عزل و₁-ATPase من "طلائعيات طفيلية" المثقبيات البروسية

سينثاسيس و من نوع ATP الملازمين للغشاء تناوب مجمعات مولتيبروتين إزفاء بروتون أن الزوجين عبر أغشية ترانسدوسينج الطاقة من البكتيريا، الميتوكوندريا، والمعايشة مع تشكيل ATP. التفاصيل الجزيئية إليه التناوب من التوليف ATP معروفة أساسا بسبب الدراسات الهيكلية لتنقية البكتيرية والمتقدريه ATP سينثاسيس و سوبكومبليكسيس¹. ونوع ATP synthase ينقسم إلى مويتيس غشاء الجوهرية والأغشية الخارجية. الجزء الأغشية الخارجية، المعروفة باسم إف₁-ATPase، يحتوي على ثلاثة مواقع الحفاز، حيث تحدث الفسفرة diphosphate الأدينوزين (ADP) إلى ATP أو رد فعل عكسي. إف₁-يمكن إصدار ATPase تجريبيا من مجموعة الأغشية الغير مضمنة مع احتفاظها بقدرتها على يتحلل، لكن لا توليف، ATP. قطاع غشاء زمنياً، تسمى و_o، يتوسط إزفاء البروتين، مما يدفع تناوب الجزء المركزي من الإنزيم. و₁ و F_o قطاعات متصلة بواسطة سيقان المركزية والطرفية.

الأول محاولات لتنقية و₁-ATPase من الخميرة مهدها والقلب البقري الميتوكوندريا تاريخ العودة إلى الستينات. استخراج هذه البروتوكولات تستخدم الميتوكوندريا، التي تعطلت بفعل سونيكيشن، مجزأ بترسيب كبريتات الأمونيوم أو البروتامين، متبوعاً بدرجات اللوني الاختياري والمعالجة بالحرارة^{2،3،4 ،،}من⁵⁶. التنقية تحسنت إلى حد كبير والمبسطة باستخدام كلوروفورم، مما يسهل النشرات و₁-ATPase من غشاء الميتوكوندريا شظايا⁷. استخراج كلوروفورم ثم استخدم لاستخراج و₁-أتباسيس من مختلف الحيوانات والنباتات ومصادر البكتيرية (مثلاً، الجرذ الكبد⁸، الذرة⁹ والابقع قلقاس¹⁰و الإشريكيّة القولونية ¹¹). المزيد من تنقية صدر كلوروفورم و₁-ATPase التي تقارب أو حجم الاستبعاد اللوني (SEC) أسفرت عن بروتين عالية نقية معقدة، التي كانت مناسبة لتصميم هيكل عالي الاستبانة بعلم البلورات بالأشعة السينية، كما موثقة من قبل هياكل إف₁-ATPase من القلب البقري^12،13 و¹⁴من Saccharomyces cerevisiae. إف₁-هياكل ATPase وحددت أيضا من الكائنات الحية التي يصعب زراعتها، وهكذا، كانت كمية المواد البيولوجية الأولية محدودة. في هذه الحالة، و₁-أعرب عن مفارز ATPase وتجميعها في المجمع في كولايمصطنع، وتمت تنقية الإنزيم مغايرة كلياً بالتقارب اللوني عن طريق وحدة فرعية للمعلمة. مثل هذا النهج أدى إلى تحديد و₁-هياكل ATPase من نوعين من أنواع البكتيريا لاسخدام، ستيروثيرموفيلوس جيوباسيلوس¹⁵ و¹⁶ ثيرماروم كالدالكاليباسيلوس^{، 17}. ومع ذلك، هذه المنهجية غير مناسب بدلاً من التوكسينات و₁-أتباسيس حيث أنها تعتمد على جهاز بروثيوسينثيتيك بدائية والتجهيز بوستترانسلاشونال، والجمعية المعقدة.

استخراج كلوروفورم القائم كان يستخدم لعزل و₁-أتباسيس من ثنائيهالعائل أحادي الخلية الطفيليات مثقبيه الكروزية¹⁸ والبروسية ت.¹⁹، أهمية العوامل الممرضة الثدييات مما تسبب في أمريكا و تريبانوسومياسيس الأفريقية، على التوالي، ومن الطفيليات الحشرات مونوجينيك فاسسيكولاتا كريثيديا²⁰. تنقية هذه أدت فقط إلى وصف بسيط و₁-أتباسيس، حيث استخدمت أية تطبيقات المصب تماما وصف تكوين وهيكل، وخصائص الانزيمية للمجمع. توضح هذه المقالة أسلوب أمثل إف₁-تنقية ATPase من مرحلة دورة حياة الحشرات مثقف البروسية ت. الأسلوب هو وضعت استناداً إلى البروتوكولات المعمول بها لعزل الأبقار والخميرة و₁-أتباسيس^،من²¹²². الإجراء غلة عالية نقية ومتجانسة توصيف مفصل البروتين الكتلي²³، و تصميم هيكل²⁴إنزيم مناسب في المختبر الانزيمية والمثبطة فحوصات،. البروتوكول تنقية والمعرفة و₁-هيكل ATPase على المستوى الذري يفتح إمكانية تصميم شاشات لتحديد مثبطات جزيء صغير، والمساعدة في تطوير عقاقير جديدة ضد تريبانوسومياسيس الأفريقية. وعلاوة على ذلك، البروتوكول يمكن تكييفها لتنقية و₁-ATPase من الكائنات الحية الأخرى.

1-المخازن المؤقتة والحلول

1. إعداد الحلول المدرجة أدناه. ديغا كافة المخازن المؤقتة للفصل اللوني للسوائل. إضافة مثبطات ADP، بينزاميديني، وحوزتي فقط قبل الاستخدام.
   1. إعداد المخزن المؤقت ج: 50 مم تريس المخزن المؤقت مع حمض الهيدروكلوريك (تريس-HCl) pH 8.0، السكروز 0.25 م، بينزاميديني 5 مم، 5 مم أمينوكابرويك مثبطات حمض (ACA)، ومبطلات (10 ميكرومتر أماستاتين 50 ميكرون بيستاتين، 50 ميكرون بيبستاتين، 50 ميكرون ليوبيبتين وديبروتين ميكرومتر 50 ألف).
   2. إعداد المخزن المؤقت ب: 50 مم تريس-HCl pH 8.0، السكروز 0.25 م، 4 ملم حمض الإيثيلين (يدتا)، 5 مم بينزاميديني مم 5 هيئة مكافحة الفساد، 1 مم ADP، ومثبطات البروتياز (10 ميكرومتر أماستاتين 50 ميكرون بيستاتين، 50 ميكرون بيبستاتين، 50 ميكرون ليوبيبتين وديبروتين ميكرومتر 50 ألف).
   3. إعداد المخزن المؤقت العمود Q: 20 مم تريس-HCl pH 8.0، 4 مم يدتا، 10 مم MgSO₄، 5 مم بينزاميديني، 5 مم هيئة مكافحة الفساد، و 1 مم ADP.
   4. إعداد المخزن المؤقت شطف العمود Q: Q-العمود المخزن المؤقت مع 1 م كلوريد الصوديوم.
   5. إعداد المخزن المؤقت في الثانية: 20 مم تريس-HCl pH 8.0، 10 مم MgSO₄، 100 ملم كلوريد الصوديوم، 1 ملم ADP.
   6. إعداد كلوروفورم مشبعة 2 م تريس-HCl pH 8.5. مزيج كلوروفورم مع 2 م تريس-HCl pH 8.5 في نسبة 1:1 تقريبا في زجاجة ملولبة، يهز والسماح العضوية ومائي مراحل منفصلة، وقياس درجة الحموضة في الطبقة المائية العليا مع شريط من الورق مؤشر الرقم الهيدروجيني. تخزين في درجة حرارة الغرفة. قبل الاستخدام، اهتز مرة أخرى والسماح مراحل منفصلة. استخدام طبقة كلوروفورم أقل.
      تنبيه: كلوروفورم متقلبة وتهيّج العينين والجلد. ويعمل في غطاء دخان. استخدام نظارات السلامة عند الهز.

2-إعداد الجسيمات sub-الميتوكوندريا

1. ريسوسبيند الحويصلات الميتوكوندريا (ميتوبلاستس) المعزولة التي تحلل ناقص التوتر²⁵ من 1 × 10¹¹ إلى 2 × 10¹¹ الخلايا من بروسيكليك ت. البروسية في 5 مل من المثلج المخزن المؤقت الاحتفاظ ألف العينة مبردة حتى الخطوة 3، 2.
2. تحديد تركيز البروتين في التعليق بيسينتشونينيك الحمضية (اتفاق التعاون الأساسي) بروتين الإنزيم²⁶ وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
   1. استخدام سلسلة تمييع ألبومين المصل بقرى (BSA) في الماء عالي النقاوة لإنشاء المنحنى المعياري. تخفف من كمية صغيرة من العينة 20-100 مرة مع الماء عالي النقاوة لتنسجم مع معايير مجموعة من جيش صرب البوسنة.
   2. حساب كمية البروتين الكلية في العينة، وتركيز البروتين إلى 16 ملغ/مل باذابته مع المخزن المؤقت الإضافي أ
3. تجزئة ميتوبلاستس إلى حويصلات مقلوب وقطع الغشاء سونيكيشن لتعليق 7 x ل 15 ثانية مع طاقة إجمالية من 70 إلى 100 ي كل دفعة مع ميكروتيب التي يبلغ قطرها 3.9 ملم. إذا لم يتم عرض الخالطون بالموجات فوق الصوتية إنتاج الطاقة، بدء التحسين في 50% من الطاقة القصوى. احتضان العينة على الجليد لمدة 30 ثانية بين النبضات. وبعد سونيكاتيون، التعليق يصبح أغمق قليلاً.
4. وشظايا الرواسب الغشاء قبل تنبيذ فائق 54,000 ز س ح 16 أو 98,000 ز س ح 5 في 4 درجات مئوية. صب المادة طافية والمضي قدما في استخراج كلوروفورم، أو فلاش-تجميد الرواسب في النتروجين السائل وتخزينه في-80 درجة مئوية.

3-إطلاق سراح إف₁-ATPase من الغشاء من كلوروفورم

1. ريسوسبيند بيليه أغشية الميتوكوندريا في المخزن المؤقت ب مع المعونة من صغير الخالطون دونس. حساب حجم المخزن المؤقت ب على أساس المبلغ الإجمالي للمخزن المؤقت المستخدمة في الصيغة الخطوات 2.1 و 2.2 باستخدام ما يلي: حجم (المخزن المؤقت ب) = الحجم (المخزن المؤقت A) x 12/21. نقل التعليق إلى أنبوب مخروطي 15 أو 50 مل.
2. إزالة النموذج من الجليد، ومن الآن فصاعدا، الاحتفاظ بالعينة وجميع الحلول التي ستستخدم في درجة حرارة الغرفة.
3. إضافة كلوروفورم مشبعة 2 م تريس-HCl pH 8.5؛ حجم كلوروفورم المراد إضافتها يساوي نصف حجم التعليق. قم بإغلاق الغطاء محكم. اهتز بشدة للضبط 20 س. الطرد المركزي أنه فورا في 8,400 س ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
4. نقل في مرحلة مائي غائم العلوي إلى 1.6 مل microtubes. إضافة مثبطات البروتياز (10 ميكرون أماستاتين 50 ميكرون بيستاتين، 50 ميكرون بيبستاتين، 50 ميكرون ليوبيبتين و 50 ميكرون ديبروتين A) ليحل محل مثبطات إزالة بواسطة معاملة كلوروفورم. الطرد المركزي هذه العينات في س 13,000 ز لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. نقل المادة طافية إلى microtubes جديدة وتكرار الطرد المركزي لإزالة أي مواد غير قابلة للذوبان.

4-انيون تبادل اللوني

1. حجته عمود الصرف (Q) شاردة 5 مل المرفقة بنظام لوني سائل البروتين سريعة مع المخزن المؤقت فالعمود بمعدل تدفق 5 مل/دقيقة حتى امتصاص في 280 نانومتر والموصليه استقرار (حوالي 50 مل من المخزن المؤقت).
2. تحميل المادة طافية من الخطوة 3، 3 في العمود متوازن بمعدل تدفق من 1 مل/دقيقة الانتظار حتى امتصاص في 280 nm تستقر في الخلفية. تطبيق تدرج خطي 25 مل العازلة شطف Q-العمود من 0% إلى 100% بمعدل تدفق للكسور 1 مل جمع 0.5 مل/دقيقة.
3. الاعتداء كسور الفردية المناظرة إلى ذروة شطف الرئيسية لنشاط ATP هيدروليكي ب مقايسة ATPase بولمان² على درجة الحموضة 8.0. استخدام 10 ميليلتر كل الكسر كل 1 مل مخلوط رد فعل. تجمع الكسور التي يحمل ATPase النشاط. اختيارياً، فصل 10 ميليلتر لكل جزء على الصوديوم دوديسيل فوسفات polyacrylamide هلام التفريد (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة) ووصمة عار الجل قبل Blue أخذ تصور الفردية و₁-مفارز ATPase وتلويث البروتينات.
4. تركيز العينة المجمعة بغشاء أولترافيلتريشن استخدام عمود دوران مع مرشح "الدائرة موكو" 100,000 إلى 200-500 ميليلتر. المضي قدما في الثانية أو تخزين العينة بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.

5-حجم الاستبعاد اللوني

1. حجته ثانية العمود المتصل نظام لوني سائل مع 48 مل على الأقل (مجلدين العمود) المخزن المؤقت في الثانية بمعدل تدفق 0.5 مل/دقيقة.
2. تطبيق النموذج على العمود وتشغيل اللوني بمعدل 0.25 مل/دقيقة تدفق جمع 0.25 مل الكسور.
3. تشغيل 10 ميليلتر من الكسور التي تتوافق مع قمم التتبع امتصاص الأشعة فوق البنفسجية_280nm في الحزب الديمقراطي الصربي صفحة ووصمة عار لهم بأخذ اللون الأزرق. يتضمن الذروة الرئيسية الأولى و₁-ATPase. الاعتداء الكسور المقابلة لهذه الذروة لحساسية النشاط وأزيد هيدروليكي ATP بمقايسة ATPase بولمان. تحديد تركيز البروتين بمقايسة اتفاق التعاون الأساسي.
4. تبقى و المنقي₁-ATPase في درجة حرارة الغرفة واستخدامها داخل 3 د بعد تنقية للتطبيقات المتلقين للمعلومات. وبدلاً من ذلك، تركيز العينة باستخدام عمود دوران مع عامل تصفية PES موكو 100,000 > 1.5 ملغ/مل، تسرع بخلطة مع كبريتات الأمونيوم المشبعة تعديلها لدرجة الحموضة 8.0 (1.2 x وحدة التخزين)، وتخزينها في 4 درجات مئوية.

تنقية نموذجية (الشكل 1) يبدأ مع حويصلات المتقدرية (ميتوبلاستس) المعزولة على التدرج بركل من 1 × 10 هيبوتونيكالي تفكيك11 إلى 2 × 1011 بروسيكليك البروسية ت. الخلايا25 مثقف في المعيار 27الغنية الجلوكوز SDM-79 المتوسطة. مجزأة ميتوبلاستس من سونيكيشن، ونسج، ويتم تجاهل المادة المحتوية على مصفوفة طافية. أغشية الميتوكوندريا تعامل مع كلوروفورم لإطلاق سراح إف1-ATPase. بعد الطرد المركزي، يتم تجاهل المرحلة العضوية وسرع الطور البيني. هو مجزأ في مرحلة مائي بالتبادل الأيوني اللوني في رباعي الأمونيوم، مبادل شاردة قوية (الشكل 2A). ذروة الكسور التي تتوافق مع شطف الرئيسية وتحتوي على إف1-ATPase هي تجميع ومركزة. هذه المواد بمثابة مدخلات للبورصة، التي تزيل الشوائب المتبقية. الملوث الرئيسي هو نازعة ديهيدروليبويل، الذي التيس من العمود ثانية كذروة منفصلة، تميزت بشريط أخضر داكن في الشكل 2. و1-ATPase التيس في الذروة الأولى المهيمنة، متماثلة إلى حد كبير (الشكل 2).

التقدم المحرز في تنقية تبعتها مقايسة البروتين اتفاق التعاون الأساسي (أو آخر مقايسة البروتين المشتركة)، الحزب الديمقراطي الصربي صفحة، ورصد نشاط ATPase. يقاس معدل التحلل ATP ATP بولمان تجديد المقايسة2، استناداً إلى انخفاض امتصاص NADH في رد فعل المقرونة. أزيد الصوديوم، ومثبط المنشأة و1-ATPase، يستخدم بتركيز 2 مم لتحديد نسبة و1-ATPase-التحلل المائي ATP محددة. عادة، تحتوي على المواد المدخلة تقريبا 150-300 ملغ بروتين المتقدرية، اعتماداً على عدد الخلايا المستخدمة كمصدر حويصلات المتقدرية. هو نسبة المراعية لأزيد من إجمالي نشاط ATPase حوالي 30 إلى 40% في هذه المرحلة. بعد استخراج كلوروفورم، ساهم أكثر من 90 في المائة نشاط ATPase في العينة إلى إف1-ATPase. و المنقي1-ATPase حساس تقريبا تماما لعلاج أزيد (حد أدنى المتبقية ATPase النشاط يمكن أن يعزى إلى autolysis الخلفية ATP) ويمثل حوالي 1% كتلة البروتين الإدخال، وبإنتاج تقريبي من 1- 1.5 ملغ و1-ATPase الواحدة 1 × 1011 الخلايا (الجدول 1). نمط نموذجي فرقة بعد انفصال و المنقي1-ATPase في جل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة يليه الأزرق أخذ تلطيخ هو مبين في الشكل 2. تم تحديد البروتينات حسب الكتلة الببتيد البصمات، وتميزت بالتفصيل مختلف النهج الكتلي23. العصابات ضعيفة متفرقة مرئية فوق الفرقة β-وحدة فرعية تمثل سوبكومبليكسيس α3بيتا3 غطاء الرأس (dimers وليغومرات من مفارز α و β) وهي خالية من أي ملوثات يمكن كشفها بواسطة التقنيات الحساسة الطيف الكتلي. و المنقي1-ATPase يمكن تخزينها لتصل إلى عدة أيام في المخزن المؤقت ثانية في درجة حرارة الغرفة. وبدلاً من ذلك، و1-يمكن عجلت ATPase تتركز على إيه تو ملغ/مل من وحدة تخزين متساوية من كبريتات الأمونيوم المشبعة في المخزن المؤقت في الثانية، مع الأس الهيدروجيني تعديلها إلى 8.0، وتخزينها في 4 درجات مئوية. لمدة ستة أشهر على الأقل بعد هطول الأمطار، ويمكن الحصول الإنزيم النشط مع لا تدهور واضح لأي وحدة فرعية ريديسولفينج المواد سرع في المخزن المؤقت ثانية أو حل مماثل. ومع ذلك، تخزين أطول من شهر واحد ليست مناسبة لبلورة، كما يحدد تجريبيا.

الشكل 1 : مخطط لعملية تنقية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 2 : تنقية خطوتين و إطلاق سراح كلوروفورم1-ATPase اللوني السائل- (أ) فصل الشخصية شطف شاردة-تبادل اللوني (اللوحة العلوية) والكسور المحدد في جل تريس-جليكاين الحزب الديمقراطي الصربي صفحة 10% إلى 20% ملطخة بالأزرق أخذ صبغ (أسفل اللوحة). الأزرق التتبع: امتصاص الأشعة فوق البنفسجية في 280 نانومتر؛ تتبع الأحمر: تركيز كلوريد الصوديوم في المخزن المؤقت شطف؛ الإدخال: إف1-ATPase نشرته كلوروفورم؛ قدم: التدفق من خلال. (ب) فصل الشخصية شطف ثانية (اللوحة العلوية) والكسور المحدد في جل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة ملطخة بالأزرق أخذ صبغ (أسفل اللوحة). الإدخال: تجميع الكسور من شاردة-تبادل اللوني الذي يحتوي على إف1-ATPase. أشرطة مرمزة في لوحات A و B علامة الكسور في ملفات التعريف التي تم تحليلها من قبل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة شطف والممرات المقابلة في جل كل منهما. (ج) الهويات من البروتينات الفردية المنعزلة و1-ATPase كما حددتها الكتلي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الجدول 1: مثال نموذجي التقدم والغلة و1-تنقية ATPase من الميتوكوندريا المعزولة من 1 × 1011 بروسيكليك البروسية ت. الخلايا.

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.