إنشاء نموذج بورسين السابقين فيفو القرنية لدراسة العلاجات الدوائية ضد التهاب القرنية البكتيرية

31 - تعد عدوى القرنية من الأسباب الهامة للعمى، وتحدث بنسب وبائية في البلدان المنخفضة الدخل والبلدان المتوسطة الدخل. وتختلف مسببات المرض من منطقة إلى أخرى ولكن البكتيريا تمثل أغلبية كبيرة من هذه الحالات. Pseudomonas aeruginosa هو الممرض المهم الذي يسبب مرض تقدمية بسرعة. في كثير من الحالات، ويترك المرضى مع تندب stromal، الاستجماتيزم غير النظامية، تتطلب زرع أو في أسوأ سيناريو، تفقد العين^1،2.

التهاب القرنية البكتيرية الناجمة عن P. aeruginosa هو عدوى العين صعبة لعلاج خاصة بسبب الظهور المتزايد لسلالات مقاومة مضادات الميكروبات من P. aeruginosa. خلال العقد الماضي، أصبح من الواضح أن اختبار وتطوير علاجات جديدة لالتهابات القرنية، بشكل عام، وتلك التي تسببها Pseudomonas sp.، على وجه الخصوص، ضرورية لمكافحة الاتجاه الحالي في مقاومة المضادات الحيوية³.

لاختبار فعالية العلاجات الجديدة لالتهابات القرنية ، والأساليب التقليدية في المختبرات الميكروبيولوجية هي بديل الفقراء بسبب الفرق في علم وظائف الأعضاء البكتيرية خلال الثقافة المختبرية ، وخلال الالتهابات في الجسم الحي وكذلك بسبب عدم وجود واجهة المضيف^4،5. في نماذج الحيوانات الحية، ومع ذلك، هي مكلفة، تستغرق وقتا طويلا، لا يمكن إلا أن تقديم عدد قليل من النسخ المتماثلة وإثارة المخاوف بشأن رعاية الحيوان.

في هذه المقالة، ونحن نبرهن على بسيطة وقابلة للاستنساخ organotypic السابقين vivo porcine نموذج من التهاب القرنية التي يمكن استخدامها لاختبار العلاجات المختلفة للعدوى الحادة والمزمنة. لقد استخدمنا P. aeruginosa لهذه التجربة ولكن النموذج يعمل أيضا بشكل جيد مع البكتيريا الأخرى، والكائنات الحية مثل الفطريات والخميرة التي تسبب التهاب القرنية.

تم التضحية بالأرانب مختبر ألبينو في المختبر من أجل غيرها من الأعمال التجريبية المخطط لها في إطار بروتوكولات وزارة الداخلية المعتمدة. لم تكن العيون مطلوبة للاستخدام التجريبي في تلك الدراسات لذلك تم استخدامها لهذا البروتوكول.

1- التعقيم

1. الخطوة الحرجة: تطهير جميع ملقط ومقص عن طريق نقع لمدة 1 ساعة في 5٪ (الخامس / الخامس) حل من Distel في الماء المقطر، وتنظيف مع فرشاة، وشطف مع ماء الصنبور وتعقيم في فرن في 185 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 2 ساعة.
2. تعقيم جميع الأواني الزجاجية والكواشف الأخرى عن طريق autoclaving في 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة أو إعداد الكواشف وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تنفيذ الإجراءات التالية في مجلس الوزراء سلامة الميكروبيولوجيا من الدرجة الثانية.

2. عينة جمع

1. جمع عيون بورسين
   1. بذرات لاندراس بيضاء كبيرة، تم استخدام صليب مع خنزير هامبشاير. وقد ذهلت الحيوانات مع تيار كهربائي وكانت العينين enucleated 2 ساعة في وقت لاحق في المسلخ.
   2. الخطوة الحرجة: مرة واحدة enucleated، نقل العينين إلى المختبر في محلول الفوسفات المعقم المخزنة (PBS) لمنعهم من الجفاف ومعالجتها على الفور عند الوصول.
2. جمع عيون الأرانب
   1. اُخراج القرنيات وإرسالها إلى المختبر في برنامج تلفزيوني معقمة.

3. إعداد زر الكورنيا

1. استخدام ملقط العقيمة لعقد الأنسجة المحيطة مقلة العين ونقلها إلى طبق بيتري. إزالة الملتحمة والأنسجة العضلية حول مقلة العين على طبق بيتري باستخدام شفرة مشرط رقم 15 والملذات.
2. رفع بلطف مقلة العين في حين عقد العصب البصري مع ملقط ونقلها إلى جرة 0.5 لتر مليئة برنامج تلفزيوني عقيم.
3. مرة واحدة يتم مسح جميع العيون من الأنسجة المحيطة بها، ونقلها باستخدام ملقط العقيمة إلى آخر 0.5 لتر جرة مليئة 3٪ (الخامس / الخامس) بودينيد في برنامج تلفزيوني وترك لمدة 1 دقيقة.
4. نقل مقل العيون إلى آخر 0.5 لتر جرة مع برنامج تلفزيوني عقيمة.
5. استخدام ملقط لعقد العين لا يزال على طبق بيتري وجعل قطع بالقرب من القرنية مع شفرة مشرط لا 10A.
6. الخطوة الحرجة: عقد حافة قطع واستخدام مقص لاستخراج القرنية ترك حوالي 3 مم من صلب المحيطة القرنية. ضمان نهاية حادة من مقص لا تخترق القزحية أو الأنسجة المشيمية، وهو في الفضاء فوق المشيمية.
7. عقد زر corneoscleral مع ملقط واستخدام زوج آخر من ملقط نهاية مدببة لفصل بلطف أنسجة أوفيال.
8. رفع زر corneoscleral من الكرة الأرضية المتبقية وشطف لفترة وجيزة في 1.5٪ (الخامس / الخامس) محلول اليود povidone في برنامج تلفزيوني في لوحة 12 جيدا.
9. ضع الزر الكورني في لوحة أخرى 12 بئر مليئة PBS العقيمة.
10. بعد تجهيز جميع العيون(أوصت الحد الأقصى 40 عيون في دفعة واحدة)،ضع كل زر القرنية إلى طبق بيتري الفردية (34 مم قطر) الجانب الظهارية حتى وتصب في 3 مل من المتوسطة الثقافة قبل warmed إلى 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: تكوين الوسط الثقافة هو على النحو التالي: متوسط النسر Dulbecco المعدلة (DMEM): لحم الخنزير [1:1] تكملها 5 ميكروغرام •مل^-1 الأنسولين و 10 نانوغرام •مل^-1 عامل نمو البشرة (EGF)، 10٪ (v/v) مصل عجل الجنين (FCS)، 100 U∙mL^-1 البنسلين 100 U∙ مل^-1 ستريبتوميسين و 2.5 μg∙ mL^-1 أمفوترريسين B. وكخطوة اختيارية، يمكن استكمال الوسيلة بـ 50^{جرامًا من} دكستران -1 ل- لمنع تورم القرنية المُخترة أثناء خطوات الحضانة الإضافية.
11. احتضان في 37 درجة مئوية في حاضنة استزراع الأنسجة المرطبة.

4. صيانة أزرار الكورنيا

1. بعد 24 ساعة، استخدم تقنية معقمة لإزالة الوسائط واستبدالها بـ 3 مل من وسائل الإعلام الطازجة التي تحتوي على المضادات الحيوية قبل تسخينها. الحفاظ على أزرار القرنية في وسائل الإعلام مع المضادات الحيوية لمدة 48 ساعة لتطهير القرنيات. احتضان في 37 درجة مئوية في حاضنة استزراع الأنسجة المرطبة.
2. الخطوة الحرجة: بعد 48 ساعة، وإزالة وسائل الإعلام وشطف القرنيات مع 2 مل من برنامج تلفزيوني. ثم الحفاظ على أزرار القرنية في وسائل الإعلام خالية من المضادات الحيوية لمدة لا تقل عن يومين أو مثالي ثلاثة أيام قبل العدوى التجريبية، لإزالة المضادات الحيوية المتبقية من الأنسجة.
3. احتضان في 37 درجة مئوية في حاضنة استزراع الأنسجة المرطبة. تغيير الوسائط مرة واحدة على الأقل خلال هذه الأيام الثلاثة. تخلص من القرنيات إذا تطور أي عكر في الوسط الخالي من المضادات الحيوية.

5- إعداد التلقيح

1. صب 10 مل من مرق LB في قارورة مخروطية 50 مل مع سدادة رغوة.
2. نقل مستعمرة من P. aeruginosa سلالة PAO1 أو سلالة PA14 من لوحة أجار الطازجة واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 3-4 ح حتى البكتيريا في منتصف مرحلة السجل.
3. نقل ثقافة البكتيريا إلى أنبوب 50 مل والطرد المركزي في 3000 س ز لمدة 5 دقائق. إزالة فائقة وإعادة تعليق بيليه الخلية في برنامج تلفزيوني.
4. كرر الخطوة 5.3 مرتين أكثر لغسل الخلايا. إعادة تعليق بيليه الخلية في برنامج تلفزيوني وضبط الكثافة البصرية في 600 نانومتر إلى حوالي 0.6 باستخدام برنامج تلفزيوني عقيمة كفراغ.

6. إصابة زر corneoscleral

1. إزالة وسائل الإعلام من طبق بيتري وشطف القرنيات مرتين مع 1 مل من برنامج تلفزيوني عقيم.
2. ضغط بلطف ملقط في حين عقد القرنية في ما بين. استخدام مشرط 10A لجعل أربعة تخفيضات - اثنين عمودي، اثنين أفقيا - في القسم المركزي من زر الكورنيا من خلال طبقة الظهارية إلى ستروما الأساسية.
3. وضع قالب زجاجي معقمة في لوحة 6-جيدا مع جزء واسع حتى ووضع القرنية في منتصف القالب الزجاجي، الجانب ظهارة تواجه إلى أسفل. جعل خفض الحق في وسط الجزء السفلي من القالب الزجاجي.
4. الخطوة الحرجة: صب 1 مل من 1٪ (ث / الخامس) انخفاض نقطة ذوبان أجار حل في DMEM لملء القالب الزجاجي مع القرنية تماما.
5. السماح لأجار لتعيين ثم عكس القالب الزجاجي بحيث ظهارة القرنية تواجه صعودا.
6. Pipette 15 ميكرولتر من الثقافة البكتيرية مع_600nm OD = 0.6 (لP. aeruginosa وهذا يعادل ما يقرب من 1 × 10⁷ وحدات تشكيل مستعمرة (CFU) في 15 ميكرولتر) مباشرة في منطقة قطع ومن ثم إضافة 85 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني إلى الأعلى للحفاظ على ظهارة القرنية رطبة. تمييع الثقافة البكتيرية المتبقية وطبق على أجار لحساب وحدات تشكيل مستعمرة ل inoculum.
7. إضافة 1 مل من DMEM دون المضادات الحيوية إلى الجزء السفلي من كل بئر مع القالب الزجاجي. احتضان لوحة 6-جيدا مع أزرار الكورنيا كلية المصابة في حاضنة مرطب في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO₂ لمدة تصل إلى 24 ساعة.
8. إعداد القرنية السيطرة غير المصابة جنبا إلى جنب مع كل تجربة. لإعداد التحكم غير المصاب، استبدل 15 ميكرولتر من الثقافة البكتيرية في الخطوة 6.6 مع برنامج تلفزيوني عقيم.

7. التجانس للقرنية لحصاد البكتيريا

1. تجاهل المتوسط DMEM من الجزء السفلي من لوحة 6 جيدا وإضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني عقيم لشطف الجزء السفلي من البئر.
2. إزالة برنامج تلفزيوني بلطف عن طريق pipetting دون لمس الجزء المركزي من زر corneoscleral. إزالة حلقة الزجاج باستخدام ملقط العقيمة ووضعها في Distel 5٪ .
3. شطف بلطف الجزء العلوي من زر corneoscleral مع 1 مل من برنامج تلفزيوني مرتين [اختياري].
4. اضغط على حافة زر corneoscleral مع ملقط تلميح ناعم وفصله عن أجار تحت.
5. نقل القرنية إلى أنبوب 50 مل مليئة الجليد الباردة 1-2 مل من برنامج تلفزيوني.
6. استخدام التجانس تلميح غرامة لمجرد الجزء العلوي من القرنية المصابة. لا يجب أن يتم االنسيج بشكل كامل. يساعد المُجنّز على فصل البكتيريا عن ظهارة القرنية ومنطقة القطع.
7. دوامة القرنية في برنامج تلفزيوني لبضع ثوان لخلط المحتويات.
8. إضافة 20 ميكرولتر من التجانس إلى 180 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني وتنفيذ التخفيفات التسلسلية في لوحة 96 جيدا.
9. تخفيف التعليق بشكل متسلسل إلى^10-4 و 10^-5 تخفيف والماصة 10 ميكرولتر من التجانس المخفف مع البكتيريا على صفيحة أجار الدم. احتضان لوحة لمدة 8 ساعات ، وعدد من CFU. عند اختبار تأثير مضادات الميكروبات، يجب التوصل إلى عامل التخفيف المناسب في تجريبيا.

تصميم القوالب الزجاجية هي فكرة مبتكرة ومبتكرة، واستخدام التي سمحت لنا لاقامة نموذج بطريقة متسقة مع الحد الأدنى / لا قضايا التلوث. تم إعداد قوالب من قبل منفاخ الزجاج في جامعة شيفيلد على أساس تصميم (الشكل 1A). الإعداد التجريبي يحافظ على شكل محدب للقرنية ويحمل البكتيريا على الجزء العلوي من ظهارة حيث تحدث العدوى (الشكل 1B).

عادة ما تنتفخ القرنيات بورسين بعد أيام قليلة في المتوسط. هذا أمر طبيعي ووجدنا أنه لم يكن هناك فرق كبير بين القرنيات مع وبدون إضافة ديكستران ، والذي عادة ما يضاف لمنع تورم القرنية (الشكل 1H). وعادة ما تجرح القرنيات لمساعدة البكتيريا على اختراق الظهارة. على الرغم من عدم وجود فرق كبير في تقدم العدوى بين الجرحى (قطع) والقرنيات غير (غير المصقول)، لاحظنا المزيد من الاختلافات بين التكرارات في القرنيات غير المصقولة (الشكل 1C). غسل القرنيات مرتين مع برنامج تلفزيوني يزيل البكتيريا الزائدة التي لم تعلق على ظهارة. كان هناك فرق كبير في CFU بين القرنيات porcine غسلها وغير مغسولة المصابة P. aeruginosa PAO1 لمدة 24 ساعة(الشكل 1D). لم يكن هناك فرق كبير في التهم CFU بين القرنيات البورcine والأرانب المصابة PA14 و PAO1 (الشكل 1E, 1F). وكانت النتائج لكلا النموذجين قابلة للتكرار. بعد 24 ساعة، والقرنية المصابة مع أي سلالة Pseudomonas دائما تطوير التعتيم ومنطقة قطع يصبح أكثر وضوحا ومفتوحة بالمقارنة مع القرنية غير المصابة (الشكل 1G).

الشكل 1: القرنية السابق vivo المصابة بـ Pseudomonas aeruginosa. ( أ) صورة تخطيطية لقالب زجاجي يستخدم للحفاظ على شكل القرنية وتسهيل إدخال البكتيريا والعلاجات. سمك القوالب الزجاجية هو 1.5 ملم وهو نفس سمك أنابيب الاختبار المصنوعة من زجاج البورسليكات. (B) صورة تخطيطية من مجموعة التجريبية. (C) اختبار تأثير الجرح على العد CFU النهائي بعد التجانس. غير المصقول (ن = 16) وقطع (ن = 28) أصيب القرنيات مع P. aeruginosa PAO1 وP. aeruginosa PA14 لمدة 24 ساعة. تم غسل القرنيات مع 1 مل من برنامج تلفزيوني قبل التجانس. تشير أشرطة الخطأ إلى الانحراف المعياري. (D) اختبار تأثير غسل القرنيات مع 2 × 1 مل من برنامج تلفزيوني (ن = 6) وليس غسل (ن = 6) على العد CFU النهائي بعد العدوى مع P. aeruginosa PAO1 لمدة 24 ساعة. تشير أشرطة الخطأ إلى الانحراف المعياري. (E) العد النهائي CFU في القرنيات بورسين المصابة P. aeruginosa PAO1 وP. aeruginosa PA14 لمدة 24 ساعة (ن = 10). القرنيات تم غسلها وقطعها. تشير أشرطة الخطأ إلى الانحراف المعياري. (F) العد النهائي CFU في قرنيات الأرانب المصابة P. aeruginosa PAO1 وP. aeruginosa PA14 لمدة 24 ساعة (ن = 6). القرنيات تم غسلها وقطعها. تشير أشرطة الخطأ إلى الانحراف المعياري. (G) صور من القرنيات البيرسيني السابق المصابة P. aeruginosa PAO1 لمدة 24 ساعة. وقد اصيبت السيطرة ولكن لم يتم اضافة اى بكتيريا . وقد جرحت القرنيات المصابة وأضيف 107 CFU إلى الجانب قطع. لم يتم استرداد أي CFU من القرنية التحكم. (ح) تم استرداد 15000000000000000 (1) النهائي CFU بعد 24 ساعة من العدوى مع P. aeruginosa PAO1 من القرنيات تعامل مع dextran (ن = 2) وتلك التي لا دكستران (ن = 9). القرنيات تم غسلها وقطعها. تشير أشرطة الخطأ إلى الانحراف المعياري. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.