختم لوحة باستخدام بارافيلم لمنع التبخر.
  6. في اليوم التالي، وإزالة الإيثانول وترطيب الخلايا عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من سك 2X. احتضان كوفرسليبس لمدة 5 دقائق مع التحريض لطيف في رت.
  7. إزالة 2X سك وإضافة 500ميكرولتر من 2X سك. احتضان لمدة 5 دقائق تحت الإثارة لطيف.
  8. وضع قطعة من شقة بارافيلم على الجزء السفلي من الفرن التهجين. ماصة 25 ميكرولتر من العازلة التهجين على بارافيلم لكل ساترة. إزالة ساترة من طبق 24-جيدا (في هذه المرحلة، كوفرسليبس هي من جانب الخلية حتى) ووضع ساترة جانب الخلية أسفل على المخزن المؤقت التهجين. القيام بذلك في 42 درجة مئوية أو اختياريا عند 65 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
    ملاحظة: إكمال هذه الخطوة عند 65 درجة مئوية سوف ينكر رنا الخلوية. وهذا يمكن تحسين إشارة إذا كان ملثمين بوليا من التفاعلات مع البروتينات.
  9. تمييع البيوتين-أوليغو (دت) التحقيق (100 نانوغرام / ميكرولتر) في العازلة التهجين لتركيز 2 نانوغرام / ميكرولتر. 25 ميكرولتر لكل ساترة كافية.
  10. لكل ساترة، ماصة 25 ميكرولتر من العازلة التهجين التي تحتوي على البيوتين أوليغو (دت) على بارافيلم. التقاط ساترة مع ملقط وتلمس بلطف حافة ساترة على الأنسجة المختبر لإزالة الزائدةالتهجين العازلة. نقل ساترة إلى المخزن المؤقت التهجين مع البيوتين أوليغو (دت). تذكر للحفاظ على الجانب الخلية إلى أسفل.
  11. وضع كوفرسليبس في مربع التهجين للحد من التبخر. احتضان كوفرسليبس مع البيوتين أوليغو (دت) في العازلة التهجين لمدة 60 دقيقة في 42 درجة مئوية.
  12. ضع 2X سك في الفرن التهجين للسماح لها أن يتوازن إلى 42 درجة مئوية.
  13. إضافة ~ 500 ميكرولتر من 2X سك تحسنت إلى الآبار في طبق 24-جيدا واستخدام ملقط لنقل كوفرسليبس إلى البئر. احتضان لمدة 10 دقيقة.
  14. كرر خطوة غسل أعلاه مرتين في 42 درجة مئوية ثم مرتين في رت.
  15. الخطوات الكاملة 3.5-3.10، والتأكد من استخدام ستريبتافيدين فلوريكروم للكشف عن البيوتين أوليغو (دت) بدلا من الأجسام المضادة التقليدية واحد.

5. ريبوبوروميسلاتيون فحص لتقييم الوضع متعدية

  1. الخلايا U2OS لوحة على كوفرسليبس، كما هو مبين في الخطوة 1، ولكن لوحة فقط ساترة واحدة لكل حالة (في هذاحالة، 3 كوفرسليبس: غير المعالجة، 100 ميكرومتر أرسنيت الصوديوم، و 150 ميكرومتر فينورلبين) ( الشكل 1 A).
  2. خلايا الإجهاد باستخدام بروتوكول في الخطوة 2، واستكمال الخطوات 2.1-2.4.
  3. 5 دقائق قبل التثبيت، إضافة 2 ميكرولتر من البوروميسين (الأوراق المالية: 1.25 ملغ / مل، تمييع 2 ميكرولتر في 500 ميكرولتر للحصول على تركيز بوروميسين النهائي من 5 ميكروغرام / مل) و 2.9 ميكرولتر من إميتين (الأسهم: 20 ميكروغرام / مل، 2.9 ميكرولتر إلى نفس الحل تحتوي بالفعل على بوروميسين) إلى كل جيدا تحتوي على 0.5 مل.
  4. الخطوات الكاملة 3.1-3.10 كما هو مبين أعلاه، وذلك باستخدام الأجسام المضادة لمكافحة بوروميسين (1/1000 التخفيف) للكشف عن بوروميسين. من الناحية المثالية، استخدم اثنين من علامات سغ أخرى في القنوات المتبقية.
  5. عند قياس إشارة بوروميسين، واتخاذ جميع الصور باستخدام نفس التعرض. اختيار هذا التعرض باستخدام ألمع (غير مضغوط) عينة وأخذ صورة كما مشرق ممكن دون التشبع.
    ملاحظة: شدة المضادة لل بوروميسين إشارة الفلورسنت ريبرزالترجمة المستمرة، كما بدائل بوروميسين للأحماض الأمينية، ويدمج في البروتين الوليد، ويفرض إنهاء سابق لأوانه من البروتين.

6. صورة الاستحواذ والتحليل

  1. تحديد حبيبات الإجهاد
    1. لتحديد سغس، والحصول على 3 - 5 صور مجموعها> 100 خلية لكل عينة باستخدام هدف 40X. بدلا من ذلك، الحصول على الصور باستخدام أهداف أخرى، ولكن تأكد من أن> 100 خلايا تحسب في ساترة وأن التكبير كبير بما فيه الكفاية لتصور بوضوح الحبيبات. القيام بذلك عن طريق قسمة ساترة في خمس مناطق متساوية تقريبا واختيار عشوائيا حقل من كل منطقة ( الشكل 1B ). يجب أن تتضمن صور المجال نفسه جميع القنوات لتقييم استقطاب العلامات.
    2. بمجرد الحصول على جميع الصور، دمج القنوات. بعض برامج الكاميرا سوف تفعل ذلك تلقائيا، في حين أن البعض الآخر يتطلب دمج يدوي. وهذا يمكن القيام به معإيماجيج عن طريق فتح جميع الصور ومن ثم تحديد [إيماج | اللون | دمج القنوات].
    3. يدويا عد العدد الإجمالي للخلايا عن طريق عد عدد من نوى، وذلك باستخدام هويشت كما نواة علامة. عد عدد الخلايا التي تحتوي على أكثر من سغس لكل خلية يدويا.
      ملاحظة: على سبيل المثال، باستخدام صورة ثلاث قنوات مدمجة تعرض G3BP1 (أخضر)، eIF4G (أحمر)، و هوشست (الأزرق)، عد النوى (أو عدد الخلايا) باستخدام القناة الزرقاء. ثم، عد الخلايا سغ إيجابية مثل تلك مع اثنين أو أكثر من بؤر صفراء في الخلية. سوف تظهر حبيبات الصفراء، والأخضر من G3BP1 والأحمر من eIF4G تظهر الأصفر إذا كولوكاليزد.
    4. تحديد النسبة المئوية للخلايا التي هي سغ إيجابية من خلال الجمع بين البيانات من 3-5 مناطق مستقلة ومن ثم حساب:
      عدد سغ إيجابية / عدد من نويات) * 100 = في المئة من الخلايا سغ إيجابية
  2. تقييم كولوكاليزاتيون من قبل تحليل خط المسح الضوئي - الطريقة اليدوية
    1. فتحيماغيج. تنزيل البرنامج مجانا من ()
    2. افتح مدير عائد الاستثمار: [أنليز | أدوات | مدير عائد الاستثمار ...].
    3. افتح الصورة المدمجة في إيماجيج: [ملف | فتح].
    4. باستخدام أداة الخط الموجودة في شريط الأدوات إيماجيج، إضافة سطر الذي يمر عبر سغ، والتأكد من تضمين قبل وبعد سغ. أضف هذا السطر إلى مدير عائد الاستثمار من خلال النقر على [إضافة] في نافذة مدير عائد الاستثمار.
    5. تقسيم الصورة المدمجة إلى قنوات منفصلة لتقييم توطين كل علامة إلى الحبيبية: [إيماج | اللون | سبليت تشانل]؛ سيؤدي هذا إلى تقسيم الصورة المدمجة إلى ثلاث صور بالأسود والأبيض.
    6. في الصورة بالأسود والأبيض، تأكد من تحديد الخط؛ يتم تحديد الخط إذا ظهر في الصورة. إن لم يكن، في نافذة مدير العائد على الاستثمار، انقر على الخط في لوحة. وهذا سوف تسليط الضوء على خط باللون الأزرق في نافذة مدير العائد على الاستثمار، وسوف تجعل خط مرئية على الصورة بالأسود والأبيض. إذا كان الخط لا يزال لا يظهر، تأكد من أن "إظهار الكل" هو تشفي مدير عائد الاستثمار ثم انقر على السطر الموجود في الصورة.
    7. تحليل شدة الخط: [تحليل | ملف المؤامرة]؛ وهذا سوف تبرز نافذة "المؤامرة الملف الشخصي"، الذي يرسم شدة الإشارة عبر الخط.
    8. ضمن نافذة "مؤامرة الملف الشخصي"، انقر على [قائمة]، التي تعرض نافذة تحتوي على البيانات الأولية من الرسم البياني. انسخ جميع البيانات في هذه النافذة والصقه في ملف جدول بيانات. للقيام بذلك، حدد كافة البيانات في النافذة: [إديت | اختر الكل]. انسخ التاريخ: [إديت | نسخ]. افتح ملف جدول بيانات والصق البيانات: [إديت | معجون].
    9. الخطوات الكاملة 6.2.6 - 6.2.8 لكل قناة على حدة. تأكد من تتبع القناة التي يتم تقييمها.
    10. في جدول بيانات، أنشئ رسم بياني خطي للنتائج. حدد الأعمدة التي تتضمن البيانات عن طريق الضغط على [كونترول] والنقر فوق الحرف الموجود أعلى كل عمود. ثم حدد الرسم البياني الخطي: [إنزيرت | خط الرسم البياني].
    11. كرر هذا التحليل لعدةإيبل حبيبات الإجهاد عبر تجارب مستقلة متعددة.
  3. تقييم كولوكاليزاتيون من قبل تحليل خط المسح الضوئي - إيماجيج البرنامج المساعد
    1. تحميل وتثبيت أداة الملف الشخصي رغب من موقع إيماجيج (https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt)؛ عند تثبيته بشكل صحيح، يجب أن يظهر رمز حمراء وأخضر وأزرق (رغب) في شريط الأدوات.
    2. فتح الصورة (على سبيل المثال، تيف، جبغ) في إيماجيج: [ملف | فتح].
    3. انقر على رمز رغب الموجود في شريط أدوات إيماجيج.
    4. انقر واسحب لإضافة سطر يمتد من خلال سغ، والتأكد من أن تشمل المناطق المجاورة؛ ستظهر صورة الرسم البياني في نافذة منبثقة.
    5. حفظ البيانات كصورة: [ملف | حفظ باسم | شجار]. بدلا من ذلك، تصدير ثم الرسم البياني البيانات في برنامج رسوم بيانية آخر باستخدام الخطوة 6.2.8 من أعلاه.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

البؤر الناجم عن الإجهاد ليست بالضرورة سغس. وتصنف سغس على أنها بؤر السيتوبلازمية التي تحتوي على مرناس، عوامل بدء الترجمة، والبروتينات ملزمة رنا وتكون في حالة توازن مع الترجمة النشطة. يمكن استخدام البروتوكول أعلاه كقالب لتوصيف ما إذا كان الإجهاد معين يدفع سغس حسن النية .

سغس كولوكاليز مع غيرها من علامات سغ المعروفة، بما في ذلك كل من البروتين...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

كما يتضح من الدراسات المناعية في أمراض متعددة، والإجهاد المزمن يؤدي إلى تشكيل بؤر الخلايا المختلفة. على سبيل المثال، وتتميز معظم الأمراض العصبية من المجاميع داخل الخلايا من البروتينات غير قابلة للذوبان. وجود البروتينات المرتبطة سغ في مثل هذه المجاميع غالبا ما يكون الأساس لاستنتاج أن هذه البؤر هي سغس. يتم استخلاص استنتاج مماثل أيضا عند ملاحظة سغ بؤر سيتوبلازمية إيجابية في خلايا تعامل مع محفزات الإجهاد الجديدة. يوفر هذا البروتوكول سير عمل بسيط لتحديد سغس حسن النية .

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

ونشكر أعضاء مختبري إيفانوف وأندرسون على مناقشاتهما المفيدة وردود الفعل بشأن هذه المخطوطة. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة [GM111700 و CA168872 إلى السلطة الفلسطينية، NS094918 إلى بي]، والمركز الوطني للعلوم في بولندا [منحة أومو 2012/06 / M / NZ3 / 00054 إلى وس]. كما تعترف وزارة الصحة والتعليم العالي في بولندا (برنامج موبيليتي بلس) ولجنة فولبرايت البولندية الأمريكية لدعمهم المالي لبحوثه في الولايات المتحدة الأمريكية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
U-2 OSATCCATCC ® HTB-96 ™الكتابة بشكل شائع "U2OS"
الثقافة عند 37 درجة ؛ C أقل من 5٪ CO2< / sub> في 10٪ FBS / DMEM
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)Corning10-013-CVيحتوي على 4.5 جم / لتر من الجلوكوز والبيروفات والفينول الأحمر
مكمل بنسبة 10٪ FBS و 10 ملي مولار HEPES والبنسلين / ستيبتومايسين
مخفف أدوية سابقة
التدفئة مصل الأبقار الجنينية (FBS)SigmaF2442-500mlيستخدم لتكملة الوسائط
HEPES (1 م)ثيرمو فيشر Scientific15630-080يستخدم لتكملة وسائط
البنسيلين ستربتومايسينسيجماP0781-100mlيستخدم لتكملة الوسائط
24 بئر صفيحةكوستار3524
مناديل المختبر (كيمويبيس)KIMTECH SCIENCE34120
غطاء زجاجي لغطاء النمونظارات فيشر Scientific12-545-82تعقيم قبل الاستخدام
الحفاظ على معقمة في غطاء زراعة الأنسجة
الصوديوم (ميتا) زرنيخيت & ge ؛ 90٪ (SA)SigmaS7400-100Gتذوب في الماء بتركيز 1 متر ، ثم تخفف إلى 100 ميكرو ؛ M كمخزون عامل
Vinorelbine (VRB)TSZ CHEMRS055يذوب في الماء إلى 10 ملي مولار
بوروميسينسيجماP9620يستخدم لتقييم مستوى الترجمة (الريبوبوروميسيلأيشن)
- يستخدم لتقييم اتصال SG بالترجمة النشطة
تمييع في الماء إلى 10 مجم / مل
إيميتين ثنائي هيدروكلوريد هيدراتسيجماE2375تستخدم بالاشتراك مع بورومايسين لتقييم مستوى الترجمة العام
تستخدم لتقييم اتصال SG بالترجمة النشطة
- تمييع في الماء إلى 10 مجم / مل
Cycloheximide (CHX)SigmaC4859تستخدم لتقييم اتصال SG بالترجمة النشطة
تمييع في الماء إلى 10 مجم / مل
من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) Lonza/ VWR95042-486مؤقت للغسيل للتألق
المناعيدرجة كاشف بارافورمالدهايد ، بلورية (PFA)SigmaP6148-500Gاصنع محلولا بنسبة 4٪ في PBS الساخن في غطاء الدخان ، وحرك حتى يذوب
يمكن تخزين Aliquots عند -20 درجة ؛ C لعدة أشهر
خطير ، استخدم التهوية
تخلص من الميثانول في النفايات الخاصة
، ACSBDH / VWRBDH1135-4LPPrechill إلى -20 & deg ؛ C قبل الاستخدام
تخلص من النفايات الخاصة
مصل الحصان العادي (NHS)Thermo Fisher Scientific31874تمييع إلى 5٪ في PBS
أضف أزيد الصوديوم للتخزين عند 4 درجات ؛ C
محلول حجب للإيثانول المناعي
، نقي ، 200 دليل (100٪) ، USP ، KOPTECDecon Labs /VWR 89125-188تمييع إلى 70٪ بالماء
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope SlidesFisherbrand12-550-15
ماوس مضاد للجسم المضاد G3BP1 (TT-Y) سانتاكروزsc-81940يخزن في 4 درجات ؛ C
1/100 أرنب مخفف
مضاد للجسم المضاد eIF4G (H-300) سانتاكروزsc-11373تخزين في 4 درجات ؛ C
1/250 تخفيف
الماعز المضادة ل eIF3 & eta; (N-20) الجسم المضادسانتا كروزsc-16377eIF3 & eta ؛ يعرف أيضا باسم eIF3b
Store في 4 درجات ؛ C
1/250 فأر مخفف
مضاد للجسم المضاد للبورومايسين 12D10MilliporeMABE343يخزن في 4 درجات ؛ C
1 / 1,000 تخفيف
Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H + L)Jackson Immunoresearch715-225-150إعادة التكوين في الماء لكل مصنع ثم يتم تخزينها في درجة حرارة 4 درجات ؛ C
1/250 التخفيف
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H + L) JacksonImmunoresearch711-165-152إعادة التكوين في الماء حسب الشركة المصنعة ثم يتم تخزينها في 4 درجات ؛ C
1 / 2،500 تخفيف
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H + L)Jackson Immunoresearch705-175-147إعادة التكوين في الماء حسب الشركة المصنعة ثم يتم تخزينها في 4 درجات ؛ C
1/250 تخفيف
Hoechst 33258 محلولSigma94403-1MLاحتضان مع الأجسام المضادة الثانوية
محلول مخزون 0.5 مجم / مل في dH 20 ، حماية من الضوء
- تخزين في 4 درجات ؛ C
Cy3 StreptavidinJackson Immunoresearch016-160-084إعادة التكوين في الماء لكل مصنع تعليمات S ، ثم تخزينها في 4 درجات ؛ C
1/250 تخفيف
oligo- (dT) 40x< / sub> مسبار بيوتينيل بيوتينيلتقنيات الحمض النووي المتكاملة (IDT)/إعادة التكوين في الماء إلى 100 نانوغرام / مل ، aliquot وتخزينها عند -20 & درجة ؛ C
تمييع في المخزن المؤقت للتهجين 1/50 قبل الاستخدام
صندوق تهجينللطلب //اصنع غرفة رطوبة مع أي صندوق منزلق تخزين عن طريق إضافة ورق مرطب في الجزء السفلي
- قم بتسخين الصندوق مسبقا قبل الاستخدام
20x SSC عازلةThermo fisher AmbionAM9763تمييع إلى 2x SSC باستخدام RNase Free water (معالج DEPC)
يخزن في RT
مخزن الغسيل المؤقت للأسماك
PerfectHybPlus Hybridization BufferSigmaH7033-50mlمخزن مؤقت لحضانة
الشرائحمحلي/مزيج 5 جم من " قابل للذوبان في البارد" بولي (كحول الفينيل) في 20 مل من PBS
تخلط عن طريق الصوتنة ، متبوعا بتقليب O / N في RT
أضف 5 مل من الجلسرين و 0.2 مل من أزيد الصوديوم 20٪ ، ويقلب لمدة 16 ساعة في RT
الطرد المركزي عند 20،000 جم لمدة 20 دقيقة ، وتخلص من سائل اللزج الحبيبات الكبيرة
Aliquot ، تخزين طويل الأجل عند -20 درجة ؛ C ، 1 أسبوع عند 4 درجة ؛ C
Parafilm "M"SigmaP7793-1EA
Poly (كحول الفينيل) كاشفSigmaP-8136-250Gلصنع كاشف فينول
جلسرينسيجماG5516-100MLلصنع كاشف
الصوديومأزيد فيشر ScientificS2002-5Gعامل حافظة لحجب المحلول و vinol
قم بعمل تخفيف بنسبة 20٪ في الماء
مخزن مخصص FISH الصنع فينول

المراجع

  1. Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
  2. Yamasaki, S., Anderson, P. Reprogramming mRNA translation during stress. Curr Opin Cell Biol. 20 (2), 222-226 (2008).
  3. Buchan, J. R. mRNP granules: Assembly, function, and connections with disease. RNA Biol. 11 (8), (2014).
  4. Kedersha, N., et al. Evidence that ternary complex (eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-deficient preinitiation complexes are core constituents of mammalian stress granules. Mol Biol Cell. 13 (1), 195-210 (2002).
  5. Kedersha, N., Ivanov, P., Anderson, P. Stress granules and cell signaling: more than just a passing phase? Trends Biochem Sci. 38 (10), 494-506 (2013).
  6. Kedersha, N., et al. Dynamic shuttling of TIA-1 accompanies the recruitment of mRNA to mammalian stress granules. J Cell Biol. 151 (6), 1257-1268 (2000).
  7. Bley, N., et al. Stress granules are dispensable for mRNA stabilization during cellular stress. Nucleic Acids Res. 43 (4), e26(2015).
  8. Kedersha, N., et al. G3BP-Caprin1-USP10 complexes mediate stress granule condensation and associate with 40S subunits. J Cell Biol. 212 (7), 845-860 (2016).
  9. Panas, M. D., Ivanov, P., Anderson, P. Mechanistic insights into mammalian stress granule dynamics. J Cell Biol. 215 (3), 313-323 (2016).
  10. Anderson, P., Kedersha, N., Ivanov, P. Stress granules, P-bodies and cancer. Biochim Biophys Acta. 1849 (7), 861-870 (2015).
  11. Aulas, A., Van de Velde,, C, Alterations in stress granule dynamics driven by TDP-43 and FUS: a link to pathological inclusions in ALS? Front Cell Neurosci. 9, 423(2015).
  12. Ivanov, P., Anderson, P. Post-transcriptional regulatory networks in immunity. Immunol Rev. 253 (1), 253-272 (2013).
  13. Wolozin, B. Physiological protein aggregation run amuck: stress granules and the genesis of neurodegenerative disease. Discov Med. 17 (91), 47-52 (2014).
  14. Lloyd, R. E. Regulation of stress granules and P-bodies during RNA virus infection. Wiley Interdiscip Rev RNA. 4 (3), 317-331 (2013).
  15. Somasekharan, S. P., et al. YB-1 regulates stress granule formation and tumor progression by translationally activating G3BP1. J Cell Biol. 208 (7), 913-929 (2015).
  16. Adjibade, P., et al. Sorafenib, a multikinase inhibitor, induces formation of stress granules in hepatocarcinoma cells. Oncotarget. , (2015).
  17. Fournier, M. J., Gareau, C., Mazroui, R. The chemotherapeutic agent bortezomib induces the formation of stress granules. Cancer Cell Int. 10, 12(2010).
  18. Mazroui, R., Di Marco, S., Kaufman, R. J., Gallouzi, I. E. Inhibition of the ubiquitin-proteasome system induces stress granule formation. Mol Biol Cell. 18 (7), 2603-2618 (2007).
  19. Moeller, B. J., Cao, Y., Li, C. Y., Dewhirst, M. W. Radiation activates HIF-1 to regulate vascular radiosensitivity in tumors: role of reoxygenation, free radicals, and stress granules. Cancer Cell. 5 (5), 429-441 (2004).
  20. Szaflarski, W., et al. Vinca alkaloid drugs promote stress-induced translational repression and stress granule formation. Oncotarget. 7 (21), 30307-30322 (2016).
  21. Gilks, N., et al. Stress granule assembly is mediated by prion-like aggregation of TIA-1. Mol Biol Cell. 15 (12), 5383-5398 (2004).
  22. Kedersha, N. L., Gupta, M., Li, W., Miller, I., Anderson, P. RNA-binding proteins TIA-1 and TIAR link the phosphorylation of eIF-2 alpha to the assembly of mammalian stress granules. J Cell Biol. 147 (7), 1431-1442 (1999).
  23. Kedersha, N., Anderson, P. Mammalian stress granules and processing bodies. Methods Enzymol. 431, 61-81 (2007).
  24. Kedersha, N., Tisdale, S., Hickman, T., Anderson, P. Real-time and quantitative imaging of mammalian stress granules and processing bodies. Methods Enzymol. 448, 521-552 (2008).
  25. Langer-Safer, P. R., Levine, M., Ward, D. C. Immunological method for mapping genes on Drosophila polytene chromosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (14), 4381-4385 (1982).
  26. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  27. David, A., et al. Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation. J Cell Biol. 197 (1), 45-57 (2012).
  28. Panas, M. D., Kedersha, N., McInerney, G. M. Methods for the characterization of stress granules in virus infected cells. Methods. 90, 57-64 (2015).
  29. David, A., Bennink, J. R., Yewdell, J. W. Emetine optimally facilitates nascent chain puromycylation and potentiates the ribopuromycylation method (RPM) applied to inert cells. Histochem Cell Biol. 139 (3), 501-504 (2013).
  30. Dieterich, D. C., et al. In situ visualization and dynamics of newly synthesized proteins in rat hippocampal neurons. Nat Neurosci. 13 (7), 897-905 (2010).
  31. Ruggieri, A., et al. Dynamic oscillation of translation and stress granule formation mark the cellular response to virus infection. Cell Host Microbe. 12 (1), 71-85 (2012).
  32. Ghisolfi, L., Dutt, S., McConkey, M. E., Ebert, B. L., Anderson, P. Stress granules contribute to alpha-globin homeostasis in differentiating erythroid cells. Biochem Biophys Res Commun. 420 (4), 768-774 (2012).
  33. Ohn, T., Kedersha, N., Hickman, T., Tisdale, S., Anderson, P. A functional RNAi screen links O-GlcNAc modification of ribosomal proteins to stress granule and processing body assembly. Nat Cell Biol. 10 (10), 1224-1231 (2008).
  34. Porter, A. C., Fanger, G. R., Vaillancourt, R. R. Signal transduction pathways regulated by arsenate and arsenite. Oncogene. 18 (54), 7794-7802 (1999).
  35. Shen, S., Li, X. F., Cullen, W. R., Weinfeld, M., Le, X. C. Arsenic binding to proteins. Chem Rev. 113 (10), 7769-7792 (2013).
  36. McDonald, K. K., et al. TAR DNA-binding protein 43 (TDP-43) regulates stress granule dynamics via differential regulation of G3BP and TIA-1. Hum Mol Genet. 20 (7), 1400-1410 (2011).
  37. Aulas, A., et al. G3BP1 promotes stress-induced RNA granule interactions to preserve polyadenylated mRNA. J Cell Biol. 209 (1), 73-84 (2015).
  38. Martin, S., Tazi, J. Visualization of G3BP stress granules dynamics in live primary cells. J Vis Exp. (87), (2014).
  39. Wippich, F., et al. Dual specificity kinase DYRK3 couples stress granule condensation/dissolution to mTORC1 signaling. Cell. 152 (4), 791-805 (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

حبيبات الحمض النووي الريبوزيمقايسة التألق المناعيالمجهر الفلوريتهجين موضعي متألق لذيول بولي أعلامة G3BP1تثبيط الترجمةإجهاد الخلايا الثدييةالبروتينات المرتبطة بالحمض النووي الريبوزي
طرق لتصنيف البؤر السيتوبلازمية كما حبيبات الإجهاد الثدييات
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.