يظهر هنا وصف للعزل المباشر والسريع نسبيا للحمض النووي الجينومي Caenorhabditis elegans من واحد أو عدد قليل من الحيوانات باستخدام مجموعة أنسجة متاحة تجاريا. إعداد gDNA الناتج هو قالب مناسب ل PCR.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
استخراج على نطاق صغير من Caenorhabditis elegans الحمض النووي الجينومي
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
استخراج الحمض النووي الجينومي من واحد أو عدد قليل من Caenorhabditis elegans له العديد من التطبيقات النهائية ، بما في ذلك PCR لخطوط التنميط الجيني والاستنساخ والتسلسل. تستغرق الطرق التقليدية القائمة على البروتين K لاستخراج الحمض النووي الجيني من C. elegans عدة ساعات. مجموعات الاستخراج التجارية التي تكسر بشكل فعال بشرة C. elegans واستخراج الحمض النووي الجينومي محدودة. يتم الإبلاغ هنا عن طريقة سهلة وأسرع (~ 15 دقيقة) وفعالة من حيث التكلفة لاستخراج الحمض النووي الجينومي C. elegans الذي يعمل بشكل جيد لتطبيقات الفصول الدراسية والبحوث. تم تحسين طريقة استخراج الحمض النووي هذه لاستخدام اليرقات المتأخرة (L4) أو الديدان الخيطية البالغة كمادة أولية للحصول على قالب موثوق به لأداء PCR. تشير النتائج إلى أن جودة الحمض النووي مناسبة لتضخيم الأهداف الجينية ذات الأحجام المختلفة بواسطة PCR ، مما يسمح بالتنميط الجيني لحيوان واحد أو عدد قليل حتى عند التخفيف إلى واحد من خمسين من الحمض النووي الجيني من شخص بالغ واحد لكل تفاعل. يمكن استخدام البروتوكولات المبلغ عنها بشكل موثوق لإنتاج قالب الحمض النووي بسرعة من عينة واحدة أو صغيرة من C. elegans للتطبيقات القائمة على PCR.
المقدمة
هنا ، يتم تقديم بروتوكولين مرتبطين بتحلل Caenorhabditis elegans لجعل الحمض النووي متاحا للتطبيقات القائمة على PCR. PCR هي تقنية جزيئية شائعة الاستخدام تستخدم للعديد من التطبيقات ، بما في ذلك التنميط الجيني وتضخيم شظايا الحمض النووي للاستنساخ والتسلسل ، من بين أمور أخرى. الدودة المستديرة الصغيرة (1 مم) التي تعيش بحرية C. elegans هي نظام حيواني شائع للبحوث البيولوجية. الحصول على الحمض النووي الجينومي المناسب من واحد أو عدد قليل من الحيوانات يكفي لتضخيم التسلسل بواسطة PCR. تحتوي يرقات L4 المتأخرة والبالغين على حوالي 1000 خلية جسدية فقط (بما في ذلك بعض الخلايا متعددة النواة ومتعددة الصبغيات) ، والخلايا الجرثومية ، و (إذا كان الحيوان....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. C. صيانة elegans
ملاحظة: تم الحفاظ على سلالات N2 (النوع البري) و blmp-1 (tm548) C. elegans على لوحات وسائط نمو الديدان الخيطية القياسية (NGM) عند 20 درجة مئوية.
- تحضير لوحات NGM عن طريق إذابة 23.005 غرام من مسحوق NGM في 973 مل من الماء في قارورة 2 لتر. قم بتغطية فتحة القارورة بورق الألومنيوم (أو غطاء قابل للتعقيم يسمح بالتهوية) وقم بتأمين الغطاء بشريط الأوتوكلاف. الأوتوكلاف لإذابة المسحوق وتعقيم المحتويات بدورة تعقيم لا تقل عن 30 دقيقة.
- تبريد المتوسطة إلى 60 درجة مئوية في حمام مائي.
- إلى الوسط المبرد ، أضف 25 مل من الفوسفات المعقم 1 م (KH2PO4) المخزن الم....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تم استخراج الحمض النووي الجيني من شخص واحد أو عدد قليل من البالغين من النوع البري باستخدام المجموعة التجارية أو بروتوكول التحلل التقليدي لمقارنة فعالية هاتين الطريقتين. ثم تم استخدام هذه الليزات كقوالب ل PCR لتضخيم إما هدف أكبر من ~ 2,100 bp (ترميز blmp-1) أو هدف أصغر من ~ 500 bp (ترميز جزء من sma-10). وأسفرت كلتا الطريقتين بنجاح عن منتجات PCR مناسبة (الشكل 1 ألف).
بعد ذلك ، تم إثبات قدرة الحمض النووي الجينومي المستخرج من المجموعة على العمل كقالب.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يعد تحديد الأنماط الجينية ل C. elegans خطوة مهمة أثناء إجراء الصلبان الجينية لإنشاء سلالات C. elegans جديدة. يعد استخراج الحمض النووي الجيني باستخدام واحد أو عدد قليل من C. elegans خطوة حاسمة في التنميط الجيني C. elegans. يصف هذا البروتوكول استخراج الحمض النووي الجيني من C. elegans باستخدام مجموعة تجارية. هذه الطريقة سريعة وتعمل بقوة. يمكن استخدام الحمض النووي الجينومي المستخرج باستخدام هذه الطريقة للتطبيقات النهائية ، بما في ذلك التنميط الجيني والتسلسل والاستنساخ. تم تحسين ط.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.
شكر وتقدير
تم الحصول على سلالة N2 وبكتيريا E. coli OP50 من مركز Caenorhabditis Genetics Center (CGC) ، الذي يموله مكتب برامج البنية التحتية البحثية التابع للمعاهد الوطنية للصحة (P40 OD010440). تم الحصول على سلالة blmp-1 (tm548) من المشروع الوطني للموارد الحيوية ، اليابان. يشكر المؤلفون WormBase. تم دعم هذا العمل من قبل NIH R01GM097591 إلى T.L.G. ، والتمويل الداخلي من جامعة تكساس للمرأة إلى T.L.G ، ومركز TWU لأبحاث الطلاب إلى M.F.L.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| شريط الأوتوكلاف | Defend | 43237-2 | |
| رقائق الألومنيوم ، | التفاف رينولدز | 2182934 | |
| كلوريد الكالسيوم | Millipore Sigma | 102382 (CAS 10035-04-8) | |
| مجموعة Extract-N-Amp (تشمل محلول تحضير الأنسجة ومحلول الاستخراج ومحلول التحييد) | شركة Sigma-Aldrich LLC | XNAT2-1KT | |
| لوح تسخين / نمام Isotemp | فيشر Scientific | 11-100-495H | |
| LB وسائل الإعلام ، لينوكس ، كبسولات | MP Biomedicals، LLC | 3002-131 | |
| كبريتات المغنيسيوم ، نقية ، لا مائية | AC413485000 علمية حرارية | (CAS 7487-88-9) | |
| الطرد المركزي | Labnet International، Inc. | PrismR ، C2500-R | |
| NEB Q5U بداية ساخنة عالية الدقة بوليميراز الحمض النووي | نيو إنجلاند Biolabs، Inc. | M0515S | "Pol E" المستخدم في الشكل التكميلي S1 ، وهو بوليميراز عالي السرعة وعالي الدقة (20 & ndash; 30 ثانية / كيلو بايت) |
| مسحوق وسائط NGM | الولايات المتحدة علوم الحياة البيولوجية | N1000 | |
| Phusion عالية الدقة PCR Master Mix مع HF Buffer | New England Biolabs، Inc. | M0531S | "Pol D" في الشكل 1 ب ، بوليميراز عالي السرعة وعالي الدقة (15 & ndash; 30 ثانية / كيلو بايت) |
| بادئات | تقنيات الحمض النووي المتكاملة مخصص | الحمض النووي أوليغوس | |
| PrimeSTAR GXL بوليميراز | تاكارا بيو إنك. | R050B | "Pol C" في الشكل 1 ب ، بوليميراز عالي الدقة (1 دقيقة / كيلو بايت) للقوالب والقوالب الغنية ب GC حتى 30 كيلو بايت |
| سلم الحمض النووي الأرجواني سريع التحميل 2-log (0.1 & ndash; 10.0 كيلو بايت) | شركة نيو إنجلاند بيولابز | N0550S | |
| SapphireAmp Fast PCR Master Mix | Takara Bio Inc. | RR350A | "Pol A" في الشكل 1 ب ، البوليميراز المستخدم في الشكل 1 أ ، ج ، د ، بوليميراز عالي السرعة (10 ثانية / كيلو بايت) لأهداف تصل إلى 5 كيلو بايت |
| سيجما ريدي ميكس تاك تفاعل البوليميراز المتسلسل | مزيج سيجما ألدريتش كو ذ.م.م | P4600 | "بول ب" في الشكل 1 ب ، بوليميراز (1 دقيقة / كيلو بايت) لأهداف تصل إلى 7 كيلو بايت |
| SimpliAmp cycler الحراري | Applied Biosystems | A24812 | |
| شريط تحريك | فيشر Scientific | 14-512-126 | |
| خلاط دوامة | فيشر 2215365 | ||
| الدودة اختيار دودة | جينيسي العلمية | 59-AWP |
المراجع
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans. WormBook. , ed. The C. elegans Community, WormBook 1-31 (2015).
- Page, A. P., Johnstone, I. L. The cuticle. WormBook. , ed. The C. elegans Community, WormBook (2007).
- Williams, B. D., Schrank, B., Huynh, C., Shownkeen, R., Waterston, R. H.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
