فحص مكتبة shRNA المجمعة لتحديد العوامل التي تعدل النمط الظاهري لمقاومة الأدوية

ظلت الخيارات العلاجية في سرطان الدم النخاعي الحاد (AML) دون تغيير على مدى العقود الخمسة الماضية تقريبا ، مع السيتارابين (AraC) والجمرة الخبيثة كحجر الزاوية لعلاج المرض. أحد التحديات التي تواجه نجاح العلاج AML هو مقاومة الخلايا الجذعية الكروية البيض للعلاج الكيميائي ، مما يؤدي إلى انتكاس المرض ^1,2. يلعب التنظيم اللاجيني دورا حيويا في التسبب في السرطان ومقاومة الأدوية ، وقد ظهرت العديد من العوامل اللاجينية كأهداف علاجية واعدة³،^4،5. تؤثر الآليات التنظيمية اللاجينية على الانتشار والبقاء على قيد الحياة في ظل التعرض المستمر لعقاقير العلاج الكيميائي. وقد أفادت الدراسات التي أجريت على الأورام الخبيثة غير الدموية أن جزءا صغيرا من الخلايا التي تتغلب على تأثير الدواء تخضع لتعديلات جينية مختلفة ، مما يؤدي إلى بقاء تلك الخلايا على قيد الحياة ^6,7. ومع ذلك ، لم يتم استكشاف دور العوامل اللاجينية في التوسط في المقاومة المكتسبة للسيتارابين في AML.

الفحص عالي الإنتاجية هو نهج لاكتشاف الأدوية اكتسب أهمية عالمية بمرور الوقت وأصبح طريقة قياسية في جوانب مختلفة لتحديد الأهداف المحتملة في الآليات الخلوية ، لتوصيف المسار ، وعلى المستوى الجزيئي ^8,9. ينطوي مفهوم الفتك الاصطناعي على التفاعل بين جينين حيث يكون اضطراب أي من الجين وحده قابلا للتطبيق ولكن كلا الجينين في وقت واحد يؤدي إلى فقدان الجدوى¹⁰. يمكن أن يساعد استغلال الفتك الاصطناعي في علاج السرطان في تحديد التفاعلات الجينية القاتلة الاصطناعية القوية وتوصيفها ميكانيكيا¹¹. لقد اعتمدنا نهجا توافقيا لفحص الحمض النووي الريبوزي المرسال عالي الإنتاجية مع الفتك الاصطناعي لتحديد العوامل اللاجينية المسؤولة عن مقاومة السيتارابين المكتسبة في AML.

من المعروف أن سرطان الدم الحاد الناجم عن نقل الكروموسومات لجين سرطان الدم المختلط السلالة (MLL أو KMT2A) يرتبط بضعف البقاء على قيد الحياة لدى المرضى. يمكن للمنتجات الخيمرية الناتجة عن إعادة ترتيب جين MLL ، أي بروتينات اندماج MLL (MLL-FPs) ، تحويل الخلايا الجذعية / السلفية المكونة للدم (HSPCs) إلى انفجارات اللوكيميا بمشاركة عوامل جينية متعددة. تشكل هذه المنظمين اللاجينيين شبكة معقدة تملي الحفاظ على برنامج سرطان الدم ، وبالتالي ، يمكن أن تشكل أهدافا علاجية محتملة. في هذا السياق ، استخدمنا خط الخلايا MV4-11 (الذي يؤوي جين الاندماج MLL MLL-AF4 مع طفرة FLT3-ITD ؛ يطلق عليه MV4-11 P) لتطوير خط الخلايا المقاوم للسيتارابين المكتسب ، والذي يطلق عليه MV4-11 AraC R. تعرض خط الخلية لجرعات متزايدة من السيتارابين مع الشفاء المتقطع من العلاج الدوائي ، والمعروف باسم عطلة المخدرات. تم تقييم التركيز المثبط نصف الأقصى (IC50) عن طريق فحص السمية الخلوية في المختبر .

استخدمنا مكتبة shRNA اللاجينية المجمعة (انظر جدول المواد) التي يقودها مروج hEF1a مع العمود الفقري pZIP lentivirus. تضم هذه المكتبة الحمض النووي الريبوزي المرسال الذي يستهدف 407 عوامل جينية. يحتوي كل عامل على 5-24 shRNAs ، مع ما مجموعه 5,485 shRNAs ، بما في ذلك خمسة shRNAs غير مستهدفة. تم تحسين سقالة "UltrmiR" المعدلة miR-30 من أجل التكوين الحيوي الأولي الفعال ل shRNA والتعبير^12,13.

ويوضح الشكل 1 ألف الخطوط العريضة لهذه التجربة. يركز البروتوكول الحالي على فحص الحمض النووي الريبي باستخدام مكتبة العامل اللاجيني shRNA في خط خلية MV4-11 AraC R (الشكل 1B) ، وهو خط خلية معلقة. يمكن استخدام هذا البروتوكول لفحص أي مكتبة مستهدفة في أي خط خلية مقاوم للأدوية من اختياره. تجدر الإشارة إلى أن بروتوكول النقل سيكون مختلفا بالنسبة للخلايا الملتصقة.

اتبع المبادئ التوجيهية للجنة السلامة الأحيائية المؤسسية (IBSC) واستخدم المرفق المناسب للتعامل مع الفيروس اللئيم (BSL-2). وينبغي تدريب الموظفين تدريبا مناسبا على مناولة الفيروس الخبيث والتخلص منه. يتبع هذا البروتوكول المبادئ التوجيهية للسلامة الأحيائية للكلية الطبية المسيحية في فيلور.

1. اختيار المروج الأكثر فعالية للحصول على تعبير مستمر وطويل الأمد عن shRNAs

ملاحظة: من الضروري إجراء تجربة نقل باستخدام ناقلات الفيروسات الوعائية مع مروجين مختلفين يعبرون عن بروتينات التألق لتحديد المروج الذي يوفر تعبيرا مستقرا وطويل الأجل عن shRNAs في خط الخلية المحدد للتجربة. المروجون الأكثر استخداما لهذا الغرض هم hEF1α (عامل الاستطالة البشري 1α) ، hCMV (الفيروس المضخم للخلايا البشري) ، و SSFV (فيروس تشكيل تركيز الطحال) المروجين الذين يعبرون عن بروتين التألق الأخضر (GFP) (الشكل 2A).

1. قم بإجراء عدد الخلايا باستخدام طريقة استبعاد التربان الأزرق. قم بتعليق خلايا MV4-11 AraC R في وسط RPMI بنسبة 10٪ (RPMI مع 10٪ FBS مكملة ب 100 U / mL penicillin و 100 U / mL streptomycin) تحتوي على 8 ميكروغرام / مل بوليبرين. البذور 1 × 10⁶ خلايا في 1.5 مل من المتوسط / البئر من صفيحة من ستة آبار في ثلاثة أضعاف.
2. أضف كميات مختلفة من فيروسات lentivirus المركزة (على سبيل المثال ، 10 ميكرولتر و 20 ميكرولتر و 40 ميكرولتر اعتمادا على عيار فيروسات lentivirus) إلى كل بئر. قم بتدوير الطبق بلطف لخلط المحتويات.
3. قم بإجراء التصويب عن طريق الطرد المركزي عند 920 × g عند 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة.
4. احتضن الألواح على الفور في حاضنة CO 2 (5٪ CO₂ عند 37 درجة مئوية).
5. راقب تعبير GFP بعد 48 ساعة تحت المجهر الفلوري لضمان النقل الناجح.
6. حدد كميا تعبير GFP عن طريق قياس التدفق الخلوي بعد 72 ساعة لتقييم كفاءة النقل.
7. زراعة الخلايا لمدة 2 أسابيع ومراقبة التعبير GFP بشكل دوري عن طريق قياس التدفق الخلوي. يشير الانخفاض في تعبير GFP الذي يقاس بمتوسط كثافة التألق والنسبة المئوية لخلايا GFP + إلى إسكات المروج.
8. فرز خلايا GFP + في اليوم 10th وزرع الخلايا لمدة أسبوع واحد بعد الفرز. تحقق من تعبير GFP بشكل دوري أثناء الثقافة.
9. استخدم الخلايا غير المحولة لتعيين البوابة. تعتبر الفئة السكانية التي تتجاوز مقياس 1 ×^{10 1} باتجاه اليمين على المحور x مجموعة إيجابية ل GFP.
10. اختر المروج الذي يظهر تعبيرا مستمرا عن GFP في الثقافة المطولة للخلايا.

2. إعداد مكتبة العامل اللاجيني البشري المجمعة للفيروسات الوراثية shRNA

1. زراعة 293T الخلايا (في عدد مرور منخفض مع معدل انتشار جيد) في ثلاثة أطباق زراعة الخلايا 10 سم مع 8 مل من 10٪ DMEM المتوسطة (DMEM مع 10٪ FBS تحتوي على 100 U / مل البنسلين و 100 U / مل الستربتومايسين) في كل طبق.
2. بمجرد أن تصل الخلايا إلى التقاء بنسبة 60٪ ، استبدل الوسط بوسط كامل.
3. قم بإعداد مزيج النقل (كما هو موضح في الجدول 1) الذي يحتوي على وسط خال من المصل ، وعبوة فيروسية (psPAX2) وبلازميد مغلف (pMD2.G) ، وبلازميدات مكتبة مجمعة ، وأخيرا كاشف النقل.
4. اضغط على الخليط لمزجه جيدا واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
5. أضف خليط النقل إلى خلايا 293T واخلطه بلطف عن طريق تدوير الأطباق. احتضان الألواح في حاضنة CO 2 (5٪ CO₂ عند 37 درجة مئوية). تغيير الوسط بعد 24 ساعة.
6. بعد 48 ساعة، تحقق من تعبير GFP تحت المجهر الفلوري لضمان كفاءة نقل عالية في الخلايا التائية 293T.
7. جمع supernatants الفيروس بعد 48 ساعة و 60 ساعة و 72 ساعة وتخزينها في 4 درجات مئوية. أضف وسطا طازجا (8 مل) في كل نقطة زمنية بعد جمع الفيروس.
8. تجمع الخارقين الفيروس. سيكون الحجم الإجمالي للفيروسات المجمعة: ~ 8 مل / لوحة × 3 مجموعات = ~ 24 مل / لوحة. ~ 24 مل / لوحة × 3 لوحات = ~ 72 مل من 3 لوحات.
9. قم بتصفية الفيروسات المجمعة باستخدام مرشح 0.4 ميكرومتر.
10. للحصول على عيار عال من الفيروسات ، ركز الفيروسات المجمعة عن طريق الطرد المركزي الفائق. انقل المضاد للفيروسات المصفى إلى أنبوبين 70 Ti (32 مل / أنبوب) وأجهزة طرد مركزي عند 18000× g لمدة 2 ساعة مع تسارع بطيء وتباطؤ. استخدم الدوار وأجهزة الطرد المركزي المبردة مسبقا إلى 4 درجات مئوية.
11. أخرج الأنابيب من جهاز الطرد المركزي بلطف وقم بإزالة السوبرنات تماما.
12. باستخدام ماصة دقيقة ، أعد تعليق الكريات بلطف في 400 ميكرولتر من DMEM (بدون FBS والمضادات الحيوية). احتضن على الجليد لمدة 1 ساعة واخلط الكريات من كلا الأنبوبين.
13. Aliquot الفيروسات وتجميدها عند -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: يجب إبقاء الأنابيب والفيروسات على الجليد خلال الخطوات 2.10.-2.13. تجنب الزبد أثناء تعليق الفيروس باستخدام الوسط العادي. يجب الحفاظ على الوسط عند 4 درجات مئوية.
14. احسب تركيز (x) للفيروس على النحو التالي:
    الحجم الكلي قبل التركيز = 72 مل (72000 ميكرولتر)
    الحجم بعد التركيز = 400 ميكرولتر
    التركيز = 72000/400= 180x

3. تقدير كفاءة نقل الفيروسات اللينتي

1. قم بتحويل الخلايا التائية 293T مع الفيروس المركز في أحجام مختلفة (2 ميكرولتر ، 4 ميكرولتر ، 8 ميكرولتر) لتأكيد التحضير الناجح للفيروسات اللينتي.
   ملاحظة: إذا أظهرت الفيروسات المركزة كفاءة نقل عالية (>50٪) بكميات صغيرة (1-2 ميكرولتر) ، فمن المستحسن تخفيف الفيروس المركز بالكميات المطلوبة (100x إلى 75x).
2. قم بتخفيف الفيروس المركز إلى 100x باستخدام DMEM (بدون FBS والمضادات الحيوية) لإجراء تجارب المعايرة بالتحليل الحجمي في خط خلايا MV4-11 AraC R.
3. البذور 1 × 10⁶ خلايا (خط خلية MV4-11 AraC R في 1.5 مل من 10٪ RPMI وسط يحتوي على 8 ميكروغرام / مل بوليبرين) في بئر واحد من صفيحة من ستة آبار. إعداد أربعة آبار للتحويل مع كميات مختلفة من الفيروسات.
4. أضف أربعة أحجام مختلفة (على سبيل المثال، 1 ميكرولتر و1.5 ميكرولتر و2 ميكرولتر و2.5 ميكرولتر) من 100x فيروسات.
5. قم بإجراء التطهير عن طريق الطرد المركزي للصفيحة عند 920 × g لمدة 90 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
6. بعد 72 ساعة ، قم بقياس النسبة المئوية لخلايا GFP + عن طريق قياس التدفق الخلوي.
7. تحديد حجم الفيروسات للحصول على كفاءة نقل 30٪. هذه الكفاءة المنخفضة في النقل هي ضمان تكامل shRNA واحد لكل خلية.

4. نقل مكتبة الحمض النووي الريبوزي المرسال اللاجيني المجمعة في خط الخلايا المقاومة للأدوية

1. حافظ على خط الخلية المستهدفة MV4-11 AraC R بكثافة 0.5 × 10⁶ خلايا/مل. تأكد من أن الخلايا في مرحلة النمو الأسي في الثقافة.
2. احسب عدد الخلايا التي سيتم أخذها للتجربة على النحو التالي بناء على عدد التكاملات الفيروسية.
   عدد الخلايا المطلوبة للنقل = 5,485 (عدد shRNAs) × 500 (تمثيل shRNA للطي) / 0.25 (MOI) = 10,982,000 ~ 11 × 10⁶ خلايا
3. أعد تعليق 1.1 × 10⁷ خلايا في 16 مل من 10٪ RPMI متوسط.
4. يضاف البولي برين (8 ميكروغرام/مل) ويخلط جيدا. ثم أضف الحجم المطلوب من الفيروسات للحصول على كفاءة نقل بنسبة 30٪ كما تم حسابها في القسم السابق.
5. زرع جميع الخلايا على صفيحة من ستة آبار بكثافة 1 × 10⁶ خلايا / 1.5 مل من 10٪ RPMI متوسطة لكل بئر.
6. جهاز الطرد المركزي للصفيحة لمدة 90 دقيقة عند 920 × جم عند 37 درجة مئوية.
7. احتضن اللوحة بين عشية وضحاها في حاضنة CO 2 (5٪ CO₂ عند 37 درجة مئوية).
8. بعد 24 ساعة ، قم بتغيير الوسط ونقل الخلايا المحولة إلى قارورة T-75.
9. بعد 48 ساعة ، تحقق من GFP تحت المجهر الفلوري لضمان النقل الناجح.
10. بعد 72 ساعة ، قم بقياس النسبة المئوية لخلايا GFP + عن طريق قياس التدفق الخلوي.

5. إثراء الخلايا الإيجابية GFP

ملاحظة: قم بتوسيع الخلايا المحولة عن طريق زراعتها بكثافة 0.5 × 10⁶ خلايا / مل لمدة 5-7 أيام. هذه الخلايا عبارة عن مجموعة مختلطة من المحولة وغير المنقولة ، والتي يتم اختيارها بناء على GFP عن طريق الفرز ، كما هو مذكور في الخطوة التالية.

1. قم بإجراء فرز التدفق للخلايا المحولة GFP+ مع تعيين إعدادات فرز التدفق على أنها عالية النقاء وإنتاجية منخفضة. استخدم الخلايا غير المحولة لتعيين البوابة. يعتبر السكان الذين يتجاوزون 1 × 10² نحو اليمين مجموعة سكانية إيجابية.
2. اجمع الخلايا التي تم فرزها في RPMI بنسبة 5٪ (RPMI مع 5٪ FBS مكملة ب 100 U / mL البنسلين و 100 U / mL streptomycin).
3. استزرع الخلايا التي تم فرزها في وسط RPMI بنسبة 10٪.
4. بعد 72 ساعة ، قم بإجراء تقدير ما بعد الفرز للنسبة المئوية لخلايا GFP + لضمان كفاءة فرز >95٪.
   ملاحظة: تأكد من الحصول على ~ 3-5 × 10⁶ GFP الخلايا الموجبة بعد الفرز للحصول على تمثيل 450x إلى ~ 500x لمكتبة shRNA.

6. فحص التسرب لتحديد العوامل اللاجينية التي تتوسط في مقاومة الأدوية

1. استزرع مكتبة shRNA الخلايا المنقولة في 10٪ RPMI لمدة تصل إلى 5 أيام. حفظ الخلايا المحولة بالتبريد للتجارب المستقبلية، إذا لزم الأمر، قبل العلاج بالعقاقير.
2. جهاز طرد مركزي 1 × 10⁷ خلايا في نسختين عند 280 × جم لمدة 5 دقائق عند 25 درجة مئوية. تخلص من السوبرناتانت، وخزن الكريات عند -80 درجة مئوية. وستكون هذه العينات بمثابة مرجع أساسي لمكتبة الحمض النووي الريبوزي المرسال اللاجيني.
3. قم بزراعة الخلايا المحولة المتبقية كتكرارات (R1 و R2) ، يتم الاحتفاظ بكل منها في عدد الخلايا الذي يوفر تمثيلا 500x للمكتبة.
4. علاج واحد من التكرارات مع المخدرات (10 ميكرومتر سيتارابين) (R2) والآخر دون العلاج من تعاطي المخدرات (R1).
5. تغيير الوسط للقوارير مع وبدون الدواء كل 72 ساعة. كرر التغيير المتوسط 3x للتعرض التراكمي للدواء لمدة 9 أيام.
6. بعد 9 أيام من العلاج بالعقاقير ، تحقق من جدوى الخلايا بطريقة استبعاد التربان الأزرق.
7. الطرد المركزي للخلايا المتبقية عند 280 × g لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. أعد تعليق الخلايا في PBS معقمة واغسل الخلايا. جهاز طرد مركزي عند 280 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
8. تخلص من السوبرناتانت وخزن الكريات عند -80 درجة مئوية لاستخراج الحمض النووي.

7. تضخيم shRNAs المتكاملة بواسطة PCR

1. استخراج الحمض النووي من خلايا خط الأساس المحولة (T) (الخطوة 6.2.) والخلايا المعالجة بالدواء (R2) وغير المعالجة بالدواء (R1).
2. تحقق من تركيز العينة باستخدام مقياس الفلورومتر.
3. احسب كمية الحمض النووي المطلوبة ل PCR على النحو التالي:
   5,485 (رقم. من shRNAs) × 500 (تمثيل shRNA) × 1 × 6.6⁻¹² (جينوم g/ثنائي الصبغيات) = 15 ميكروغرام من الحمض النووي
4. إخضاع العينات للجولة الأولى من تفاعل البوليميراز المتسلسل.
   ملاحظة: يبين الجدول 2 خليط تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) مع ظروف الدورة الحرارية. وترد تفاصيل المواد الأولية في الجدول التكميلي 1.
5. قم بإعداد تفاعلات متعددة تحتوي على 850 نانوغرام من الحمض النووي لكل أنبوب (لما مجموعه 43 تفاعلا).
   ملاحظة: تعمل الجولة الأولى من تفاعل البوليميراز المتسلسل على تضخيم المناطق المحيطة بالحمض النووي الريبوزي المرسال مما يؤدي إلى حجم أمبليكون يبلغ 397 نقطة أساس.
6. قم بتجميع منتجات PCR وتنقية منتجات PCR باستخدام 3-4 أعمدة من مجموعة تنقية هلام / PCR قياسية.
   ملاحظة: ترد التفاصيل في الجدول 3.
7. قم بإخراج المنتج في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت من كل عمود وقم بتجميع الألويات.
8. حدد كمية الحمض النووي وخزنه عند -20 درجة مئوية.
   ملاحظة: يتم جدولة الكواشف في الجدول 4 مع ظروف الدوار الحراري. يستخدم PCR من الجولة الثانية الاشعال مع تسلسل INDEX المطلوب لتعدد الإرسال في NGS في خلية أحادية التدفق. لذلك ، يجب وضع علامة على كل عينة بفهرس مختلف. وترد تسلسلات التمهيدي في الجدول التكميلي 1.
9. قم بإعداد أربعة تفاعلات ب 500 نانوغرام من ناتج تفاعل البوليميراز المتسلسل الأساسي في حجم تفاعل إجمالي قدره 50 ميكرولتر لكل عينة والتحكم السلبي.
10. قم بتحميل المنتج بالكامل للرحلان الكهربائي باستخدام 2٪ من جل الأغاروز TBE وتأكد من حجم النطاق باستخدام سلم جزيئي 1 كيلو بايت. حجم الأمبليكون هو 399 نقطة أساس.
11. تصور منتجات PCR على نظام توثيق الهلام.
12. قم بقص الشريط المحدد وتنقيته باستخدام مجموعة تنقية الهلام.
    ملاحظة: ترد في الجدول 3 حسابات التنقية باستخدام المجموعة.
13. الألوت في حجم نهائي من 30 ميكرولتر من المخزن المؤقت للاستخراج. سيكون التركيز التقريبي لكل إيلونت حوالي 80-90 نانوغرام / ميكرولتر بحجم إجمالي قدره 30 ميكرولتر.

8. الجيل التالي من التسلسل وتحليل البيانات

1. تسلسل المنتج المنقى بالجل من الخطوة 7.13. على جهاز تسلسل من الجيل التالي (على سبيل المثال، Illumina) للحصول على عدد القراءات ل shRNAs المستنفدة.
2. قم بقص تسلسلات المحولات لقراءات FastQ التي تم إنشاؤها باستخدام مجموعة أدوات Fastx (الإصدار 0.7).
3. قم بمحاذاة القراءات المصفاة إلى تسلسلات مرجعية باستخدام محاذاة Bowtie مع معلمة السماح بعدم تطابق اثنين. تأكد من أن طول القراءة بعد تشذيب المحول حوالي 21 نقطة أساس.
4. تحميل الملفات باستخدام برنامج Samtools (الإصدار 1.9). استخدم خيار Flagstat واحسب ملخص المحاذاة.
5. قم بتحميل ملفات fastQ المشذبة في برنامج CRISPRCloud2 (CC2) (https://crispr.nrihub.org/) جنبا إلى جنب مع تسلسلات shRNA المرجعية في شكل ملفات FASTA وقم بإجراء التحليل وفقا للتعليمات.
   1. انقر فوق الارتباط بدء التحليل في CC2.
   2. حدد نوع الشاشة كشاشتي البقاء على قيد الحياة والتسرب. قم بتعيين عدد المجموعات واكتب اسم كل مجموعة.
   3. قم بتحميل المكتبة المرجعية بتنسيق ملف FASTA. تتم معالجة البيانات التي تم تحميلها. انقر على عنوان URL للإخراج للحصول على النتائج.
      ملاحظة: يستخدم هذا البرنامج نموذج بيتا ذو الحدين مع اختبار t المعدل للطالب لقياس الاختلافات في مستويات sgRNA / shRNA ، يليه اختبار الاحتمال المشترك لفيشر لتقدير أهمية مستوى الجين. وهو يحسب التغيرات الإجمالية المقدرة في السجل₂ أضعاف (Log2Fc) من shRNAs للعوامل اللاجينية بين العينات المعالجة (المخصبة / المستنفدة) والعينات غير المعالجة (خط الأساس) مع "قيم p" و "قيم FDR".
6. تأكد من أن قيمة FDR هي "سلبية" لشاشة التسرب و "إيجابية" لشاشة البقاء على قيد الحياة.
   ملاحظة: CC2 هي منصة تحليل لحساب القراءات وحساب تمثيل الطية (التخصيب أو النضوب) ل shRNAs بين العينات.
7. تحديد الحمض النووي الريبوزي المرسال المخصب والمستنفد بشكل كبير (FDR <0.05) من نتائج CC2.
   ملاحظة: هناك 5-24 shRNAs ضد كل عامل. تحقق من قيم FDR لكل من shRNAs ؛ النظر في FDR ، وهو <0.01 ، واتخاذ متوسط ل shRNAs المختارة. النظر في أعلى 40 ضربات. ارسم الرسم البياني للعوامل المحددة استنادا إلى القيم السالبة Log2Fc أو FDR. تأكد من أن shRNAs غير المستهدفة لديها أيضا قيم FDR كبيرة لضمان صحة البيانات لأنها تعمل كأنظمة shRNA للسيطرة.

ويبين الشكل 1 ألف سير عمل الفحص العام. كشفت السمية الخلوية في المختبر ل MV4-11 AraC R (48 ساعة) أن IC50 إلى cytarabine في MV4-11 AraC R أعلى من MV4-11 P (الشكل 1B). تم استخدام هذا الخط الخلوي في الدراسة كنموذج لفحص العوامل اللاجينية المسؤولة عن مقاومة السيتارابين.

يوضح الشكل 2A خرائط ناقلات pZIP الخطية مع ثلاثة مروجين مختلفين: hEF1α (عامل الاستطالة البشرية 1α) ، hCMV (الفيروس المضخم للخلايا البشري) ، و SSFV (فيروس تكوين تركيز الطحال) ، مع shRNA المخفوق داخل تسلسل UltramiR. يوضح الشكل 2B خريطة متجه pZIP المستخدمة في تجربة المكتبة و shRNA التي تستهدف العامل اللاجيني مع Zsgreen و puromycin كعلامة قابلة للاختيار يقودها مروج hEF1a. تم استخدام هذه المتجهات في اختيار تجربة المروج الأكثر فعالية.

يوضح الشكل 3 اختيار المروج الأكثر فعالية للحصول على تعبير متسق وطويل الأمد في الخلايا المستهدفة. أظهر التقدير الكمي ل GFP الذي تم قياسه بواسطة MFI كفاءة نقل أكثر من 90٪ في نهاية 72 ساعة في MV4-11 AraC R لجميع المروجين الثلاثة. يظهر الرسم البياني لتعبير GFP مجموعة غير متجانسة ل hCMV ولكنها متجانسة في حالة hEF1a و SFFV في اليوم 3 من النقل (الشكل 3A). يوضح الرسم البياني الشريطي تعبير GFP المدفوع من قبل ثلاثة مروجين مختلفين (hEF1α و hCMV و SFFV) في اليوم الثالث من النقل في MV4-11 AraC R (الشكل 3B). أظهر GFP المدفوع ب SFFV انخفاضا في MFI في اليوم 5 من النقل (الشكل 3C). لم يلاحظ أي انخفاض في MFI في فرز ما بعد الخط الأبوي MV4-11 المدفوع ب hEF1a. وهكذا ، تم تحديد مروج hEF1a كمروج مناسب لخط الخلية (الشكل 3D).

يوضح الشكل 4A كفاءة نقل بلازميدات مكتبة shRNA المجمعة في خلايا 293T بعد 48 ساعة من النقل. كان تعبير GFP ساطعا ، مما يشير إلى كفاءة نقل جيدة. بعد جمع الفيروس ، تم فحص كفاءة نقل الفيروس المجمع المحضر في خلايا 293T بثلاثة تركيزات مختلفة (2 ميكرولتر و 4 ميكرولتر و 8 ميكرولتر). لاحظنا أنه حتى فيروس 2 ميكرولتر أدى إلى نفس كفاءة فيروس 8 ميكرولتر ، مما يؤكد ارتفاع عيار الفيروسية (الشكل 4B).

يوضح الشكل 5 نقل المكتبة المجمعة في خط خلية MV4-11 AraC R وتحديد عيار lentivirus. تم تخفيف فيروس lentivirus مكتبة shRNA المجمع 100x ثم تمت إضافته إلى خط خلية MV4-11 AraC R في أحجام مختلفة (1 ميكرولتر و 1.5 ميكرولتر و 2 ميكرولتر و 2.5 ميكرولتر). تم فحص الكفاءة في نهاية 72 ساعة. كانت كفاءة النقل 30٪ ل 2-2.5 ميكرولتر من الفيروس ، مما يؤكد تكامل shRNA واحد لكل خلية (الشكل 5A). أدى النقل مع 2.5 ميكرولتر من فيروس المكتبة المجمعة في خلايا 1.1 × 107 MV4-11 AraC R إلى كفاءة نقل بنسبة 30٪. تم فرز الخلايا الموجبة GFP ، والتي تمثل مكتبة shRNA المجمعة (الشكل 5B).

بعد نقل فيروس lentivirus اللاجيني shRNA المجمع في خط خلايا MV4-11 AraC R ، تم فرز الخلايا الإيجابية GFP في اليوم 5 أو اليوم 7 (الشكل 6). تعرضت هذه الخلايا المصنفة للتعرض لفترات طويلة للسيتارابين لمدة 9 أيام. تم التحقق من الجدوى في اليوم 9th ، وتم جمع الخلايا للحمض النووي. (الشكل 6 ألف). يوضح الرسم البياني الشريطي الانخفاض في معدل انتشار الخلايا المحولة في وجود السيتارابين (الشكل 6B).

وخضع الحمض النووي المستخرج من العينات لجولتين من تفاعل البوليميراز المتسلسل، ومثل المنتج النهائي للهلام المخصب الحمض النووي الريبوزي المرسال المخصب الذي تم تحديده كميا بواسطة NGS. يوضح الشكل 7A مناطق ربط التمهيدي المستخدمة في الجولة 1 و 2 من PCR ، حيث ترتبط الاشعال المستديرة 1st بالمناطق المحيطة ب shRNA المدمج ، ويرتبط التمهيدي الأمامي 2nd بتسلسل الحلقة. يرتبط التمهيدي العكسي بمنطقة من المتجه المضخم في الجولة 1 من PCR. يوضح الشكل 7B والشكل 7C حجم النطاق لمنتج PCR في نهاية 1st (397 bp) و 2nd round PCR (399 bp) ، والتي تم التخلص منها وتنقيتها وتقديمها لتحليل NGS.

بعد إخضاع الحمض النووي لإجراء قياسي لمراقبة الجودة ، تمت معالجة العينات لتحليل NGS. استخدمنا CRISPRCloud2 ، وهي منصة تحليل سهلة الاستخدام وقائمة على السحابة لتحديد shRNAs المخصبة والمستنفدة في فحص shRNA المجمع. يوضح الشكل 8 تمثيل الحمض النووي الريبوزي المرسال المخصب أو المستنفد الذي يستهدف العوامل اللاجينية التي يمكن أن تتوسط في مقاومة السيتارابين في AML.

الشكل 1: الخطوط العريضة ونموذج الدراسة . (أ) توضيح نظرة عامة على سير العمل. (ب) الخلايا الأبوية MV4-11 والخلايا المقاومة ل AraC المعالجة بتركيزات سيتارابين متزايدة (0.1 ميكرومتر إلى 1000 ميكرومتر) وتقييمها من خلال فحص MTT. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2. رسم توضيحي للمتجهات الخطية. (أ) خرائط النواقل الثلاثة مع ثلاثة مروجين مختلفين ، hEF1α (عامل الاستطالة البشرية 1α) ، hCMV (الفيروس المضخم للخلايا البشرية) ، و SSFV (فيروس تشكيل تركيز الطحال) ، مع shRNA المخفوق داخل تسلسل UltramiR. (ب) رسم توضيحي لخريطة المتجهات المستخدمة في تجربة المكتبة مع مروج hEF1α والحمض النووي الريبوزي المرسال (shRNA) الذي يستهدف العامل اللاجيني باستخدام Zsgreen و puromycin كعلامة قابلة للاختيار. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: اختيار المروج الأكثر فعالية للحصول على تعبير مستمر وطويل الأمد عن shRNAs . (أ) مخططات تدفق تمثيلية ل GFP تم تحديدها كميا بواسطة قياس التدفق الخلوي في نهاية 72 ساعة لمروجي hEF1a و hCMV و SFFV. يظهر hCMV ذروة غير متجانسة ، بينما يظهر hEF1a و SFFV ذروة متجانسة واحدة. (ب) كفاءة المروج في خط الخلايا MV4-11 AraC R. (ج) يظهر GFP المدفوع ب SFFV إسكات GFP في الثقافة الطويلة. (د) تظهر خلايا GFP المدفوعة ب hEF1a تعبيرا مستمرا بعد فرز الخلايا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: التحقق من كفاءة فيروس shRNA lentivirus المجمع المحضر . (A) تظهر صور الفحص المجهري الفلوري كفاءة نقل مكتبة shRNA المجمعة التي تم نقلها في 293T في نهاية 48 ساعة باستخدام تكبير 10x. (ب) تم تقييم كفاءة نقل الفيروس المجمع في 293 خلية تائية ذات أحجام فيروسية مختلفة (2 ميكرولتر و4 ميكرولتر و8 ميكرولتر) باستخدام تكبير 10 أضعاف. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: نقل المكتبة المجمعة في خط الخلية المستهدفة وتحديد العيار الفيروسي اللئيم. (A) MV4-11 AraC R خط الخلايا المنقول بأحجام مختلفة من الفيروس (1μL و 1.5μL و 2μL و 2.5μL). تم فحص الكفاءة في نهاية 72 ساعة (B) نقل فيروس المكتبة المجمعة في 1 × 107 MV4-11 AraC R الخلايا لتحقيق كفاءة نقل 30٪ ، ثم فرز الخلايا الإيجابية GFP. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6: فحص التسرب لتحديد العوامل اللاجينية التي تتوسط في مقاومة الأدوية . (أ) رسم تخطيطي للعلاج الدوائي لإثراء الخلايا المقاومة. تعرضت الخلايا المصابة بالمكتبة للتعرض المطول للسيتارابين لمدة 9 أيام ، تليها التحقق من الجدوى وجمع الخلايا لاستخراج الحمض النووي. (ب) الحد من قابلية البقاء للتعرض المطول للسيتارابين في خطوط الخلايا المقاومة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 7: إعداد الأمبليونات التي تمثل shRNA المتكاملة. (أ) مناطق ربط التمهيدي المستخدمة في الجولة 1 و 2 من PCR ، حيث ترتبط الاشعال المستديرة الأولى بالمناطق المحيطة ب shRNA المدمج ويرتبط التمهيدي الأمامي الثاني بتسلسل الحلقة. يرتبط العكس بمنطقة من منطقة المتجه المضخم في PCR 1st. (ب) رسم توضيحي لحجم نطاق منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل في نهاية الدورة 1 من تفاعل البوليميراز المتسلسل (397 نقطة أساس). (ج) تم التخلص من منتج PCR الدائري 2nd (399bp) وتنقيته وتقديمه ل NGS. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 8: نتائج الفحص في خط خلية AML (خط خلية MV-4-11 Ara-C). بعد إخضاع الحمض النووي لإجراء قياسي لمراقبة الجودة ، تمت معالجة العينات لتحليل NGS. استخدمنا CRISPRCloud2 ، وهي منصة تحليل سهلة الاستخدام وقائمة على السحابة ، لتحديد shRNAs المثرية والمستنفدة في فحص shRNA المجمع.  ويمثل هذا الرقم الحمض النووي الريبوزي المرسال المخصب أو المستنفد الذي يستهدف العوامل اللاجينية التي يمكن أن تتوسط في مقاومة السيتارابين في ابيضاض الدم النقوي الحاد (AML). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: تحضير مزيج البلازميد الانتقالي (حساب لوحة 10 سم) يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 2: خليط تفاعل البوليميراز المتسلسل للجولةالأولى من تفاعل البوليميراز المتسلسل يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 3: حسابات لتنقية منتجات 1st من PCR يرجى النقر هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول 4: خليط تفاعل البوليميراز المتسلسل للجولة الثانية من تفاعل البوليميراز المتسلسل يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

ليس لدى المؤلفين تضارب في المصالح وليس لديهم ما يكشفون عنه.