الاستئصال بالليزر المستهدف في جنين السكرينا لاتيسيما

تم استخدام الاستئصال بالليزر لعقود لدراسة تطور الجنين. إن تشعيع خلايا الجنين بشعاع ليزر يجعل من الممكن مراقبة إمكانات التجدد وتعديل سلالة الخلية أثناء تكوين الجنين والتحقيق في تأثير الاستئصال المستهدف على انقسام الخلايا ومصير الخلية. الكائنات الحية النموذجية المستخدمة في طرق الاستئصال بالليزر هي عادة ، مثل الحشرات ^1,2 ، والديدان الخيطية^3,4 ، والفقاريات^5,6 ، وأحيانا النباتات ^7,8. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام نهج الاستئصال الدقيق بالليزر على الطحالب البنية Fucus في عامي 1994 و 1998 لإثبات دور جدار الخلية في الاستقطاب الضوئي للجنين المبكر ^9,10.

تنتمي الطحالب البنية إلى مجموعة Stramenopiles ، التي تباعدت في جذر شجرة حقيقية النواة منذ 1.6 مليار سنة. ونتيجة لذلك ، فهي مستقلة من الناحية الفيلولوجية عن الكائنات الحية متعددة الخلايا الأخرى ، مثل الحيوانات والنباتات¹¹. ينتمي Saccharina latissima إلى رتبة Laminariales ، والمعروفة أكثر باسم عشب البحر ، وهي من بين أكبر الكائنات الحية على وجه الأرض ، حيث تصل أحجامها إلى أكثر من 30 مترا. Saccharina sp. هي أعشاب بحرية كبيرة تستخدم للعديد من التطبيقات مثل الأغذية والأعلاف ، ويتم استخراج السكريات المتعددة لاستخدامها في الصناعات الزراعية والدوائية والتجميلية في جميع أنحاء العالم^{12 ، 13}. وتتطلب زراعته، وخاصة في آسيا ومؤخرا في أوروبا، إعداد الأجنة في المفرخات قبل إطلاق الأحداث في البحر المفتوح. مثل جميع عشب البحر ، لديها دورة حياة ثنائية الطور تتكون من مرحلة أمشاج مجهرية ، تنمو خلالها أمشاج فردية وتنتج أمشاج للإخصاب ، ومرحلة بوغية مجهرية ثنائية الصبغيات ، حيث تتطور شفرة مستوية كبيرة من ثباتها المرتبط بقاع البحر أو الصخور. يطلق البوغي جراثيم فردية عند النضج ، وبالتالي يكمل دورة الحياة 14،^15،16.

يقدم S. latissima بعض الميزات المورفولوجية المثيرة للاهتمام¹⁷. يتطور جنينها كورقة مستوية أحادية الطبقات¹⁵،^18،19 قبل الحصول على بنية متعددة الطبقات تتزامن مع ظهور أنواع مختلفة من الأنسجة. بالإضافة إلى ذلك ، Laminariales هي واحدة من الأصناف الوحيدة من الطحالب البنية التي تظل أجنتها مرتبطة بأنسجتها الأمومية (Desmarestiales و Sporochnales تفعل¹⁵ أيضا). توفر هذه الميزة الفرصة لدراسة دور أنسجة الأمهات في هذه العملية التنموية ومقارنة آليات مراقبة الأم في الطحالب البنية مع تلك الموجودة في الحيوانات والنباتات.

تقدم هذه المقالة أول بروتوكول كامل للاستئصال بالليزر في جنين عشب البحر المبكر. ينتج عن هذا البروتوكول الذي يتضمن تقنية نبضات الأشعة فوق البنفسجية NS تدميرا محددا لخلايا الجنين الفردية لدراسة أدوار كل منها أثناء تكوين الجنين. يوفر هذا الإجراء نهجا موثوقا به للتحقيق في تفاعلات الخلايا ومصير الخلايا أثناء التكوين الجنيني في Laminariales.

1. إنتاج Saccharina latissima gametophytes

1. جمع النباتات البوغية الناضجة من S. latissima من البرية كما هو موضح سابقا^20,21. تأكد من أن النباتات البوغية المختارة خالية من النباتات النباتية (الكائنات الحية الصغيرة المرئية على سطح الشفرة) أو الطفيليات الداخلية (الموجودة في المناطق المبيضة أو البقع على الشفرة).
2. باستخدام مشرط ، قم بقطع الجزء الأكثر قتامة في وسط الشفرة (الأنسجة المنتجة للبوغ الخصيب²²) إلى 1-5 قطع مربعة (1 سم مربع) ، وتجنب أي بقع مبيضة ، إن وجدت.
3. قم بإزالة أي نباتات متبقية عن طريق تنظيف القطع المقطوعة بلطف باستخدام الجزء الخلفي من مشرط وبعض الورق الماص.
4. ضع القطع النظيفة في طبق زجاجي مملوء بمياه البحر الطبيعية المعقمة (انظر جدول المواد) لمدة 45 دقيقة لإطلاق الجراثيم بعد التقرير²² المنشور سابقا.
5. قم بإزالة قطع الشفرة وتصفية مياه البحر من خلال مصفاة خلايا 40 ميكرومتر لإزالة الحطام أو الكائنات الحية غير المرغوب فيها.
6. تمييع الجراثيم في الترشيح إلى تركيز 20-40 جراثيم / مل في أطباق بتري البلاستيكية²².
7. ضع محلول البوغ في خزانة استزراع (انظر جدول المواد) تم تكوينها مع ظروف الاستزراع المثلى (13 درجة مئوية ، 24 μE.m-2.s-1 ، الفترة الضوئية 16: 8 L: D).
8. اسمح للجراثيم أن تنبت وتتطور إلى نباتات مشيمة.
   ملاحظة: إنبات بوغ مرئي بعد 2 أيام في الخزانة ، وعادة ما يحدث الانقسام الخلوي الأول للخلايا الأمشاج خلال 48 ساعة التالية.
9. استبدل وسط النمو بعد 5 أيام بمياه البحر الطبيعية المصفاة الدقيقة المخصبة بمحلول بروفاسولي 0.5x (NSW1/2) (انظر جدول المواد).
   ملاحظة: لتجنب تكرار هذه الخطوات، يمكن اختيار نباتات أمشاج محددة من الذكور والإناث ونشرها نباتيا لعدة أشهر. وتظل النباتات المشيمية نباتية عندما تنمو تحت الضوء الأحمر (4 μE.m-2.s-1 بطول موجي لا يقل عن 580 نانومتر)²³ في نفس ظروف الاستزراع الموصوفة أعلاه (الخطوة ^1.7).

2. تجزئة وتحريض تكوين البويضات

1. حصاد النباتات المشيمية مع مكشطة الخلية.
2. باستخدام مدقة بلاستيكية صغيرة ، سحق النباتات المشيمة التي تم جمعها في أنبوب 1.5 مل إلى قطع 4-5 خلايا.
3. املأ الأنبوب ب 1 مل NSW1/2 (الخطوة 1.9).
4. أضف 2.5 ميكرولتر من محلول الأمشاج المسحوق إلى 3 مل من مياه البحر الطبيعية المخصبة بمحلول بروفاسولي 1x (نيو ساوث ويلز) وضعها في طبق بتري.
   ملاحظة: يوصى باستخدام طبق بتري ذو قاع زجاجي مقاس 25 مم لتسهيل التعامل معه.
5. ضع الأطباق المعدة في خزانة الثقافة وحث تكوين الأمشاج عند 13 درجة مئوية تحت الضوء الأبيض بكثافة 24 μE.m-2.s-1 (الضوء الخافت ، الفترة الضوئية 16: 8 L: D).
   ملاحظة: يمكن ملاحظة أول gametangia (oogonia الإناث و archegonia الذكور) بعد 5 أيام. الذكر متفرع بشكل مفرط مع خلايا صغيرة ، وتتكون الأنثى من خلايا أكبر تشكل خيوط طويلة^15,22. لوحظت البويضات الأولى ~ 10 أيام في وقت لاحق ، وعادة ما يحدث الانقسام الأول من الزيجوت في غضون يومين التاليين.
6. بعد ستة أيام من مراقبة البيض الأول ، انقل الأطباق إلى ظروف إضاءة بيضاء أكثر إشراقا: 50 μE.m-2.s-1 ، الفترة الضوئية 16: 8 L: D ، لا تزال عند 13 درجة مئوية.

3. الحصول على صورة لاختيار الأجنة للاستئصال ومراقبة النمو اللاحق

1. قم بتصوير طبق بتري بأكمله (إعادة) تحديد موقع الأجنة المختارة أثناء خطوة الاستئصال (لا حاجة لإعادة الطبق إلى مجهر العين) ومراقبة التطور اللاحق للأجنة المختارة.
   ملاحظة: استخدم المجهر البؤري المقلوب الموسع بالليزر (انظر جدول المواد) للتصوير (الشكل 1)، ويتم وصف الاستئصال بالليزر في الخطوة 5.
2. ضع طبق بتري على المسرح ووجهه بعلامة مرئية (على سبيل المثال ، ارسم خطا بعلامة دائمة).
3. استخدم هدف 10x/0.45 للتركيز على الجنين. سجل موضع النقاط الأساسية الأربع لطبق بيتري.
4. ابدأ فحص البلاط. احصل على صور مرسلة / فلورسنت لطبق بتري بأكمله بدقة منخفضة: 256 × 256 بكسل ، ووقت بقاء بكسل يبلغ 1.54 ميكروثانية مع المسح الضوئي ثنائي الاتجاه ، وتكبير رقمي بمعدل 0.6x باستخدام ليزر 561 نانومتر عند إرسال 1.2٪.
   ملاحظة: وقت المسح الضوئي لطبق بتري كامل بحجم 2.5 سم هو ~ 6 دقائق ل 225 بلاطة (الشكل 2). هنا ، تم استخدام ليزر 561 نانومتر للانتقال والتصوير الفلوري. تم جمع إشارة التألق بين 580-720 نانومتر على المضاعفات الضوئية البؤرية (PMT) وتم جمع الضوء المرسل على PMT المرسل. يمكن لليزر 561 نانومتر أيضا مراقبة الكلوروفيل في هذه الخطوة ، لكنه غير ضروري لأنه يساعد فقط على التمييز بين ضوضاء الإشارة والكائنات الحية بشكل صحيح.
5. احفظ صورة المسح الضوئي للتجانب واجعلها مفتوحة في نافذة برنامج الحصول على الصور (انظر جدول المواد).
6. تغيير الهدف ، لا تقم بإزالة طبق بيتري.
   ملاحظة: تم نقل الهدف المائي 40x/1.2 إلى جانب المرحلة بحيث يمكن إضافة وسط الغمر (الماء) إلى الهدف دون تحريك طبق بتري من موضعه الأولي.
7. انتقل عبر صورة مسح البلاط التي تم الحصول عليها مسبقا لتحديد الجنين المناسب. بمجرد تحديد الجنين على هذه الصورة ، انقل المرحلة إلى الموضع الدقيق للجنين واحصل على صور منقولة / فلورسنت لهذا الجنين بدقة عالية.
   ملاحظة: إعدادات عالية الدقة: 512 × 512 بكسل، 0.130 ميكرومتر/بكسل، 0.208 ميكروثانية بكسل وقت الإقامة مع المسح الضوئي أحادي الاتجاه والتكبير/التصغير الرقمي 2x باستخدام ليزر 561 نانومتر عند إرسال 0.9٪.
8. قم بالتعليق على صورة مسح البلاط لكل جنين مرشح للاستئصال بالليزر (الشكل 2B) وانتقل إلى خطوة الاستئصال بالليزر.

4. معايرة الليزر

1. قم بمعايرة الليزر ومزامنة برنامج الحصول على الصور مع برنامج تشغيل الليزر في "وضع Click & Fire" وليزر نبضي 355 نانومتر.
   ملاحظة: هذه الخطوة ضرورية لضمان التزامن المثالي بين موضع مؤشر الماوس في برنامج تشغيل الليزر (انظر جدول المواد) مع الموضع في الصورة الحية لبرنامج الاقتناء.
2. افتح حزمة برامج تشغيل الليزر وانقر على Live في حزمة برامج الحصول على الصور.
3. قم بمزامنة حزمتي البرامج بالنقر فوق بدء الاستحواذ في حزمة برامج تشغيل الليزر. يتم تسجيل الصورة الحية الآن أيضا في برنامج تشغيل الليزر فوق البنفسجي.
4. حدد مجال الاهتمام (AOI) من خلال النقر على زر اختيار AOI والنقر على حواف الصورة (اليمين واليسار والأعلى والأسفل) في حزمة برامج تشغيل ليزر الأشعة فوق البنفسجية.
   ملاحظة: بعد خطوة المعايرة هذه، يجب أن تظل إعدادات حجم البكسل وتنسيق الصورة والتكبير/التصغير في حزمة برامج الاكتساب ثابتة.
5. حدد منطقة فارغة على الطبق واخفض مستوى المرحلة إلى 20 ميكرومتر أسفل المستوى البؤري للعينة للتركيز على القاع الزجاجي.
6. اضبط مسارات ليزر الاستئصال والتصوير بالليزر بالنقر فوق بدء المعايرة واختر المعايرة اليدوية.
7. حدد طاقة ليزر عالية بما يكفي لرؤية نقطة سوداء في وسط الصورة الحية المقابلة للثقب الموجود في الغطاء الزجاجي (يجب أن تكون جميع المصاريع مفتوحة).
8. انقر فوق هذه النقطة السوداء المركزية باستخدام مؤشر الماوس وانقر فوق 18 نقطة إضافية اقترحها البرنامج لإكمال إجراء المحاذاة.
9. تحقق من المعايرة في "وضع Click & Fire" على نفس الغطاء.
   ملاحظة: تعتمد معايرة الليزر على معلمات التصوير. بمجرد معايرة الليزر ، تأكد من أن معلمات التصوير (أي 512 × 512 بكسل ، 0.130 ميكرومتر / بكسل ، 0.208 ميكروثانية بكسل وقت الإقامة مع المسح الضوئي أحادي الاتجاه والتكبير الرقمي 2x) لم تتغير.

5. الاستئصال بالليزر

1. اختر جنينا مثيرا للاهتمام. ابدأ التسجيل بفاصل زمني في برنامج الحصول على الصور.
2. احصل على صور مرسلة / فلورية بهدف 40x / 1.2 W بدقة عالية (أي 512 × 512 بكسل ، 0.130 ميكرومتر / بكسل ، 1.54 ميكروثانية بكسل وقت الإقامة مع المسح الضوئي أحادي الاتجاه والتكبير الرقمي 2x باستخدام ليزر 561 نانومتر عند إرسال 0.9٪). احصل على تسجيل الفاصل الزمني بأقصى سرعة.
3. قم بالتصغير من المنطقة في بداية تسجيل الفاصل الزمني. قم بتكبير الهيئة العربية للتصنيع.
4. استخدم وظيفة "Click & Fire" لبرنامج تشغيل الليزر لتطبيق التشعيع الضار على الخلية ذات الأهمية في الجنين. استخدم المعلمات التالية: 45٪ من الإرسال بالليزر (المقابلة لحد أقصى 40 ميكروواط) ومدة النبض 1 مللي ثانية (الخطوة 4).
   ملاحظة: يوصى بتسجيل الفيديو أثناء التصوير بالليزر.
5. تحت 688 نانومتر ، راقب طرد البلاستيدات الخضراء ذاتية الفلورسنت من السيتوبلازم.
6. إذا بقيت محتويات الخلية في الخلية، فاستخدم وظيفة "Click & Fire" مرة أخرى لزيادة حجم الخرق في الخلية. كرر ذلك، مع الحفاظ على عدد اللقطات عند الحد الأدنى حتى يتم تحرير معظم محتويات الخلية.
7. أوقف تسجيل الفاصل الزمني بعد استقرار الجنين (أي أنه لا يمكن اكتشاف أي حركة أخرى داخل الخلايا (~ 1-5 دقائق).
8. قم بتحديث التعليق التوضيحي على صورة المسح الضوئي للتجانب، إذا لزم الأمر.

6. مراقبة نمو الأجنة المشععة

ملاحظة: تتم المراقبة على مدار عدة أيام.

1. تحديد معدل البقاء على قيد الحياة من خلال مراقبة عدد الأجنة التي تتطور بعد الاستئصال بالليزر ومقارنتها بتلك التي تموت.
   ملاحظة: تموت بعض الأجنة مباشرة بعد الاستئصال لأسباب مختلفة. عادة ما يكون معدل الوفيات المرتفع والسريع علامة على معلمات الليزر غير المناسبة أو التعرض الأعلى / الطويل للإجهاد أثناء التجربة أو النقل اللاحق.
2. تحديد تأخر النمو عن طريق قياس طول الأجنة التي يتم تصويرها بالليزر كل يوم ومقارنتها بالأجنة السليمة.
   ملاحظة: معدل نمو الكائنات الحية التي يتم تصويرها بالليزر أبطأ عموما من معدل نمو الكائنات الحية غير المعالجة. ومع ذلك ، يمكن لبعض إعدادات الليزر (غير المناسبة) أن تمنع النمو لأكثر من أسبوع ، مع استئناف النمو بعد ذلك.
3. تعرف على الضرر المجاور من خلال مراقبة تفاعل الخلايا المجاورة للخلايا التي تم إزالتها. في بعض الحالات، قد يؤدي انخفاض الضغط بعد الانفجار إلى انفجار الخلايا المجاورة.
4. تحقق من وجود تلوث الميكروبات. مراقبة نمو الطحالب الدقيقة والبكتيريا في الوسط. إذا كان هناك مستوى غير عادي من الميكروبات موجودة في الطبق ، فقم بالتخلص منه وكرر البروتوكول من الخطوة 2 أو الخطوة 3.
   ملاحظة: بعد الاستئصال بالليزر ، تكون أجنة S. latissima التالفة مجهدة للغاية بالفعل ، ويمكن أن يتسبب الإجهاد الخارجي الإضافي في زيادة معدل الوفيات. من الممكن حدوث فاشيات بكتيرية أو فيروسية لأن الأجنة المعالجة لا يمكن أن تنمو في ظروف محورية.
5. التحقق من التطور العالمي للكائنات الملقحة من خلال دراسة النمط الظاهري وفهم الدور في تطوير المنطقة المستهدفة.

نمت النباتات المشيمية من S. latissima ، وتم تحفيز تكوين الأمشاج لإنتاج الزيجوت والأجنة. بعد اثني عشر يوما من تحريض تكوين الأمشاج ، خضعت الأجنة للاستئصال بالليزر. هنا ، تهدف التجربة إلى تقييم دور خلايا محددة في التطور الشامل لأجنة S. latissima. تم استهداف الخلية الأكثر قمية ، والخلايا القاعدية الأكثر ، والخلايا المتوسطة. بعد مسح البلاط ، تم تحديد طبق بتري بأكمله (الشكل 2 أ) ، وهو جنين مثير للاهتمام ، كمرشح مناسب للتصوير بالليزر (الشكل 2 ب). تم اختيار خلية معينة من هذا الجنين واستهدافها وتصويرها باستخدام شعاع ليزر نابض بالأشعة فوق البنفسجية بحد أقصى 40 ميكروواط من طاقة الليزر (المقابلة ل 45٪ من الطاقة القصوى للمعدات المستخدمة هنا) لمدة 1 مللي ثانية (الفيلم 1). أطلقت الخلية محتوياتها (البلاستيدات الخضراء والسيتوبلازم). ومن المثير للاهتمام أن الخلايا المجاورة استجابت لانفجار الخلية المشععة عن طريق التوسع في الفضاء بين الخلايا. وسجل موضع الأجنة المشععة للرصد اللاحق على مدى 10 أيام (الشكل 3). استمرت معظم الأجنة المشععة في التطور ولكنها أظهرت تغييرا في النمو (شكل الجنين). يجب إجراء تحليل مفصل للتغيرات المورفولوجية قبل أن تعزى وظيفة محددة إلى كل خلية مشععة في التحكم في آلية النمو الشاملة.

في المقابل ، تم اختبار الأجنة باستخدام معلمات ليزر أخرى (على سبيل المثال ، 33 مللي ثانية لمدة التصوير من 60٪ -80٪ من طاقة الليزر. الفيلم 2) سرعان ما أظهر علامات الإجهاد الشديد مثل تبييض الخلايا أو تلاشيها أو تغيرات الشكل (التقريب). ماتت جميع الأجنة تقريبا التي تم إطلاق النار عليها بهذه الطريقة في غضون خمسة أيام بعد التجربة (الشكل 4).

الشكل 1: صورة فوتوغرافية لإعداد مجهر الاستئصال بالليزر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2: مسح البلاط المشروح لطبق بتري كامل. (أ) مسح البلاط لطبق بتري بأكمله المستخدم في الاستئصال بالليزر. تم استخدام PMT الإرسال للحصول على مسح برايتفيلد. بمجرد تحديد موقع الجنين محل الاهتمام ، ينقر المستخدم على موضع الجنين في فحص البلاط ، ويضع البرنامج المرحلة مباشرة فوق الجنين. (ب) يمكن بعد ذلك شرح مسح البلاط على وجه التحديد لتحديد موقع الجنين في الخطوات اللاحقة ، لتتبع الجنين ومراقبته. هنا ، تظهر الصورة جنينا متصلا بالجزء السفلي من طبق بتري ، والذي يمكن تحديد موقعه بسهولة باستخدام ليزر 561 نانومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: السلسلة الزمنية لجنين S. latissima المتنامي بعد التشعيع. يظهر هذا في الفيلم 1. لم يقم الاستئصال بالليزر للخلية الأكثر قمية في الجنين بتبييض الخلايا المجاورة للجنين. استمروا في النمو والانقسام ، وشكلوا جنينا طبيعيا بعد بضعة أيام. تم التقاط الصور كل 24 ساعة ، بعد 2-9 أيام من الاستئصال. شريط المقياس هو 50 ميكرومتر وهو نفسه لجميع الصور. D2-D9 يتوافق مع اليوم-2 إلى اليوم-9. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: السلسلة الزمنية لموت جنين S. latissima بعد الاستئصال بالليزر باستخدام معلمات دون المستوى الأمثل. يمكن أن يؤدي التعرض المفرط لتشعيع الليزر بسهولة إلى ارتفاع معدلات وفاة الجنين المستهدف وكذلك الأجنة المجاورة. يتم عرض سلسلة زمنية من لقطة الجنين في الفيلم 2 ، مع الإشارة إلى الوقت بعد الاستئصال فوق كل صورة (3-6 أيام بعد الاستئصال). شريط المقياس هو 30 ميكرومتر وينطبق على كل صورة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الفيلم 1: الاستئصال بالليزر للخلية الأكثر قمية لجنين 8 خلايا من S. latissima. تم تعديل التركيز أولا على الجنين المختار من بين باقة من النباتات البوغية Saccharina (في مجالات مختلفة ، أولا واسعة ، ثم ضيقة). ثم تم إطلاق النار على الخلية الأكثر قمية من الجنين باستخدام 45٪ من طاقة الليزر لمدة 1 مللي ثانية. انفجرت الخلية القمية بسرعة وأطلقت محتوياتها. الخلايا المجاورة ، التي تحررت من تورغور الخلية المنفجرة ، ملأت المساحة الفارغة. بعد 5 دقائق ، توقفت الخلية ومحتوياتها عن الحركة ووصلت إلى حالة من التوازن. تم تسريع الفيلم 4 مرات (من 1 صورة لكل 632 مللي ثانية إلى 6 إطارات في الثانية). ويبين الشكل 3 متابعة تطور الجنين. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الفيلم.

الفيلم 2: تبييض كبير للخلايا المجاورة لخلية انفجار ناتجة عن إعدادات ليزر دون المستوى الأمثل. أدى استخدام قوة ليزر تبلغ 60٪ -80٪ لمدة 1 مللي ثانية أو قوة ليزر بنسبة 45٪ ل 10 مللي ثانية إلى تبييض كبير للخلايا المجاورة ومعدل بقاء أقل بكثير. يجب ألا تتسبب الإعدادات المستخدمة في الليزر في تبييض أو تلف جزئي للخلايا المجاورة. تم الحصول على أفضل النتائج عن طريق تقليل قوة و / أو مدة نبضة الليزر ، واستهداف النقطة البعيدة عن الخلايا المجاورة. هنا ، يتمإطلاق النار على الخلية الأكثر قمية لجنين 4 خلايا من S. latissima (80٪ من طاقة الليزر ، 1 مللي ثانية) (عرض جانبي / علوي). يمكن ملاحظة الإفراط في تبييض الخلايا السفلية والجانبية بسهولة. يظهر التطور اللاحق للجنين في الشكل 4. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الفيلم.

الشكل التكميلي 1: مخطط انسيابي تخطيطي للبروتوكول بأكمله. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.