في فيفو اثنين من اللون 2-الفوتون التصوير من الخلايا المراسل الموسومة وراثيا في الجلد

Lipopolysaccharide (LPS) هو إندوتوكسين موجود في الغشاء الخارجي للبكتيريا سلبية الغرام¹. LPS لديه تقارب ملزم عالية لمستقبلات مثل الرسوم 4 (TLR4)/CD14/MD2 مستقبلات مجمع². TLR4 هو مستقبلات التعرف على نمط وجدت عادة على الغشاء الخارجي لمجموعة واسعة من الخلايا المناعية, الخلايا mesenchymal, ومجموعة فرعية من الخلايا العصبية الحسية^3,4,5. يؤدي تنشيط TLR4 المعبر عنه على الخلايا المناعية إلى أنظمة رسول ثانية معتمدة على MyD88 ومستقلة، وتنتهي بنقل بيتا كابا العامل النووي (NFיB) إلى نواة الخلية. وهذا يسبب الخلية المناعية prototypic لإنتاج وإطلاق السيتوكينات المؤيدة للالتهابات مثل إنترلوكين (IL)-1β، IL-6، و TNF-α⁶. ومع ذلك, كيف تستجيب أنواع الخلايا الأخرى لتحفيز TLR4 ليست واضحة كما. وقد تورطت الخلايا الليفية في مجموعة واسعة من الأمراض مثل السرطان والتليف الكيسي، وقد ثبت مؤخرا أن تلعب دورا monocyte العلاج الكيميائي الجذب وتعزيز التهاب^7،8،9.  يهتم مختبرنا بدور الخلايا الليفية في تطوير الألم الحاد والمزمن، حيث تشير الأدلة المبكرة إلى أن العوامل التي تطلقها الخلايا الليفية (مصفوفة metalloproteinases (MMPs)، مثبطات الأنسجة من metalloproteinases (TIMPs)، والخلايا الليفية عوامل النمو (FGFs)) تشارك في الألم العصبي¹⁰.

يمكن تحديد حالات تنشيط الخلايا من خلال مجموعة متنوعة من العوامل التي تشمل: تحريض الجينات الفورية المبكرة، وتغيير التعبير البروتيني، وانتشار الخلايا، والتغيرات المورفولوجية^11،12،13. هناك العديد من التقنيات الموجودة للإجابة على الأسئلة التي قد تكون لدينا حول كيفية تنشيط الخلايا يساهم في الأمراض، ولكن لديهم جميعا قيودها. يستخدم الكيمياء المناعية النمطية الأجسام المضادة ذات العلامات الفلورية لتسمية البروتينات ذات الأهمية في الأنسجة الثابتة، والتي قد تكون غير محددة وغالبا ما تتطلب استكشاف الأخطاء وإصلاحها كبيرة قبل أن تسفر عن نتائج مثمرة¹⁴. النشاف الغربي هو تقنية مفيدة عند مقارنة مستويات التعبير البروتين في أنسجة ما بعد الوفاة. ومع ذلك، فإن العنصر النسيجي يفتقر إلى هذه التقنية والباحثين غير قادرين على تحديد أي تغييرات في مورفولوجيا¹⁵. RNA-Seq يسمح لنا لتحديد كمية وجود RNA رسول في عينة التي في كثير من الحالات تسفر عن بيانات ثاقبة. ومع ذلك، فإن الفجوة بين النسخ والترجمة يجعل من الصعب أن يكون القرار الزمني بعد التحفيز¹⁶. التصوير البؤري مفيد في تحديد التعبير والتعريب المشترك للبروتينات الموجودة في مقطع عرضي من الأنسجة¹⁷. في كثير من الأحيان، وهذا لا يمثل كامل عينة الأنسجة. وعلى النقيض من ذلك، تسمح المجاهر متعددة الفوتونات للمستخدمين بتصوير ما يقرب من 1 مم في عمق العينة، وخلق تمثيل شامل ثلاثي الأبعاد¹⁸. لذلك، نختار التركيز على في الجسم الحي، 2-الفوتون التصوير الإعدادية، والبيانات التي تم جمعها من هذه التجارب هي أكثر مباشرة ذات الصلة إلى البيئة الدقيقة البلاستيكية للغاية ومترابطة من الأنسجة الحية.

ميزة دراسة التفاعلات مستقبلات البروتين في الجسم الحي هو أننا يمكن أن التقاط بوضوح كيف تستجيب الخلايا لتحفيز, في الوقت الحقيقي, في بيئتهم الأصلية دون تأثير ضار وغير متوقع لاستخراج الأنسجة بعد الوفاة¹⁹. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن إجراء دراسات طولية لتقييم اللدونة الخلوية وفتيلة التي قد تحدث بسبب التنشيط.  باستخدام التصوير 2-فوتون، ونحن الحفاظ على سلامة البيئة الدقيقة موجودة عند تطبيق التحفيز الخارجي. يوفر هذا البروتوكول طريقة لتحديد الاستفادة من الجزيئات في الخلايا الليفية بعد الحقن المحيطي من LPS الموسومة بشكل فلوري على مدى عدة ساعات في الجسم الحي ودور TLR4 في تنشيط الخلايا الليفية.

تمت الموافقة على الإجراءات الحيوانية من قبل جامعة تكساس في دالاس المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها، وكانت وفقا للمبادئ التوجيهية للمعاهد الوطنية للصحة.  وقد أجريت جميع التجارب باستخدام الفئران الذكور والإناث البالغة من العمر 8-12 أسبوعا ولدت في المنزل على خلفية C57BL/6. تم شراء الفئران المعدلة وراثيا مع الكري-recombinase مدفوعة من قبل المروج البروتين-1 محددة الليفية تجاريا (جاكسون، 012641) (FSP1cre)^+/- وعبرت مع tdTomato^lox-stop-lox الفئران، كما تم شراؤها تجاريا ( جاكسون, 007914) و ([فسب1كر])^+/- ; tdTomato^lox-stop-lox and FSP1cre^-/-; ولدت tdTomato^lox-stop-lox الفئران في المنزل على خلفية C57BL/6 (الشكل1A، B،C). البروتين الليفي الخاص 1 هو بروتين داخلي يعبر عنه على ما يقرب من 72٪ من الخلايا الليفية ويمثل سائق الكري فعالة في الأنسجة الجلدية²⁰. وكانت الفئران تؤوي مجموعة وأعطيت إمكانية الحصول على الغذاء والماء. تم الحفاظ على درجة حرارة الغرفة عند 21 ± 2 درجة مئوية. في حين استخدمنا C57BL/6 عبرت الفئران الذكور والإناث في 8-12 أسابيع، ونحن لا نعتقد أن العمر، الجنس، أو الخلفية الوراثية هي المتطلبات اللازمة لتشغيل التجارب متعددة الفوتونات. تم التخدير العميق للفئران مباشرة بعد التجربة وقتلوا.

1- تحضير المخدرات

1. إعداد حل 5 ميكروغرام/20 ميكرولتر من الليبوبوليساكاريد-فيتك (انظر جدولالمواد) في PBS معقمة 1X (درجة الحموضة 7.4). دوامة حل الأسهم في كثافة متوسطة لمدة 30 ثانية الحد الأدنى لضمان خلط متجانسة لتركيز متساو في جميع أنحاء الحل قبل الأنابيب (LPS هو جزيء الدبق).
   ملاحظة: لا تضع LPS في حاوية زجاجية، إذا كان ذلك ممكناً، استخدم أنابيب الطرد المركزي الصغير السيليكونية. يُحفظ على الجليد حتى يُستعمل.

2. التصوير الإعداد

1. قم بإعداد النظام متعدد الفوتونات (راجع جدولالمواد) للتصوير بلونين. وهذا يتطلب استخدام ليزرين منفصلين للإثارة (انظر جدولالمواد)، ومجموعة مكعب فلتر GFP/RFP (انظر جدول المواد)، وهدف غمر المياه بـ 25 x (1.05 NA) (انظر جدولالمواد).
   ملاحظة: يمكن للمستخدمين تغيير هذه الإعدادات لتناسب بشكل أفضل الإعدادات البديلة وقدرات المجهر multiphoton. هذه هي المعلمات المستخدمة في البروتوكول التجريبي. انظر جدول المواد للحصول على تفاصيل محددة.
2. وضع جهاز مجسم (انظر جدولالمواد) على خشبة المسرح من المجهر متعدد الفوتون. توصيل هذا إلى آلة تسليم التخدير (انظر جدولالمواد) لضمان تخدير الحيوانات لمدة التجربة. ضع قطعة من الورق الأسود غير اللامع على سطح الجهاز كنقطة اتصال لمخلب الماوس.
3. حدد الماسح الضوئي الرنانة مع منطقة مسح ثابتة من 512 ميكرومتر × 512 ميكرومتر.
   ملاحظة: لا تقم بإجراء التجارب في هذا البروتوكول باستخدام الماسح الضوئي مقياس الجلفانومتر. بسبب معدل العينة أبطأ، سيكون هناك تشويه في z-كومة أشرطة الفيديو الفاصل الزمني بسبب التنفس من الحيوان الذي لا مفر منه.
4. ضبط الليزر الإثارة اثنين إلى الأطوال الموجية الإثارة من GFP وRFP، 930 نانومتر و 1100 نانومتر على التوالي، وتوجيه مسار الضوء من كل من الليزر الإثارة إلى هدف واحد باستخدام مرآة dichroic من 690-1050 نانومتر السماح ليزر الإثارة 930 nm ضبطها أن تنعكس على الماسح الضوئي الرئيسي والليزر 1100 نانومتر ضبطها لتمريرمباشرة إلى الماسح الضوئي الرئيسي (الشكل 2).
   ملاحظة: من الممكن تغيير هذه الأطوال الموجية الإثارة استناداً إلى إعداد المستخدم.
5. تعيين قوة الليزر من FITC إلى 5٪ وGFP إلى 20٪.
   ملاحظة: يوفر هذا الإعداد نسبة إشارة إلى ضوضاء مثالية (SNR) في هذه التجارب. الكشف عن إشارة عن طريق أنابيب متعددة القلويات ومضاعف ة للصورة (PMTs)؛ ومع ذلك، يمكن استخدام أجهزة الكشف GaAsP بدلاً من ذلك في تجارب عالية الحساسية جداً.
6. إعداد غرفة للتصوير في ظل ظروف مظلمة دون ضوء طائش.

3. في التصوير الحي

1. ضع الماوس في غرفة الحث في نظام توصيل التخدير واستخدم 5% من الأيسوفلوران (انظر جدولالمواد) بمعدل تدفق الأكسجين 2 لتر/دقيقة لوضع الماوس تحت التخدير العميق.
   ملاحظة: من المستحسن للغاية ارتداء جميع معدات الوقاية الشخصية المناسبة أثناء التجربة.
   1. نقل الماوس إلى جهاز مجسممع مع الوصول إلى مخروط الأنف للحفاظ على التخدير طوال التجربة. خفض isoflurane إلى 1.5٪ -2٪ والحفاظ على معدل التدفق ثابت.
   2. تثبيت بقوة مخلب الخلفية إلى قطعة من الورق الأسود مع الشريط الأسود على المناطق القريبة والبعيدة على حد سواء إلى منطقة الاهتمام (وهذا يقلل من آثار التنفس الماوس على جودة الصورة)، والتأكد من سطح الأخمص من مخلب هو دون عائق وتواجه حتى نحو الهدف. تأكد من أن رأس الماوس مستقر داخل مخروط الأنف المرفقة بالجهاز.
      ملاحظة: مراقبة الماوس عن أي علامات الشدة أو الجفاف طوال التجربة وضبط isoflurane وفقا لذلك.
2. وضع كمية سخية من زيوت التشحيم المعقمة القائمة على المياه (هلام، انظر جدولالمواد) على سطح الأخمص من مخلب ولمس الهدف لذلك من أجل خلق عمود من السائل بين مخلب والهدف.
3. استخدم ضوء الإثارة FITC للتركيز في الطبقة الجلدية من الكف. تأكد من أن يتم تصور الخلايا الليفية الموسومة tdTomato قبل الاستمرار في (هذه الخطوة مهمة في تحديد المستوى البؤري الصحيح إلى الصورة).
   ملاحظة: الطبقة الجلدية من مخلب حوالي 100-150 ميكرومتر في مخلب.
4. صورة منطقة الخلايا الواقعة تحت سطح الأخمص من مخلب الخلفية مع كل من 930 نانومتر و 1100 نانومتر ضبطها الليزر والحصول على 15 دقيقة الفاصل الزمني من حوالي 5-10 z-شرائح في حوالي 1 ميكرومتر لكل شريحة لإنشاء تمثيل للبيئة قبل حقن مع LPS-FITC.
5. إجراء حقن داخل البلنطاتر من 5 ميكروغرام /20 ميكروغرام LPS-FITC على مخلب الماوس الخلفي باستخدام 25 ميكرولتر زجاج هاميلتون حقنة (انظر جدولالمواد) وإبرة 30G (انظر جدولالمواد)، مع الحرص على عدم إزعاج موقف مخلب.
6. صورة منطقة من الخلايا تقع مباشرة تحت سطح الأخمص من مخلب الخلفية مع كل من 930 نانومتر و 1100 نانومتر ضبطها الليزر والحصول على 60-120 دقيقة الفاصل الزمني من حوالي 5-10 z-شرائح في ما يقرب من 1 ميكرومتر لكل شريحة لتحديد استيعاب LPS-FITC من قبل الخلايا.

في البداية، حقننا LPS-FITC في الكف الخلفي من الفئران البرية من أجل تصور استيعاب LPS-FITC في جميع أنواع الخلايا الموجودة في الطبقة الجلدية من مخلب. بعد أن لاحظت عددا لا يحصى من الخلايا في الطبقة الجلدية من مخلب الخلفية الاستفادة من الفلورسنت الموسومة LPS في فأر ة نوع البرية (فيديوالشكل 1،2)، حاولنا استهداف الخلايا الليفية على وجه التحديد لأنها هي التركيز الرئيسي في أبحاثنا. قبل تصوير الكفوف من الحيوانات حقن مع LPS-FITC أردنا أن نكون واضحين أنه لا يوجد الفلورة المتأصلة في الخلايا في طبقة الجلد. هذا هو لضمان أنه بعد الحقن، والصور التي نتخذها هي تفاعلات حقيقية من الخلايا مع LPS ذات العلامات الفلورية وليس أي القطع الأثرية التصوير (فيديوالشكل 3، 4). بعد حقن LPS-FITC، فقط FSP1+ الخلايا الليفية التي تعبر عن TLR4 ربط واستيعاب البروتين المحقون، مع مستوى عال من التعريب المشترك مع علامة tdTomato التي تعبر عنها هذه الخلايا (فيديو الشكل 5). وعلى النقيض من ذلك, الفئران التي لديها TLR4خرج من الجسم بأكمله (TLR4 KO) لا ربط واستقبال LPS بعد الحقن. كما هو واضح في الفيديو، صور ظلية من الخلايا مرئية بعد حقن LPS-FITC الذي يشير إلى أن المخدرات تنتشر في السائل الخلالي حول الخلايا ولكن لا يتم في الواقع ملزمة من قبل مستقبلات (فيديوالشكل 6).

لتلخيص نتائجنا، ونحن نظهر، في الجسمالحي، أنه بعد حقن LPS-FITC، في FSP1cre. tdTomatolox-stop-lox خلية محددة إعادة تنشيط الحيوان فقط الخلايا الليفية تتفاعل مع وتحمل LPS. في المقابل, بالضربة القاضية لكامل الجسم من TLR4 لا ربط واستيعاب LPS-FITC بعد الحقن.

الشكل 1 يتم التعبير عن tdTomato فقط في FSP1+ الخلايا الليفية بطريقة تعتمد على Cre. A)يتم عبور الفئران المعدلة وراثيا FSP1cre ولدت على خلفية C57BL/6 مع الفئران tdTomato ولدت على خلفية C57BL/6 لتوليد الفئران أعرب tdTomato في FSP1+ الليفية بطريقة تعتمد على الكري. ب)النتائج التمثيلية PCR التي تصور الفئران FSP1cre الإيجابية والسلبية التي تعبر عن tdTomato. ج)التصوير التصويري التمثيلي للفليّات الجلدية في الفضاء خارج الخلية الموجود في مخلب الماوس. FSP1+ الفئران التعبير عن بروتين الفلورسنت الأحمر فقط في الخلايا الليفية في حين FSP1- الفئران لا. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2 . ضوء المسار من اثنين من لون 2-الفوتون المجهر. تصوير مسار الضوء الذي تم إعداده لتجربة 2-لون 2-فوتون إعداد. يتم ضبط الليزر 1 إلى 930 نانومتر لإثارة LPS FITC-المترافقة والليزر 2 يتم ضبطها إلى 1100 نانومتر لإثارة tdTomato وجدت في الخلايا الليفية. ينعكس ضوء الإثارة من الليزر 1 من قبل مرآة dichroic (690-1050 نانومتر) في حين ضوء الإثارة من الليزر 2 يمر من خلال إلى الماسح الضوئي الرئيسي. وينعكس ضوء الإثارة من كلا الليزرين من خلال مجموعة من المرايا إلى مرآة ثنائية التفكير الثانية (650 نانومتر) مما يسمح للضوء الإثارة لتمرير من خلال الهدف وإلى الأنسجة لإثارة الفلوروفور. وينبعث الضوء من الفلوروفور المتحمس، ويُسبّأ بهدف 25 x وينعكس على المرآة الديكروية (650) إلى أنابيب المضاعف الضوئي القلوية المتعددة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3 . مخطط التدفق التجريبي للميكروسكوب الفوتون 2. يتم تخدير الفئران وشل حركتها باستخدام نظام التخدير منخفض التدفق وجهاز مجسم. يواجه السطح الأخمصي للمخلب الهدف ويتم تصويره لمدة 15 دقيقة. يتم إجراء حقن داخل البلنطار من 5 ميكروغرام/20 ميكرولتر LPS-FITC على الماوس التخدير ثم يتم تصوير مخلب لمدة من الوقت اللازمة لهدف التجربة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

فيديو الشكل 1. Z-كومة أشرطة الفيديو من LPS-FITC استيعاب في الخلايا في البرية نوع C57BL/6 الفئران. Z-كومة الفيديو من الطبقة الجلدية من مخلب الخلفية من الماوس C57BL/6 قبل حقن LPS-FITC. تم تصوير الجانب الأخمصي لمخلب الماوس من النوع البري لمدة 15 دقيقة قبل الحقن مع LPS-FITC للتحكم في الفلورة الذاتية المنتجة في قناة GFP. هناك إشارة قليلة إلى لا شيء في قناة GFP تشير إلى عدم وجود الفلورة الذاتية. الرجاء النقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتنزيل.)

فيديو الشكل 2. Z-كومة الفيديو من الطبقة الجلدية من مخلب الخلفية من الماوس C57BL/6 بعد حقن LPS-FITC. تم تصوير الجانب الأخمصي من مخلب الماوس نوع البرية لمدة 1.5 ساعة بعد LPS-FITC حقن لتصور استيعاب LPS-FITC من قبل جميع الخلايا التي تعبر عن TLR4. كما هو واضح في الفيديو، وهناك العديد من الخلايا ربط واستيعاب LPS-FITC طوال فترة التجربة. الرجاء النقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتنزيل.)

فيديو الشكل 3. Z-كومة الفيديو من الطبقة الجلدية من مخلب الخلفية من FSP1cre. tdTomato الماوس قبل حقن LPS-FITC. الجانب الأخمصي من FSP1cre; تم تصوير مخلب الماوس tdTomato لمدة 15 دقيقة قبل الحقن مع LPS-FITC للسيطرة على autofluorescence المنتجة في قناة GFP. هناك إشارة قليلة إلى لا شيء في قناة GFP تشير إلى عدم وجود الفلورة الذاتية. يتم تصور الخلايا الليفية الإيجابية tdTomato. الرجاء النقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتنزيل.)

فيديو الشكل 4. Z-كومة الفيديو من الطبقة الجلدية من مخلب الخلفية من الماوس TLR4KO قبل حقن LPS-FITC. تم تصوير الجانب الأخمصي من مخلب الماوس TLR4KO لمدة 15 دقيقة قبل الحقن مع LPS-FITC للسيطرة على autofluorescence المنتجة في قناة GFP. هناك إشارة قليلة إلى لا شيء في قناة GFP تشير إلى عدم وجود الفلورة الذاتية. الرجاء النقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتنزيل.)

فيديو الشكل 5. Z-كومة الفيديو من الطبقة الجلدية من مخلب الخلفية من FSP1cre. tdTomato الماوس بعد حقن LPS-FITC.  الجانب الأخمصي من FSP1cre; تم تصوير مخلب الماوس tdTomato لمدة 1.5 ساعة بعد LPS-FITC حقن لتصور استيعاب LPS-FITC عن طريق tdTomato إيجابية الخلايا الليفية التعبير عن TLR4. كما هو واضح في الفيديو, وينظر إلى استيعاب محددة للغاية من LPS-FITC عن طريق TLR4 أعرب على tdTomato إيجابية الخلايا الليفية. الرجاء النقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتنزيل.)

فيديو الشكل 6. Z-كومة الفيديو من الطبقة الجلدية من مخلب الخلفية من الماوس TLR4KO بعد حقن LPS-FITC.  تم تصوير الجانب الأخمصي من مخلب الماوس TLR4KO لمدة 1.5 ساعة بعد LPS-FITC حقن لتصور ما إذا كان استيعاب LPS-FITC من قبل الخلايا في ضربة قاضية لكامل الجسم من TLR4 ممكن. كما هو واضح في الفيديو، لا ينظر إلى استيعاب LPS-FITC من قبل الخلية في الطبقة الجلدية من مخلب الخلفية. الرجاء النقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتنزيل.)

ويعلن صاحبا البلاغ أنهما ليس لديهما مصالح مالية متنافسة.