استخراج على نطاق صغير من Caenorhabditis elegans الحمض النووي الجينومي

هنا ، يتم تقديم بروتوكولين مرتبطين بتحلل Caenorhabditis elegans لجعل الحمض النووي متاحا للتطبيقات القائمة على PCR. PCR هي تقنية جزيئية شائعة الاستخدام تستخدم للعديد من التطبيقات ، بما في ذلك التنميط الجيني وتضخيم شظايا الحمض النووي للاستنساخ والتسلسل ، من بين أمور أخرى. الدودة المستديرة الصغيرة (1 مم) التي تعيش بحرية C. elegans هي نظام حيواني شائع للبحوث البيولوجية. الحصول على الحمض النووي الجينومي المناسب من واحد أو عدد قليل من الحيوانات يكفي لتضخيم التسلسل بواسطة PCR. تحتوي يرقات L4 المتأخرة والبالغين على حوالي 1000 خلية جسدية فقط (بما في ذلك بعض الخلايا متعددة النواة ومتعددة الصبغيات) ، والخلايا الجرثومية ، و (إذا كان الحيوان خنثى محبوذا) ذرية في الرحم¹. ومع ذلك ، فإن هذه الحيوانات محمية بواسطة بشرة يجب تعطيلها لاستخراج الحمض النووي الجينومي². تتضمن الطرق القياسية لإعداد قالب الحمض النووي الجيني الخيطي ل PCR خطوات متعددة وتستغرق عدة ساعات. يتم تجميد الحيوانات أولا في مخزن تحلل الدودة الذي يحتوي على بروتين K (-70 درجة مئوية أو أقل) لمدة 15-45 دقيقة على الأقل (يوصى ببعض البروتوكولات بفترة أطول) ^3،4،^5،6. هذه الخطوة الشقوق فتح الحيوانات.

بعد التجميد ، يتم تحضين الحيوانات لمدة 1 ساعة عند 60-65 درجة مئوية حتى يعمل البروتين K ، ثم يتم تعطيل الإنزيم لمدة 15-30 دقيقة عند 95 درجة مئوية. البروتيناز K يدمر النوكليز الذي يتحلل الحمض النووي. يعد تعطيل البروتين K قبل تفاعل البوليميراز المتسلسل أمرا مهما لمنع البروتين K من تدهور بوليميراز الحمض النووي. البروتوكولان القائمان على المجموعة الموصوفان هنا هما طريقتان سريعتان وموثوقتان وفعالتان من حيث التكلفة لاستخراج الحمض النووي الجيني من واحد أو عدد قليل من الديدان الخيطية للبحث اليومي وتدريس التطبيقات المختبرية. تم تحسين المجموعة المستخدمة في الأصل من قبل الشركة المصنعة لاستخراج الحمض النووي من الأنسجة الحيوانية واللعاب والشعر⁷. ويستخدم حل إعداد الأنسجة الملكية وحل استخراج لتحليل الخلايا وجعل الحمض النووي الجينومي في متناول اليد. ثم يقوم حل تحييد الملكية بتحييد المكونات التي قد تمنع تفاعل البوليميراز المتسلسل (على سبيل المثال ، الأملاح والأيونات والجزيئات المرتبطة ب Mg²⁺).

عند التنميط الجيني ، يمكن اختبار واحد. عند تحديد ما إذا كانت السلالة متماثلة الزيجوت ، فإن اختبار ستة أو أكثر من النسل من واحد يعطي ثقة عالية بأن الخط متماثل الزيجوت أم لا (هناك فرصة بنسبة 0.02٪ لاختيار ستة ذرية متحولة متماثلة الزيجوت عشوائيا من أحد الوالدين غير المتجانسين [(1/4)⁶ × 100٪ = 0.02٪]). هذه الطريقة 1) مباشرة ، مع خطوات أقل من طريقة proteinase K ، و 2) تقلل من وقت إعداد القالب إلى 15 دقيقة. تظهر النتائج في هذا العمل أن البروتوكول المطور يعمل بقوة في استخراج الحمض النووي الجيني من ديدان مفردة أو قليلة ، والتي يمكن استخدامها بشكل موثوق في التطبيقات النهائية التي لا تتطلب الحمض النووي عالي النقاء ، بما في ذلك PCR.

1. C. صيانة elegans

ملاحظة: تم الحفاظ على سلالات N2 (النوع البري) و blmp-1 (tm548) C. elegans على لوحات وسائط نمو الديدان الخيطية القياسية (NGM) عند 20 درجة مئوية.

1. تحضير لوحات NGM عن طريق إذابة 23.005 غرام من مسحوق NGM في 973 مل من الماء في قارورة 2 لتر. قم بتغطية فتحة القارورة بورق الألومنيوم (أو غطاء قابل للتعقيم يسمح بالتهوية) وقم بتأمين الغطاء بشريط الأوتوكلاف. الأوتوكلاف لإذابة المسحوق وتعقيم المحتويات بدورة تعقيم لا تقل عن 30 دقيقة.
2. تبريد المتوسطة إلى 60 درجة مئوية في حمام مائي.
3. إلى الوسط المبرد ، أضف 25 مل من الفوسفات المعقم 1 م (KH₂PO₄) المخزن المؤقت ، الرقم الهيدروجيني 6.0 ؛ 1 مل من محلول كلوريد الكالسيوم 1 م ؛ و 1 مل من محلول كبريتات المغنيسيوم 1 م.
4. حرك الوسط على صفيحة تحريك مغناطيسية للحصول على خليط متجانس ولمنع التبريد والتصلب غير المتكافئين (~ 5 دقائق). تأكد من أن شريط التحريك يدور بسرعة كافية لإنشاء دوامة ولكن ليس بسرعة كبيرة بحيث يتم إدخال فقاعات (~ 250-300 دورة في الدقيقة).
5. صب ~ 25 مل من الوسط في كل لوحة بتري 10 سم (~ 40 لوحة في المجموع). جفف الألواح في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها (عادة 16-25 درجة مئوية).
6. تنمو مستعمرة من الإشريكية القولونية OP50 في 30-50 مل من مرق LB بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية.
7. قم بزرع كل طبق يحتوي على 500 ميكرولتر من ثقافة E. coli OP50 واتركها تجف في درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام (عادة 16-25 درجة مئوية)⁸. تخزين لوحات في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أسابيع.
8. انقل C. elegans إلى ألواح البذور باستخدام معول سلكي أو طريقة أخرى واتركها تنمو إلى L4 أو مرحلة البالغين عند درجة الحرارة المطلوبة للسلالة (عادة 16-25 درجة مئوية ، 1-2 أيام إذا كانت الحيوانات مطلية جوعا كداور ، 3-4 أيام إذا كانت الحيوانات مطلية كأجنة)⁸.

2. استخراج الحمض النووي للدودة الواحدة

ملاحظة: هذه الطريقة مفيدة لاستخراج الحمض النووي من دودة واحدة (دودة واحدة في 1.8 ميكرولتر من الحجم الكلي). يمكن عمل مزيج رئيسي إذا تم تحليل ديدان متعددة في وقت واحد.

1. قم ببرمجة دورة حرارية لدورة واحدة عند 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق تليها 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق (برنامج التحلل).
2. Aliquot 0.8 ميكرولتر من محلول الاستخراج من المجموعة على الجدار الداخلي لأنبوب PCR 0.2 مل على الجليد. أضف 0.2 ميكرولتر من محلول تحضير الأنسجة من المجموعة إلى قطرة محلول الاستخراج. اخلط عن طريق السحب.
3. تحديد L4 أو بالغ تحت المجهر تشريح⁹. لتحديد خنثى L4 ، ابحث عن فرج مميز مرئي كنصف دائرة شاحبة في منتصف الحيوان. تحديد الخنثى البالغ من خلال البحث عن أكبر الحيوانات على اللوحة التي قد تحتوي على أجنة بيضاوية مرئية في رحمها.
4. باستخدام اختيار سلك بلاتيني ، انقل الحيوان المحدد إلى الحل¹⁰.
5. قم بالطرد المركزي للأنبوب لفترة وجيزة (2-3 ثوان ، ≤6000 دورة في الدقيقة / 2000 × جم) في درجة حرارة الغرفة لجمع المحتويات في أسفل الأنبوب.
6. ضع الأنبوب في جهاز التدوير الحراري وقم بتشغيل برنامج التحلل المعين في الخطوة 2.1.
7. عند اكتمال البرنامج ، قم بطرد مركزي الأنبوب لفترة وجيزة ووضعه على الجليد. أضف 0.8 ميكرولتر من محلول التحييد من المجموعة إلى الخليط. اخلط عن طريق السحب.
8. قم بطرد الأنبوب لفترة وجيزة في درجة حرارة الغرفة (2-3 ثوان ، ≤6000 دورة في الدقيقة / 2000 × جم).
9. استخدم الليزات مباشرة لتفاعل البوليميراز المتسلسل أو قم بتخزينه عند 4 درجات مئوية أو -20 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل.
   ملاحظة: الحمض النووي المستخرج مستقر عند 4 درجات مئوية أو -20 درجة مئوية لمدة 6 أشهر على الأقل⁷.

3. استخراج الحمض النووي لعدد قليل من الأفراد

ملاحظة: هذه الطريقة مفيدة لاستخراج الحمض النووي من عدد قليل من الديدان. يمكن تحضير مزيج رئيسي إذا تم تحليل سلالات متعددة في وقت واحد.

1. قم ببرمجة جهاز التدوير الحراري لدورة واحدة عند 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق متبوعا ب 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق (برنامج التحلل).
2. Aliquot 2.0 ميكرولتر من محلول الاستخراج من المجموعة على الجدار الداخلي لأنبوب PCR 0.2 مل على الجليد. أضف 0.5 ميكرولتر من محلول تحضير الأنسجة من المجموعة إلى قطرة محلول الاستخراج. اخلط عن طريق السحب.
3. تحديد L4 أو الحيوانات البالغة تحت المجهر تشريح⁹. يحتوي الخنثى L4 على فرج مميز مرئي كنصف دائرة شاحبة في منتصف الحيوان. الخنثى البالغ هو أكبر الحيوانات على الصفيحة وقد يكون لديه أجنة بيضاوية مرئية في رحمه.
4. باستخدام اختيار سلك بلاتيني ، انقل بعض الحيوانات إلى المحلول: 9 تنتج ما يعادل حيوانا واحدا من الحمض النووي الجينومي لكل 0.5 ميكرولتر من الليزات ، و 16 حيوانا ينتج ~ 1 مكافئ حيواني من الحمض النووي الجينومي في 0.25 ميكرولتر (3.5 نيماتودا / ميكرولتر) ¹⁰.
   ملاحظة: من الصعب نقل أكثر من 16 حيوانا إلى هذا المجلد.
5. قم بطرد الأنبوب لفترة وجيزة في درجة حرارة الغرفة (2-3 ثوان ، ≤6000 دورة في الدقيقة / 2000 × جم).
6. ضع الأنبوب في جهاز التدوير الحراري وقم بتشغيل برنامج التحلل المعين في الخطوة 3.1.
7. عند اكتمال البرنامج ، قم بطرد مركزي الأنبوب لفترة وجيزة ووضعه على الجليد. أضف 2 ميكرولتر من محلول التحييد من المجموعة إلى الخليط. اخلط عن طريق السحب.
8. قم بطرد الأنبوب لفترة وجيزة في درجة حرارة الغرفة (2-3 ثوان ، ≤6000 دورة في الدقيقة / 2000 × جم).
9. استخدم التحلل مباشرة لتفاعل البوليميراز المتسلسل أو قم بتخزينه عند 4 درجات مئوية أو -20 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل.
   ملاحظة: الحمض النووي المستخرج مستقر عند 4 درجات مئوية أو -20 درجة مئوية لمدة 6 أشهر على الأقل⁷.

4. تفاعل البوليميراز المتسلسل

ملاحظة: يتم وصف أحد التطبيقات النهائية لتقنية تحلل الدودة هذه ، وهو اكتشاف طفرة حذف باستخدام بوليميراز سريع. كما تم إثبات فعالية بروتوكولي تحلل الدودة في إنتاج الحمض النووي لقالب الجينوم لنجاح تفاعل البوليميراز المتسلسل عند التخفيف إلى 1/50 من^الدودة لكل تفاعل.

1. استخراج الحمض النووي من دودة واحدة و 16 دودة باستخدام النوع البري N2 والسلالات المتحولة ، كما هو موضح أعلاه في الخطوة 2 والخطوة 3.
2. قم بإعداد تخفيفات 2 و 10 و 20 و 50 ضعفا من الحمض النووي أحادي الدودة من الحيوانات البرية N2.
3. قم بإعداد تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة باستخدام الاشعال الخاصة بتسلسل الاهتمام والمزيج الرئيسي لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) (الجدول 1 والجدول 2). استخدم 1 ميكرولتر من الحمض النووي غير المخفف أو 2 ميكرولتر من الحمض النووي المخفف كقالب في كل تفاعل.
4. تأكد من منتجات PCR عن طريق الرحلان الكهربائي الهلامي والتصوير¹¹.

تم استخراج الحمض النووي الجيني من شخص واحد أو عدد قليل من البالغين من النوع البري باستخدام المجموعة التجارية أو بروتوكول التحلل التقليدي لمقارنة فعالية هاتين الطريقتين. ثم تم استخدام هذه الليزات كقوالب ل PCR لتضخيم إما هدف أكبر من ~ 2,100 bp (ترميز blmp-1) أو هدف أصغر من ~ 500 bp (ترميز جزء من sma-10). وأسفرت كلتا الطريقتين بنجاح عن منتجات PCR مناسبة (الشكل 1 ألف).

بعد ذلك ، تم إثبات قدرة الحمض النووي الجينومي المستخرج من المجموعة على العمل كقالب لمجموعة متنوعة من بوليميراز الحمض النووي. تم استخدام الحمض النووي الجينومي المستخرج كقالب لتضخيم منتج 0.5 كيلو بايت باستخدام أربعة بوليميراز تمتلك قدرات مختلفة (بما في ذلك السرعة والإخلاص وحجم المنتج). تم إنشاء منتجات ذات أحجام متوقعة بواسطة هذه البوليميراز باستخدام قالب من تحلل شخص بالغ واحد أو تحلل تسعة أشخاص بالغين (الشكل 1B). يمكن تأكيد تسلسل القالب ودقة بوليميراز PCR لتضخيم تسلسل القالب بشكل صحيح عن طريق التسلسل (الشكل التكميلي S1). توضح هذه النتيجة أن الحمض النووي الجينومي المستخرج من بروتوكولات المجموعة يوفر نموذجا مناسبا لمجموعة من البوليمرات.

تم اختبار فعالية تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام تركيزات مختلفة من الحمض النووي الجينومي المستخرج من واحد باستخدام المجموعة التجارية. تم تخفيف الحمض النووي بمقدار 2 أو 10 أو 20 أو 50 ضعفا ، وتم استخدام ما يعادل حوالي نصف وعشر وعشرين وخمسينيات دودة لكل تفاعل لتفاعل البوليميراز المتسلسل. دعمت تركيزات قالب الحمض النووي هذه تضخيم إما هدف أكبر يبلغ ~ 2.1 كيلو بايت أو هدف أصغر يبلغ ~ 0.5 كيلو بايت (الشكل 1C)12. في حين لوحظ عائد يعتمد على تركيز الحمض النووي لمنتج PCR 0.5 كيلو بايت ، بدا أن عائد منتج PCR البالغ 2.1 كيلو بايت متساو في جميع التفاعلات.

لإثبات أن هذه البروتوكولات تنتج الحمض النووي الجينومي من C. elegans المناسب للتنميط الجيني PCR ، تم استخراج الحمض النووي الجيني من طفرات أحادية و 16 من النوع البري و blmp-1 لفقدان الوظيفة (blmp-1 (tm548)). يشفر جين blmp-1 عامل نسخ له أدوار مهمة في هجرة الخلايا الطرفية البعيدة وحجم الجسم والتطور12،13،14،15،16. يحتوي المتحور blmp-1 على حذف 810 نقطة أساس يزيل أجزاء من exon 3 و intron 315. تم تصميم الاشعال التي تنتج منتجا 2,134 نقطة أساس عند استخدام قالب الحمض النووي من النوع البري ومنتج 1,324 نقطة أساس إذا تم استخدام الحمض النووي blmp-1(-). تم الكشف عن منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل ذات الأحجام المناسبة باستخدام 1 ميكرولتر من الدودة المفردة (حوالي 0.5 ديدان لكل تفاعل) أو تحلل 16 دودة من الحيوانات المرحلية L4 (3.5 ديدان لكل تفاعل) (الشكل 1D). تظهر هذه النتيجة أن الحمض النووي الجينومي المستخرج من المجموعة باستخدام أي من البروتوكولين يوفر قوالب فعالة بنفس القدر لخطوط PCR إلى النمط الوراثي.

تظهر هذه النتائج أن مستحضرات الحمض النووي الجينومي C. elegans باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي للأنسجة التجارية من واحدة ومتعددة يمكن استخدامها بشكل موثوق كقوالب ل PCR.

الشكل 1: تسمح مستحضرات الحمض النووي باستخدام مجموعة تجارية من الديدان الخيطية المفردة والديدان الخيطية المتعددة بتضخيم قوي بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل. تم تحميل منتجات PCR على هلام الأغاروز بنسبة 1٪ في مخزن مؤقت TAE 1x (5 ميكرولتر (A ، B) أو 10 ميكرولتر (C ، D) وتشغيلها عند 90-100 فولت لمدة 30 دقيقة إلى 2 ساعة. تم استخدام سلم الحمض النووي 2-log لجميع المواد الهلامية. (أ) مقارنة تحلل الحمض النووي بواسطة المجموعة بالطرق التقليدية للبروتين K لإنشاء قالب باستخدام مجموعتين تمهيديتين. تم تحليل البالغين من النوع البري ، وتم استخدام ما يعادل واحد كقالب لجميع ردود الفعل. الممرات 1-4 ، منتج 2.1 كيلو بايت. Lane 1 ، PCR من تحلل الدودة الواحدة بواسطة proteinase K. Lane 2 ، PCR من تحلل الدودة الواحدة بطريقة المجموعة. Lane 3 ، PCR من تحلل دودة الدودة التسعة بواسطة proteinase K. Lane 4 ، PCR من تحلل دودة الدودة التسعة بطريقة المجموعة. الممرات 5-8 ، 0.5 كيلو بايت المنتج. Lane 5 ، PCR من تحلل الدودة الواحدة بواسطة proteinase K. Lane 6 ، PCR من تحلل الدودة الواحدة بطريقة المجموعة. Lane 7 ، PCR من تحلل دودة الدودة التسعة بواسطة proteinase K. Lane 8 ، PCR من تحلل دودة الدودة التسعة بطريقة المجموعة. (ب) توفر طريقة مجموعة تحلل الحمض النووي نموذجا مناسبا ل PCR بواسطة بوليميراز متعددة. تم تحليل البالغين من النوع البري باستخدام طريقة المجموعة ، وتم استخدام ما يعادل نصف كقالب PCR لمنتج 0.5 كيلو بايت. انظر جدول المواد للحصول على تفاصيل البوليميراز. حارة 1 ، PCR من تحلل دودة واحدة مع بوليميراز عالي السرعة. حارة 2 ، PCR من تحلل تسع ديدان مع بوليميراز عالي السرعة. حارة 3 ، PCR من تحلل دودة واحدة مع بوليميراز Taq . حارة 4 ، PCR من تحلل تسع ديدان مع بوليميراز Taq . حارة 5 ، PCR من تحلل دودة واحدة مع بوليميراز عالي الدقة. حارة 6 ، PCR من تحلل تسع ديدان مع بوليميراز عالي الدقة. حارة 7 ، PCR من تحلل دودة واحدة مع بوليميراز عالي السرعة وعالي الدقة. حارة 8 ، PCR من تحلل تسع ديدان مع بوليميراز عالي السرعة وعالي الدقة. (ج) توفر التخفيفات لتحلل دودة L4 من النوع البري نموذجا ل PCR. الممرات 1-5 ، منتج 2.1 كيلو بايت. الممرات 6-10 ، 0.5 كيلو بايت الهدف. حارة 1 وحارة 6 ، الحمض النووي غير المخفف. حارة 2 وحارة 7 ، 2 أضعاف الحمض النووي المخفف. حارة 3 وحارة 8 ، 10 أضعاف الحمض النووي المخفف. حارة 4 وحارة 9 ، 20 أضعاف الحمض النووي المخفف. حارة 5 وحارة 10 ، 50 أضعاف الحمض النووي المخفف. (د) التنميط الجيني لموضع blmp-1 بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام 1 ميكرولتر من مستحضرات الحمض النووي أحادية الدودة و 16 دودة كقالب. حارة 1 ، PCR من تحلل دودة واحدة من النوع البري. حارة 2 ، PCR من blmp-1 (-) تحلل دودة واحدة. حارة 3 ، PCR من تحلل 16 دودة من النوع البري. حارة 4 ، PCR من blmp-1 (-) 16-دودة التحلل. الاختصارات: الإعدادية = طريقة التحضير. كيلو بايت = كيلو بيس ؛ st. = مرحلة الديدان الخيطية. dil. = تخفيف الحمض النووي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: قائمة الاشعال .

الجدول 2: مكونات تفاعل البوليميراز المتسلسل.

الشكل التكميلي S1: التسلسل لتأكيد جودة الحمض النووي الجينومي المعد باستخدام مجموعة تجارية. تتطابق النتائج المستخلصة من تفاعلين متتابعين تماما مع التسلسل المتوقع لأكثر من 1600 نيوكليوتيدات من الحمض النووي يتم تضخيمها بواسطة بوليميراز عالي السرعة وعالي الدقة (Pol E) من تحلل 16 دودة (الجدول 1 والجدول 2A والجدول 2D). تم قص نهايات قراءة التسلسل لإزالة القراءات الأساسية منخفضة الجودة. تم إجراء المحاذاة باستخدام أداة محاذاة التسلسل المتعدد EMBL-EBI MUSCLE (مقارنة تسلسل MUltiple بواسطة Log-Expectation)17. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

وليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.