مقالة منهجية

فحص مكتبة shRNA المجمعة لتحديد العوامل التي تعدل النمط الظاهري لمقاومة الأدوية

2.9K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/63383

⸱

يونيو 17, 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Haematology, Christian Medical College, 2Department of Biotechnology, Thiruvalluvar University, 3Centre for Stem Cell Research, Christian Medical College

في هذه المقالة

ملخص

يمكن أن يكون فحص تداخل الحمض النووي الريبي عالي الإنتاجية (RNAi) باستخدام مجموعة من الحمض النووي الريبوزي المرسال (shRNAs) الفيروسي الوراثي أداة للكشف عن الأهداف القاتلة الاصطناعية ذات الصلة علاجيا في الأورام الخبيثة. نحن نقدم نهج فحص shRNA مجمع للتحقيق في المؤثرات اللاجينية في سرطان الدم النخاعي الحاد (AML).

الملخص

يعد فهم آليات المحرك ذات الصلة سريريا للمقاومة الكيميائية المكتسبة أمرا بالغ الأهمية لتوضيح طرق التحايل على المقاومة وتحسين البقاء على قيد الحياة لدى المرضى الذين يعانون من سرطان الدم النخاعي الحاد (AML). جزء صغير من خلايا اللوكيميا التي تنجو من العلاج الكيميائي لديها حالة جينية متزنة لتحمل إهانة العلاج الكيميائي. يسمح التعرض الإضافي للعلاج الكيميائي لهذه الخلايا الثابتة للأدوية بالوصول إلى حالة جينية ثابتة ، مما يؤدي إلى تغيير التعبير الجيني ، مما يؤدي إلى انتشار هذه المجموعات السكانية المقاومة للأدوية وفي النهاية الانتكاس أو المرض الحراري. لذلك ، فإن تحديد التعديلات اللاجينية التي تتطلب بقاء خلايا اللوكيميا المقاومة للأدوية أمر بالغ الأهمية. نحن نفصل بروتوكولا لتحديد المعدلات اللاجينية التي تتوسط المقاومة للسيتارابين التناظري للنيوكليوزيد (AraC) باستخدام فحص مكتبة shRNA المجمعة في خط خلية AML مقاوم للسيتارابين مكتسب. تتكون المكتبة من 5,485 بنية shRNA تستهدف 407 عوامل جينية بشرية ، مما يسمح بفحص العوامل اللاجينية عالية الإنتاجية.

المقدمة

ظلت الخيارات العلاجية في سرطان الدم النخاعي الحاد (AML) دون تغيير على مدى العقود الخمسة الماضية تقريبا ، مع السيتارابين (AraC) والجمرة الخبيثة كحجر الزاوية لعلاج المرض. أحد التحديات التي تواجه نجاح العلاج AML هو مقاومة الخلايا الجذعية الكروية البيض للعلاج الكيميائي ، مما يؤدي إلى انتكاس المرض 1,2. يلعب التنظيم اللاجيني دورا حيويا في التسبب في السرطان ومقاومة الأدوية ، وقد ظهرت العديد من العوامل اللاجينية كأهداف علاجية واعدة3،4،5. تؤثر الآليات التنظيمية اللاجينية على الانتشار والبقاء على قيد الحياة في ظل التعرض المستمر لعقاقير العلاج الكيميائي. وقد أفادت الدراسات التي أجريت على الأورام الخبيثة غير الدموية أن جزءا صغيرا من الخلايا التي تتغلب على تأثير الدواء تخضع لتعديلات جينية مختلفة ، مما يؤدي إلى بقاء تلك الخلايا على قيد الحياة 6,7. ومع ذلك ، لم يتم استكشاف دور العوامل اللاجينية في التوسط في المقاومة المكتسبة للسيتارابين في AML.

الفحص عالي الإنتاجية هو نهج لاكتشاف الأدوية اكتسب أهمية عالمية بمرور الوقت وأصبح طريقة قياسية في جوانب مختلفة لتحديد الأهداف المحتملة في الآليات الخلوية ، لتوصيف المسار ، وعلى المستوى الجزيئي 8,9. ينطوي مفهوم الفتك الاصطناعي على التفاعل بين جينين حيث يكون اضطراب أي من الجين وحده قابلا للتطبيق ولكن كلا الجينين في وقت واحد يؤدي إلى فقدان الجدوى10. يمكن أن يساعد استغلال الفتك الاصطناعي في علاج السرطان في تحديد التفاعلات الجينية القاتلة الاصطناعية القوية وتوصيفها ميكانيكيا11. لقد اعتمدنا نهجا توافقيا لفحص الحمض النووي الريبوزي المرسال عالي الإنتاجية مع الفتك الاصطناعي لتحديد العوامل اللاجينية المسؤولة عن مقاومة السيتارابين المكتسبة في AML.

من المعروف أن سرطان الدم الحاد الناجم عن نقل الكروموسومات لجين سرطان الدم المختلط السلالة (MLL أو KMT2A) يرتبط بضعف البقاء على قيد الحياة لدى المرضى. يمكن للمنتجات الخيمرية الناتجة عن إعادة ترتيب جين MLL ، أي بروتينات اندماج MLL (MLL-FPs) ، تحويل الخلايا الجذعية / السلفية المكونة للدم (HSPCs) إلى انفجارات اللوكيميا بمشاركة عوامل جينية متعددة. تشكل هذه المنظمين اللاجينيين شبكة معقدة تملي الحفاظ على برنامج سرطان الدم ، وبالتالي ، يمكن أن تشكل أهدافا علاجية محتملة. في هذا السياق ، استخدمنا خط الخلايا MV4-11 (الذي يؤوي جين الاندماج MLL MLL-AF4 مع طفرة FLT3-ITD ؛ يطلق عليه MV4-11 P) لتطوير خط الخلايا المقاوم للسيتارابين المكتسب ، والذي يطلق عليه MV4-11 AraC R. تعرض خط الخلية لجرعات متزايدة من السيتارابين مع الشفاء المتقطع من العلاج الدوائي ، والمعروف باسم عطلة المخدرات. تم تقييم التركيز المثبط نصف الأقصى (IC50) عن طريق فحص السمية الخلوية في المختبر .

استخدمنا مكتبة shRNA اللاجينية المجمعة (انظر جدول المواد) التي يقودها مروج hEF1a مع العمود الفقري pZIP lentivirus. تضم هذه المكتبة الحمض النووي الريبوزي المرسال الذي يستهدف 407 عوامل جينية. يحتوي كل عامل على 5-24 shRNAs ، مع ما مجموعه 5,485 shRNAs ، بما في ذلك خمسة shRNAs غير مستهدفة. تم تحسين سقالة "UltrmiR" المعدلة miR-30 من أجل التكوين الحيوي الأولي الفعال ل shRNA والتعبير12,13.

ويوضح الشكل 1 ألف الخطوط العريضة لهذه التجربة. يركز البروتوكول الحالي على فحص الحمض النووي الريبي باستخدام مكتبة العامل اللاجيني shRNA في خط خلية MV4-11 AraC R (الشكل 1B) ، وهو خط خلية معلقة. يمكن استخدام هذا البروتوكول لفحص أي مكتبة مستهدفة في أي خط خلية مقاوم للأدوية من اختياره. تجدر الإشارة إلى أن بروتوكول النقل سيكون مختلفا بالنسبة للخلايا الملتصقة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

اتبع المبادئ التوجيهية للجنة السلامة الأحيائية المؤسسية (IBSC) واستخدم المرفق المناسب للتعامل مع الفيروس اللئيم (BSL-2). وينبغي تدريب الموظفين تدريبا مناسبا على مناولة الفيروس الخبيث والتخلص منه. يتبع هذا البروتوكول المبادئ التوجيهية للسلامة الأحيائية للكلية الطبية المسيحية في فيلور.

1. اختيار المروج الأكثر فعالية للحصول على تعبير مستمر وطويل الأمد عن shRNAs

ملاحظة: من الضروري إجراء تجربة نقل باستخدام ناقلات الفيروسات الوعائية مع مروجين مختلفين يعبرون عن بروتينات التألق لتحديد المروج الذي يوفر تعبيرا مستقرا وطويل الأجل عن shRNAs في خط الخلية المحدد للتجربة. المروجون الأكثر استخداما لهذا الغرض هم hEF1α (عامل الاستطالة البشري 1α) ، hCMV (الفيروس المضخم للخلايا البشري) ، و SSFV (فيروس تشكيل تركيز الطحال) المروجين الذين يعبرون عن بروتين التألق الأخضر (GFP) (الشكل 2A).

  1. قم بإجراء عدد الخلايا باستخدام طريقة استبعاد التربان الأزرق. قم بتعليق خلايا MV4-11 AraC R في وسط RPMI بنسبة 10٪ (RPMI مع 10٪ FBS مكملة ب 100 U / mL penicillin و 100 U / mL streptomycin) تحتوي على 8 ميكروغرام / مل بوليبرين. البذور 1 × 106 خلايا في 1.5 مل من المتوسط / البئر من صفيحة من ستة آبار في ثلاثة أضعاف.
  2. أضف كميات مختلفة من فيروسات lentivirus المركزة (على سبيل المثال ، 10 ميكرولتر و 20 ميكرولتر و 40 ميكرولتر اعتمادا على عيار فيروسات lentivirus) إلى كل بئر. قم بتدوير الطبق بلطف لخلط المحتويات.
  3. قم بإجراء التصويب عن طريق الطرد المركزي عند 920 × g عند 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة.
  4. احتضن الألواح على الفور في حاضنة CO 2 (5٪ CO2 عند 37 درجة مئوية).
  5. راقب تعبير GFP بعد 48 ساعة تحت المجهر الفلوري لضمان النقل الناجح.
  6. حدد كميا تعبير GFP عن طريق قياس التدفق الخلوي بعد 72 ساعة لتقييم كفاءة النقل.
  7. زراعة الخلايا لمدة 2 أسابيع ومراقبة التعبير GFP بشكل دوري عن طريق قياس التدفق الخلوي. يشير الانخفاض في تعبير GFP الذي يقاس بمتوسط كثافة التألق والنسبة المئوية لخلايا GFP + إلى إسكات المروج.
  8. فرز خلايا GFP + في اليوم 10th وزرع الخلايا لمدة أسبوع واحد بعد الفرز. تحقق من تعبير GFP بشكل دوري أثناء الثقافة.
  9. استخدم الخلايا غير المحولة لتعيين البوابة. تعتبر الفئة السكانية التي تتجاوز مقياس 1 ×10 1 باتجاه اليمين على المحور x مجموعة إيجابية ل GFP.
  10. اختر المروج الذي يظهر تعبيرا مستمرا عن GFP في الثقافة المطولة للخلايا.

2. إعداد مكتبة العامل اللاجيني البشري المجمعة للفيروسات الوراثية shRNA

  1. زراعة 293T الخلايا (في عدد مرور منخفض مع معدل انتشار جيد) في ثلاثة أطباق زراعة الخلايا 10 سم مع 8 مل من 10٪ DMEM المتوسطة (DMEM مع 10٪ FBS تحتوي على 100 U / مل البنسلين و 100 U / مل الستربتومايسين) في كل طبق.
  2. بمجرد أن تصل الخلايا إلى التقاء بنسبة 60٪ ، استبدل الوسط بوسط كامل.
  3. قم بإعداد مزيج النقل (كما هو موضح في الجدول 1) الذي يحتوي على وسط خال من المصل ، وعبوة فيروسية (psPAX2) وبلازميد مغلف (pMD2.G) ، وبلازميدات مكتبة مجمعة ، وأخيرا كاشف النقل.
  4. اضغط على الخليط لمزجه جيدا واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
  5. أضف خليط النقل إلى خلايا 293T واخلطه بلطف عن طريق تدوير الأطباق. احتضان الألواح في حاضنة CO 2 (5٪ CO2 عند 37 درجة مئوية). تغيير الوسط بعد 24 ساعة.
  6. بعد 48 ساعة، تحقق من تعبير GFP تحت المجهر الفلوري لضمان كفاءة نقل عالية في الخلايا التائية 293T.
  7. جمع supernatants الفيروس بعد 48 ساعة و 60 ساعة و 72 ساعة وتخزينها في 4 درجات مئوية. أضف وسطا طازجا (8 مل) في كل نقطة زمنية بعد جمع الفيروس.
  8. تجمع الخارقين الفيروس. سيكون الحجم الإجمالي للفيروسات المجمعة: ~ 8 مل / لوحة × 3 مجموعات = ~ 24 مل / لوحة. ~ 24 مل / لوحة × 3 لوحات = ~ 72 مل من 3 لوحات.
  9. قم بتصفية الفيروسات المجمعة باستخدام مرشح 0.4 ميكرومتر.
  10. للحصول على عيار عال من الفيروسات ، ركز الفيروسات المجمعة عن طريق الطرد المركزي الفائق. انقل المضاد للفيروسات المصفى إلى أنبوبين 70 Ti (32 مل / أنبوب) وأجهزة طرد مركزي عند 18000× g لمدة 2 ساعة مع تسارع بطيء وتباطؤ. استخدم الدوار وأجهزة الطرد المركزي المبردة مسبقا إلى 4 درجات مئوية.
  11. أخرج الأنابيب من جهاز الطرد المركزي بلطف وقم بإزالة السوبرنات تماما.
  12. باستخدام ماصة دقيقة ، أعد تعليق الكريات بلطف في 400 ميكرولتر من DMEM (بدون FBS والمضادات الحيوية). احتضن على الجليد لمدة 1 ساعة واخلط الكريات من كلا الأنبوبين.
  13. Aliquot الفيروسات وتجميدها عند -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: يجب إبقاء الأنابيب والفيروسات على الجليد خلال الخطوات 2.10.-2.13. تجنب الزبد أثناء تعليق الفيروس باستخدام الوسط العادي. يجب الحفاظ على الوسط عند 4 درجات مئوية.
  14. احسب تركيز (x) للفيروس على النحو التالي:
    الحجم الكلي قبل التركيز = 72 مل (72000 ميكرولتر)
    الحجم بعد التركيز = 400 ميكرولتر
    التركيز = 72000/400= 180x

3. تقدير كفاءة نقل الفيروسات اللينتي

  1. قم بتحويل الخلايا التائية 293T مع الفيروس المركز في أحجام مختلفة (2 ميكرولتر ، 4 ميكرولتر ، 8 ميكرولتر) لتأكيد التحضير الناجح للفيروسات اللينتي.
    ملاحظة: إذا أظهرت الفيروسات المركزة كفاءة نقل عالية (>50٪) بكميات صغيرة (1-2 ميكرولتر) ، فمن المستحسن تخفيف الفيروس المركز بالكميات المطلوبة (100x إلى 75x).
  2. قم بتخفيف الفيروس المركز إلى 100x باستخدام DMEM (بدون FBS والمضادات الحيوية) لإجراء تجارب المعايرة بالتحليل الحجمي في خط خلايا MV4-11 AraC R.
  3. البذور 1 × 106 خلايا (خط خلية MV4-11 AraC R في 1.5 مل من 10٪ RPMI وسط يحتوي على 8 ميكروغرام / مل بوليبرين) في بئر واحد من صفيحة من ستة آبار. إعداد أربعة آبار للتحويل مع كميات مختلفة من الفيروسات.
  4. أضف أربعة أحجام مختلفة (على سبيل المثال، 1 ميكرولتر و1.5 ميكرولتر و2 ميكرولتر و2.5 ميكرولتر) من 100x فيروسات.
  5. قم بإجراء التطهير عن طريق الطرد المركزي للصفيحة عند 920 × g لمدة 90 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  6. بعد 72 ساعة ، قم بقياس النسبة المئوية لخلايا GFP + عن طريق قياس التدفق الخلوي.
  7. تحديد حجم الفيروسات للحصول على كفاءة نقل 30٪. هذه الكفاءة المنخفضة في النقل هي ضمان تكامل shRNA واحد لكل خلية.

4. نقل مكتبة الحمض النووي الريبوزي المرسال اللاجيني المجمعة في خط الخلايا المقاومة للأدوية

  1. حافظ على خط الخلية المستهدفة MV4-11 AraC R بكثافة 0.5 × 106 خلايا/مل. تأكد من أن الخلايا في مرحلة النمو الأسي في الثقافة.
  2. احسب عدد الخلايا التي سيتم أخذها للتجربة على النحو التالي بناء على عدد التكاملات الفيروسية.
    عدد الخلايا المطلوبة للنقل = 5,485 (عدد shRNAs) × 500 (تمثيل shRNA للطي) / 0.25 (MOI) = 10,982,000 ~ 11 × 106 خلايا
  3. أعد تعليق 1.1 × 107 خلايا في 16 مل من 10٪ RPMI متوسط.
  4. يضاف البولي برين (8 ميكروغرام/مل) ويخلط جيدا. ثم أضف الحجم المطلوب من الفيروسات للحصول على كفاءة نقل بنسبة 30٪ كما تم حسابها في القسم السابق.
  5. زرع جميع الخلايا على صفيحة من ستة آبار بكثافة 1 × 106 خلايا / 1.5 مل من 10٪ RPMI متوسطة لكل بئر.
  6. جهاز الطرد المركزي للصفيحة لمدة 90 دقيقة عند 920 × جم عند 37 درجة مئوية.
  7. احتضن اللوحة بين عشية وضحاها في حاضنة CO 2 (5٪ CO2 عند 37 درجة مئوية).
  8. بعد 24 ساعة ، قم بتغيير الوسط ونقل الخلايا المحولة إلى قارورة T-75.
  9. بعد 48 ساعة ، تحقق من GFP تحت المجهر الفلوري لضمان النقل الناجح.
  10. بعد 72 ساعة ، قم بقياس النسبة المئوية لخلايا GFP + عن طريق قياس التدفق الخلوي.

5. إثراء الخلايا الإيجابية GFP

ملاحظة: قم بتوسيع الخلايا المحولة عن طريق زراعتها بكثافة 0.5 × 106 خلايا / مل لمدة 5-7 أيام. هذه الخلايا عبارة عن مجموعة مختلطة من المحولة وغير المنقولة ، والتي يتم اختيارها بناء على GFP عن طريق الفرز ، كما هو مذكور في الخطوة التالية.

  1. قم بإجراء فرز التدفق للخلايا المحولة GFP+ مع تعيين إعدادات فرز التدفق على أنها عالية النقاء وإنتاجية منخفضة. استخدم الخلايا غير المحولة لتعيين البوابة. يعتبر السكان الذين يتجاوزون 1 × 102 نحو اليمين مجموعة سكانية إيجابية.
  2. اجمع الخلايا التي تم فرزها في RPMI بنسبة 5٪ (RPMI مع 5٪ FBS مكملة ب 100 U / mL البنسلين و 100 U / mL streptomycin).
  3. استزرع الخلايا التي تم فرزها في وسط RPMI بنسبة 10٪.
  4. بعد 72 ساعة ، قم بإجراء تقدير ما بعد الفرز للنسبة المئوية لخلايا GFP + لضمان كفاءة فرز >95٪.
    ملاحظة: تأكد من الحصول على ~ 3-5 × 106 GFP الخلايا الموجبة بعد الفرز للحصول على تمثيل 450x إلى ~ 500x لمكتبة shRNA.

6. فحص التسرب لتحديد العوامل اللاجينية التي تتوسط في مقاومة الأدوية

  1. استزرع مكتبة shRNA الخلايا المنقولة في 10٪ RPMI لمدة تصل إلى 5 أيام. حفظ الخلايا المحولة بالتبريد للتجارب المستقبلية، إذا لزم الأمر، قبل العلاج بالعقاقير.
  2. جهاز طرد مركزي 1 × 107 خلايا في نسختين عند 280 × جم لمدة 5 دقائق عند 25 درجة مئوية. تخلص من السوبرناتانت، وخزن الكريات عند -80 درجة مئوية. وستكون هذه العينات بمثابة مرجع أساسي لمكتبة الحمض النووي الريبوزي المرسال اللاجيني.
  3. قم بزراعة الخلايا المحولة المتبقية كتكرارات (R1 و R2) ، يتم الاحتفاظ بكل منها في عدد الخلايا الذي يوفر تمثيلا 500x للمكتبة.
  4. علاج واحد من التكرارات مع المخدرات (10 ميكرومتر سيتارابين) (R2) والآخر دون العلاج من تعاطي المخدرات (R1).
  5. تغيير الوسط للقوارير مع وبدون الدواء كل 72 ساعة. كرر التغيير المتوسط 3x للتعرض التراكمي للدواء لمدة 9 أيام.
  6. بعد 9 أيام من العلاج بالعقاقير ، تحقق من جدوى الخلايا بطريقة استبعاد التربان الأزرق.
  7. الطرد المركزي للخلايا المتبقية عند 280 × g لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. أعد تعليق الخلايا في PBS معقمة واغسل الخلايا. جهاز طرد مركزي عند 280 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  8. تخلص من السوبرناتانت وخزن الكريات عند -80 درجة مئوية لاستخراج الحمض النووي.

7. تضخيم shRNAs المتكاملة بواسطة PCR

  1. استخراج الحمض النووي من خلايا خط الأساس المحولة (T) (الخطوة 6.2.) والخلايا المعالجة بالدواء (R2) وغير المعالجة بالدواء (R1).
  2. تحقق من تركيز العينة باستخدام مقياس الفلورومتر.
  3. احسب كمية الحمض النووي المطلوبة ل PCR على النحو التالي:
    5,485 (رقم. من shRNAs) × 500 (تمثيل shRNA) × 1 × 6.6−12 (جينوم g/ثنائي الصبغيات) = 15 ميكروغرام من الحمض النووي
  4. إخضاع العينات للجولة الأولى من تفاعل البوليميراز المتسلسل.
    ملاحظة: يبين الجدول 2 خليط تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) مع ظروف الدورة الحرارية. وترد تفاصيل المواد الأولية في الجدول التكميلي 1.
  5. قم بإعداد تفاعلات متعددة تحتوي على 850 نانوغرام من الحمض النووي لكل أنبوب (لما مجموعه 43 تفاعلا).
    ملاحظة: تعمل الجولة الأولى من تفاعل البوليميراز المتسلسل على تضخيم المناطق المحيطة بالحمض النووي الريبوزي المرسال مما يؤدي إلى حجم أمبليكون يبلغ 397 نقطة أساس.
  6. قم بتجميع منتجات PCR وتنقية منتجات PCR باستخدام 3-4 أعمدة من مجموعة تنقية هلام / PCR قياسية.
    ملاحظة: ترد التفاصيل في الجدول 3.
  7. قم بإخراج المنتج في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت من كل عمود وقم بتجميع الألويات.
  8. حدد كمية الحمض النووي وخزنه عند -20 درجة مئوية.
    ملاحظة: يتم جدولة الكواشف في الجدول 4 مع ظروف الدوار الحراري. يستخدم PCR من الجولة الثانية الاشعال مع تسلسل INDEX المطلوب لتعدد الإرسال في NGS في خلية أحادية التدفق. لذلك ، يجب وضع علامة على كل عينة بفهرس مختلف. وترد تسلسلات التمهيدي في الجدول التكميلي 1.
  9. قم بإعداد أربعة تفاعلات ب 500 نانوغرام من ناتج تفاعل البوليميراز المتسلسل الأساسي في حجم تفاعل إجمالي قدره 50 ميكرولتر لكل عينة والتحكم السلبي.
  10. قم بتحميل المنتج بالكامل للرحلان الكهربائي باستخدام 2٪ من جل الأغاروز TBE وتأكد من حجم النطاق باستخدام سلم جزيئي 1 كيلو بايت. حجم الأمبليكون هو 399 نقطة أساس.
  11. تصور منتجات PCR على نظام توثيق الهلام.
  12. قم بقص الشريط المحدد وتنقيته باستخدام مجموعة تنقية الهلام.
    ملاحظة: ترد في الجدول 3 حسابات التنقية باستخدام المجموعة.
  13. الألوت في حجم نهائي من 30 ميكرولتر من المخزن المؤقت للاستخراج. سيكون التركيز التقريبي لكل إيلونت حوالي 80-90 نانوغرام / ميكرولتر بحجم إجمالي قدره 30 ميكرولتر.

8. الجيل التالي من التسلسل وتحليل البيانات

  1. تسلسل المنتج المنقى بالجل من الخطوة 7.13. على جهاز تسلسل من الجيل التالي (على سبيل المثال، Illumina) للحصول على عدد القراءات ل shRNAs المستنفدة.
  2. قم بقص تسلسلات المحولات لقراءات FastQ التي تم إنشاؤها باستخدام مجموعة أدوات Fastx (الإصدار 0.7).
  3. قم بمحاذاة القراءات المصفاة إلى تسلسلات مرجعية باستخدام محاذاة Bowtie مع معلمة السماح بعدم تطابق اثنين. تأكد من أن طول القراءة بعد تشذيب المحول حوالي 21 نقطة أساس.
  4. تحميل الملفات باستخدام برنامج Samtools (الإصدار 1.9). استخدم خيار Flagstat واحسب ملخص المحاذاة.
  5. قم بتحميل ملفات fastQ المشذبة في برنامج CRISPRCloud2 (CC2) (https://crispr.nrihub.org/) جنبا إلى جنب مع تسلسلات shRNA المرجعية في شكل ملفات FASTA وقم بإجراء التحليل وفقا للتعليمات.
    1. انقر فوق الارتباط بدء التحليل في CC2.
    2. حدد نوع الشاشة كشاشتي البقاء على قيد الحياة والتسرب. قم بتعيين عدد المجموعات واكتب اسم كل مجموعة.
    3. قم بتحميل المكتبة المرجعية بتنسيق ملف FASTA. تتم معالجة البيانات التي تم تحميلها. انقر على عنوان URL للإخراج للحصول على النتائج.
      ملاحظة: يستخدم هذا البرنامج نموذج بيتا ذو الحدين مع اختبار t المعدل للطالب لقياس الاختلافات في مستويات sgRNA / shRNA ، يليه اختبار الاحتمال المشترك لفيشر لتقدير أهمية مستوى الجين. وهو يحسب التغيرات الإجمالية المقدرة في السجل2 أضعاف (Log2Fc) من shRNAs للعوامل اللاجينية بين العينات المعالجة (المخصبة / المستنفدة) والعينات غير المعالجة (خط الأساس) مع "قيم p" و "قيم FDR".
  6. تأكد من أن قيمة FDR هي "سلبية" لشاشة التسرب و "إيجابية" لشاشة البقاء على قيد الحياة.
    ملاحظة: CC2 هي منصة تحليل لحساب القراءات وحساب تمثيل الطية (التخصيب أو النضوب) ل shRNAs بين العينات.
  7. تحديد الحمض النووي الريبوزي المرسال المخصب والمستنفد بشكل كبير (FDR <0.05) من نتائج CC2.
    ملاحظة: هناك 5-24 shRNAs ضد كل عامل. تحقق من قيم FDR لكل من shRNAs ؛ النظر في FDR ، وهو <0.01 ، واتخاذ متوسط ل shRNAs المختارة. النظر في أعلى 40 ضربات. ارسم الرسم البياني للعوامل المحددة استنادا إلى القيم السالبة Log2Fc أو FDR. تأكد من أن shRNAs غير المستهدفة لديها أيضا قيم FDR كبيرة لضمان صحة البيانات لأنها تعمل كأنظمة shRNA للسيطرة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

ويبين الشكل 1 ألف سير عمل الفحص العام. كشفت السمية الخلوية في المختبر ل MV4-11 AraC R (48 ساعة) أن IC50 إلى cytarabine في MV4-11 AraC R أعلى من MV4-11 P (الشكل 1B). تم استخدام هذا الخط الخلوي في الدراسة كنموذج لفحص العوامل اللاجينية المسؤولة عن مقاومة السيتارابين.

يوضح الشكل 2A خرائط ناقلات pZIP الخطية مع ثلاثة مروجين مختلفين: hEF1α (عامل الاستطالة البشرية 1α) ، hCMV (الفيروس الم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يستخدم تداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) على نطاق واسع في دراسات الجينوم الوظيفية، والتي تشمل فحص الحمض النووي الريبوزي المرسال والحمض النووي الريبوزي المرسال. تتمثل فائدة shRNA في أنه يمكن دمجها في ناقلات البلازميد ودمجها في الحمض النووي الجيني ، مما يؤدي إلى تعبير مستقر ، وبالتالي ، ضربة قاضية أطول من الحمض النووي الريبي المرسال المستهدف. يعد فحص مكتبة shRNA المجمعة قويا وفعالا من حيث التكلفة مقارنة بالشاشات المصفوفة التقليدية (siRNA). يمكن أن يكون تحديد أهمية فئة معينة من البروتينات في شاشة على نطاق الجينوم أمرا مرهقا....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين تضارب في المصالح وليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

يتم تمويل هذه الدراسة جزئيا من خلال منحة من إدارة التكنولوجيا الحيوية BT/PR8742/AGR/36/773/2013 إلى SRV ؛ وإدارة التكنولوجيا الحيوية في الهند BT/COE/34/SP13432/2015 ووزارة العلوم والتكنولوجيا في الهند: EMR/2017/003880 إلى P.B. يتم دعم RVS و P.B. من قبل Wellcome DBT India Alliance IA/S/17/1/503118 و IA/S/15/1/501842 ، على التوالي. يتم دعم S.D. من قبل زمالة CSIR-UGC ، ويتم دعم S.I. من قبل زمالة أبحاث ICMR العليا. نشكر Abhirup Bagchi و Sandya Rani وموظفي المرفق الأساسي لقياس التدفق الخلوي CSCR على مساعدتهم. كما نشكر MedGenome Inc. على المساعدة في تسلسل الإنتاجية العالية وتحليل البيانات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي > كواشف < / قوي>
100 نقطة أساس سلم هايبرBIOLINEBIO-33025
1 كيلو بايت سلم هايبرBIOLINEBIO-33056
AgaroseLonza Seachekm50004
بيتين (5 ملم)سيجماB03001VL
حمض البوريكQualigens12005
الأواني البلاستيكية لزراعة الخلاياCorningكسيتوزين قابل
& -D-arabinofuranoside hydrochlorideSigmaC1768-500MG
DMEMMP BIO
DMSOWak Chemie GMBHCryosure DMSO 10ml
EDTASigmaE5134
Ethidium BromideسيجماE1510-10 مل
مصل الأبقار الجنينيثيرمو فيشر 16000044
/ طقم تنقية PCRMACHEREY-NAGELREF  740609.50
Gibco- RPMI 1640Thermo Fisher Scientific23400021
حمض الخليك الجليديThermoQ11007
hCMV GFP PlasmidTransomicsTransOmics اختيار المروج KIT
hEF1a GFPlasmidTransomicsTransOmics اختيار المروج KIT
HEK 293TATCCCRL-11268
خط الخلية HL60ATCCCCL-240
KOD Hot Start Polymerase Merck71086
Molm13 خط الخليةمختبر إلين وايسبرغ ، معهد دانا فاربر للسرطان ، بوسطن ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكيةمعهد دانا فاربر للسرطان ، بوسطن ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية
خط الخلية MV4-11ATCCCRL-9591
البنسلين ستربتومايسينثيرمو فيشر العلمي15140122
psPAX2 و pMD2.GAddgeneAdgene البلازميد رقم 12260 & أمبير بلازميد Addgene رقم 12259
Qubit dsDNA HS Assay KitInvitrogenREF Q32854
SFFV   ؛ GFP PlasmidTransomicsTransOmics اختيار المروج KIT
shERWOOD-UltrmiR مكتبة shRNA من TransomicsTransomicsCat No. TLH UD7409; رقم القطعة: A116. V 132.14
Trans-IT-LTI Mirus Mirusرقم الكتالوج: MIR2300
TrisMP Biomedicals0219485591
Trypan BlueSigma-AldrichT8154-100ML
أنابيب الطرد المركزي UltraBeckman Coulter  103319
<قوي>المعدات< قوي>5
٪ CO2< / sub> حاضنةThermo Fisher
BD Aria III فارز الخلاياBecton Dickinson
Beckman Coulter Optima L-100K- الطرد المركزي الفائقبيكمان كولتر
الطردالمركزي الحراري Multiguge 3SR +
نظام التصوير ChemiDoc ( نظام Fluro Chem M)Fluro Chem
Leica AF600Leica
Light MicroscopeZeiss Axiovert 40c
NanodropThermo Scientific
Qubit 3.0 FluorometerInvitrogen
Thermal CyclerBioRad
سلم سلم للتطبيق 91233354 جل

المراجع

  1. Döhner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D. Acute myeloid leukemia. The New England Journal of Medicine. 373 (12), 1136-1152 (2015).
  2. De Kouchkovsky, I., Abdul-Hay, M. Acute myeloid leukemia: A comprehensive review and 2016 update. Blood Cancer Journal. 6 (7), 441(2016).
  3. Zuber, J., et al. RNAi screen identifies Brd4 as a therapeutic target in acute myeloid leukaemia. Nature. 478 (7370), 524-528 (2011).
  4. Shi, J., et al. The Polycomb complex PRC2 supports aberrant self-renewal in a mouse model of MLL-AF9;NrasG12D acute myeloid leukemia. Oncogene. 32 (7), 930-938 (2013).
  5. Chen, C. -W., et al. DOT1L inhibits SIRT1-mediated epigenetic silencing to maintain leukemic gene expression in MLL-rearranged leukemia. Nature Medicine. 21 (4), 335-343 (2015).
  6. Li, F., et al. In vivo epigenetic CRISPR screen identifies Asf1a as an immunotherapeutic target in Kras-mutant lung adenocarcinoma. Cancer Discovery. 10 (2), 270-287 (2020).
  7. Balch, C., Huang, T. H. -M., Brown, R., Nephew, K. P. The epigenetics of ovarian cancer drug resistance and resensitization. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 191 (5), 1552-1572 (2004).
  8. Carnero, A. High throughput screening in drug discovery. Clinical and Translational Oncology. 8 (7), 482-490 (2006).
  9. Lal-Nag, M., et al. A high-throughput screening model of the tumor microenvironment for ovarian cancer cell growth. SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R & D. 22 (5), 494-506 (2017).
  10. O'Neil, N. J., Bailey, M. L., Hieter, P. Synthetic lethality and cancer. Nature Reviews Genetics. 18 (10), 613-623 (2017).
  11. Hoffman, G. R., et al. Functional epigenetics approach identifies BRM/SMARCA2 as a critical synthetic lethal target in BRG1-deficient cancers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (8), 3128-3133 (2014).
  12. Fellmann, C., et al. An optimized microRNA backbone for effective single-copy RNAi. Cell Reports. 5 (6), 1704-1713 (2013).
  13. Knott, S. R. V., et al. A computational algorithm to predict shRNA potency. Molecular Cell. 56 (6), 796-807 (2014).
  14. Papaemmanuil, E., et al. Genomic classification and prognosis in acute myeloid leukemia. New England Journal of Medicine. 374 (23), 2209-2221 (2016).
  15. Vidal, S. J., Rodriguez-Bravo, V., Galsky, M., Cordon-Cardo, C., Domingo-Domenech, J. Targeting cancer stem cells to suppress acquired chemotherapy resistance. Oncogene. 33 (36), 4451-4463 (2014).
  16. Evers, B., et al. CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة