تحرير الجينوم الفعال للفئران بواسطة كريسبر التثقيب الكهربائي للزيجوت

تم تبسيط تحرير الجينوم في الفئران الحية إلى حد كبير وأصبح متاحا وبأسعار معقولة منذ ظهور تحرير كريسبر¹،^2،3. استخدمت محاولات التحرير الأولية للحيوانات الحقن المجهري لتوصيل كريسبر Cas9 mRNA / sgRNA إلى أجنة في المرحلة النووية⁴،^5،6. في حين أن الحقن المجهري فعال للغاية ، فإن مقدار الممارسة المطلوبة لإتقانه بالكامل قد لا يكون مناسبا للمتدربين والطلاب ويتطلب أيضا معدات باهظة الثمن لا يستطيع المختبر الممول بشكل متواضع تحملها. عادة ما يتم إجراء الحقن المجهري من قبل فنيين خبراء في مرافق معدلة وراثيا مع جداول زمنية وأسعار خدمة تحدد المعدل للعديد من الباحثين. وهناك نهج أكثر سهولة هو نهج التثقيب الكهربائي ، والذي ثبت أنه فعال للغاية لتوصيل كريسبر Cas9 mRNA / sgRNA إلى أجنة في المرحلة النووية⁷. اقترحت التحسينات الإضافية في استراتيجيات تحرير وتسليم جينوم كريسبر أن RNPs المجمعة مسبقا والتي تعمل بالفعل مع sgRNAs قد تكون وسيلة فعالة لتقليل الفسيفساء⁸.

كان الأساس المنطقي وراء تطوير واستخدام هذا البروتوكول هو تجاوز العديد من القيود والعقبات المرتبطة بالحقن المجهري. كما يوحي الاسم ، فإن الطريقة السهلة والداخلية والفعالة من حيث التكلفة والتي يمكن أن تحدد بسرعة ما إذا كانت تصميمات sgRNA غير المختبرة ستكون جديرة بالاستخدام أثناء تجربة الحقن المجهري ستكون خطوة مراقبة جودة المرور الأولى مريحة للغاية (الشكل 1). في حين أن هذه الطريقة لا يمكن أن تحل محل الحقن المجهري لاستراتيجيات أكثر تعقيدا ، مثل إدخال تسلسلات الحمض النووي للمتبرع الطويل للنتائج القائمة على إعادة التركيب ، إلا أنها مثالية للاستراتيجيات الأقل تعقيدا مثل عمليات الحذف أو الإدراج الصغيرة ووضع علامات على الجينات. هذه الطريقة مناسبة للباحثين ذوي المهارات الأساسية لمعالجة الأجنة الذين لديهم احتياجات تحرير بسيطة ، أو يرغبون في اختبار فرضيتهم ضمن الإطار الزمني لتطوير ما قبل الزرع ، أو يفضلون اختبار sgRNAs في الأجنة قبل تحديد موعد مع أخصائي الحقن المجهري. هنا ، يتم تسليم كواشف التحرير بشكل عابر إلى أجنة في المرحلة النووية مثل Cas9 / sgRNA RNPs عبر التثقيب الكهربائي (سلسلة من النبضات الكهربائية) لزيادة الكفاءة إلى أقصى حد مع تقليل الفسيفساء⁸. باستخدام طريقة التنميط الجيني للجنين ، تتوفر نتائج التحرير في حوالي 1 أسبوع⁹ ، مما يقلل من الحاجة إلى تطبيقات الحقن المجهري المختلفة بتكلفة منخفضة بشكل كبير.

تبلغ فعالية هذه الطريقة ذروتها في مرحلة الجنين الطليعي النواة ، عندما لا يكون الجنين قد دمج بعد نوى الأم والأب أو دخل المرحلة S (الشكل 2). يستخدم التبويض الفائق لزيادة عدد الزيجوتات إلى أقصى حد، ولكنه ينتج كلا من الزيجوت الطليعي النووي والبيض غير المخصب. يمكن أيضا اختيار الزيجوت الصحي مسبقا قبل التثقيب الكهربائي لزيادة الكفاءة الكلية. نظرا لأن بروتوكولات التثقيب الكهربائي الأخرى قد حررت الزيجوت بكفاءة دون الحاجة إلى تضمين خطوة مماثلة⁷،10،^11،12،13،¹⁴،^{15 ،} فإن الخطوة الاختيارية لهذا البروتوكول هي التآكل الطفيف للمنطقة الشفافة (ZP). ZP عبارة عن طبقة بروتين سكري تساعد على ربط الحيوانات المنوية ، واستجابة الجسيم القمي ، والإخصاب المحيط بالأجنة في المرحلة الأولية. في تجربتنا ، وجدنا أن التآكل اللطيف القائم على الحمض ل ZP يوفر توصيلا موثوقا به للثقب الكهربائي Cas9 RNP مع تأثير هامشي فقط على الجدوى.

لقد لاحظنا معدلات توصيل RNP بكفاءة تصل إلى 100٪ عن طريق التثقيب الكهربائي في سلالات الماوس التي يشيع استخدامها في أبحاث مثل C57BL / 6J و C57BL / 6N ^9,16. طورت مجموعات مستقلة أيضا إجراءات قائمة على التثقيب الكهربائي بكفاءة أكبر من أو مطابقة الحقن المجهري 11،12،13،^14،15،¹⁷ ، مع بروتوكولات التثقيب الكهربائي التي تعمل بشكل جيد في الفئران¹⁸،¹⁹ ، الخنزير 20،^21،22 والبقرة ²³ ، لذلك نقترح أن يقارن القراء البروتوكولات للعثور على الظروف التي تناسب احتياجاتهم التجريبية والمعدات. يستخدم النظام الموصوف هنا مواد ومعدات شائعة ، ولا يتطلب سوى مهارات التلاعب بالأجنة الأساسية. هذه التقنية فعالة لمجموعة من استراتيجيات التحرير ، مما يجعل هذه الطريقة متاحة على نطاق واسع لمجتمع البحث.

يعد تصميم دليل RNAs الصغير المثالي (sgRNAs) أمرا ضروريا للتحرير الفعال. نوصي بفحص اثنين إلى ثلاثة استراتيجيات sgRNA لكل موقع مستهدف مباشرة في أجنة الفئران ، خاصة إذا كان إنشاء خط الماوس مطلوبا. بمجرد التصميم ، يوصى باستخدام طرق خالية من الاستنساخ مثل النسخ في المختبر (IVT) لإنتاج sgRNAs عالية الجودة³. يتم خلط RNPs و sgRNAs مع 30-50 أجنة في المرحلة النووية المعالجة وتتعرض لسلسلة من النبضات الكهربائية لاختراق ZP وغشاء الخلية مؤقتا أولا ، مع نبضات لاحقة لإبقاء المسام مفتوحة والكهربائي RNPs من خلال الزيجوت²⁴. بعد التحسين ، وجدنا أن ست نبضات 3 مللي ثانية عند 30 فولت للأجنة السائبة (~ 50) كانت مثالية لتحرير الفعالية والجدوى ، مما يوفر توصيل Cas9 / sgRNA RNP عالي الكفاءة⁹،^16،25. يمكن تأكيد أحداث التحرير في توتية الماوس الفردية باستخدام مجموعة متنوعة من استراتيجيات التحقق الشائعة لتحرير كريسبر ، مثل تعدد الأشكال لطول شظية التقييد (RFLP) ، وهضم نوكلياز T7 ، وتسلسل سانجر لمنطقة الاهتمام²⁶.

الطريقة الحالية هي الأنسب لمخططات التحرير البسيطة (الشكل 3) ، مثل الإدراج / الحذف (indels) ، وعمليات الحذف ذات الحجم الخارجي بترتيب 500-2000 نقطة أساس ، وتسليم طفرات النقاط والإدخالات الصغيرة مثل علامات C- أو N-Terminal (على سبيل المثال ، FLAG أو HA أو V5) ⁹،^16،27. لا تزال إمكانية تحرير الجينوم المعقد ، مثل الإدخالات الكبيرة لعلامات الفلورسنت أو الأليلات الشرطية ، غير مؤكدة وهي محور التركيز الحالي للتحسينات القادمة.

يمكن إتقان هذه الطريقة بسهولة ويمكن استخدامها لاختبار sgRNAs بسرعة في أجنة الفئران المستزرعة في أسبوع واحد⁹ (الشكل 1). يقدم في هذا العمل بروتوكول من ست خطوات ، والذي يتضمن 1) تصميم sgRNA. 2) توليف sgRNA. 3) الإباضة والتزاوج. 4) زراعة الأجنة وجمعها ومعالجتها ؛ 5) تجميع RNP والتثقيب الكهربائي ؛ 6) زراعة الأجنة والتنميط الجيني. يتم توفير معلومات حول جميع المواد المستخدمة (جدول المواد). كعنصر تحكم إيجابي ، تم تضمين الكواشف لتحرير موضع التيروزيناز (صور)^9،16 في الجدول التكميلي 1.

التزمت جميع رعاية الحيوانات واستخدامها في جميع أنحاء هذا البروتوكول بسياسات قانون رعاية الحيوان ودليل ILAR لرعاية واستخدام المختبر واتبعت إرشادات AVMA للقتل الرحيم وإرشادات وسياسات لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية بجامعة بنسلفانيا (IACUC). تمت مراجعة بروتوكول رعاية الحيوان واستخدامه والموافقة عليه من قبل جامعة بنسلفانيا IACUC لهذا المشروع. على سبيل الامتثال والحذر ، يرجى البحث عن جميع التراخيص اللازمة قبل محاولة هذا البروتوكول.

1. sgRNA وتصميم oligo المانحين الاختياري

1. تصميم sgRNA
   1. حدد sgRNAs المرشحة من أي خوارزميات مستخدمة على نطاق واسع عبر الإنترنت ، مثل Sequence Scan ل CRISPR (SSC ؛ http://crispr.dfci.harvard.edu/SSC/) ²⁸ أو CRISPick (https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public) ²⁹. نظرا لأن كل منصة فريدة من نوعها ، يرجى قراءة تعليمات المستخدم بعناية من أجل تصميم sgRNAs مثالية. بالنسبة للتجارب in/del، حدد اثنين إلى ثلاثة sgRNAs لاختبارها. بالنسبة لعمليات الحذف ، يتم اقتراح sgRNAs التي تحيط بالمنطقة المستهدفة ، على سبيل المثال ، اثنين من sgRNAs في المنبع من الهدف واثنين من sgRNAs في اتجاه مجرى الهدف.
      ملاحظة: في حين أن خوارزميات sgRNA المختلفة عبر الإنترنت تأخذ في الاعتبار الأهداف خارج الأهداف لتجنب تصميمات sgRNA المعيبة ، فإن أداة BLAST من NCBI مفيدة في تأكيد جودة تسلسلات sgRNA المحددة.
   2. أدخل 19-20 نيوكليوتيدات (nt) محددة من الخطوة السابقة (1.1.1) في المنطقة المتغيرة من oligo sgRNA (الجدول التكميلي 1) وشراء sgRNA المركب كأوليغوس DNA مخصص.
      ملاحظة: تنقية الصفحة غير مطلوبة.
2. (اختياري) تصميم oligo المانحة للإصلاح الموجه بالتماثل (HDR) بوساطة الضرب.
   1. صمم قليل النوكليوتيد المناسب أحادي الشريط (ssODN) بناء على النتيجة التجريبية المرغوبة (طفرة النقطة الدقيقة ، إدخال loxP ، إدخال علامة صغيرة ، إلخ) ، مع الحفاظ على الطول الإجمالي إلى 100-200 nt مع أذرع متجانسة تبلغ 50 nt أو أكثر تحيط بالمنطقة الوسطى.
   2. لضمان كفاءة أعلى في الضرب ، صمم sgRNA ليكون مكملا ل ssODN³⁰ ، واستبدل تسلسل الشكل المجاور للمسافة الأولية (PAM) بطفرة صامتة لمنع القطع المتكرر بواسطة إنزيم Cas9.
   3. اطلب ssODN باستخدام خيار oligo المخصص.

2. توليف sgRNA

1. إنشاء قالب للنسخ في المختبر (IVT)
   1. لإنشاء قالب الحمض النووي ل sgRNA IVT من خلال تفاعل البوليميراز المتسلسل ، قم بإعداد تفاعل IVT في أنبوب شريط PCR خال من الحمض النووي الريبي. (انظر الجدول التكميلي 2).
   2. استخدم شروط التدوير الحراري التالية:
      95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ؛ 30 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ، 57 درجة مئوية لمدة 10 ثوان ، و 72 درجة مئوية لمدة 10 ثوان ؛ ثم 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة
   3. للتحقق من نجاح تفاعل PCR لقالب الحمض النووي sgRNA ، تم دمج 5 ميكرولتر من المنتج مع 1 ميكرولتر من صبغة تحميل 6x على هلام أغاروز 2٪ (بالوزن / المجلد).
      ملاحظة: حجم المنتج المتوقع هو 127 نقطة أساس. يمكن تخزين أي تفاعل PCR متبقي عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 5 أشهر.
2. النسخ في المختبر (IVT) من sgRNA
   1. لتوليد sgRNA ، قم بإعداد خليط التفاعل (T7 IVT وفقا لتعليمات الشركة المصنعة) في أنبوب PCR ونفض الغبار لخلط الكواشف.
      ملاحظة: انظر الجدول التكميلي 3 للحصول على مثال لإعداد التفاعل. تفاعل IVT حساس للتلوث RNase. لذلك ، بذل قصارى جهدك لتوفير بيئة خالية من RNase.
   2. للسماح للتفاعل بالبدء والمضي قدما ، قم باحتضان خليط تفاعل IVT لمدة >18 ساعة عند 37 درجة مئوية إما في دورة حرارية أو كتلة حرارية.
   3. لتحلل قالب الحمض النووي الأصلي (الخطوة 2.1.3) ، أدخل 1 ميكرولتر من DNase I (وحدتان لكل تفاعل) واحتضان التفاعل لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
   4. لتعزيز ارتباط الحمض النووي الريبي بخرز التنقية المغناطيسية ، اجمع 129 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪ في التفاعل ، والذي سيكون الآن 150 ميكرولتر.
   5. لإعادة تعليق حبات التنقية ، التي تميل إلى الاستقرار أثناء التخزين ، دوامة القسمة لمدة 10 ثوان على الأقل.
   6. لتنقية sgRNAs ، أضف 100 ميكرولتر من الخرزات المعاد تعليقها (الخطوة 2.2.5) إلى تفاعل IVT (الخطوة 2.2.4) واخلطها برفق عن طريق السحب لأعلى ولأسفل 10x.
   7. للسماح بالربط ، اترك الخليط يرتاح عند RT لمدة 5 دقائق.
   8. لعزل sgRNA عن منتجات التفاعل غير المدمجة ، ضع التفاعل على الحوامل المغناطيسية لمدة 5 دقائق في RT وانتظر حتى تتشكل حبيبات صغيرة.
   9. لغسل sgRNAs ، تخلص أولا من المادة الطافية بعناية ثم أضف 200 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 80٪ بعيدا عن الحبيبات.
      ملاحظة: أثناء خطوة غسل الإيثانول بنسبة 80٪ (حجم / حجم) ، من الأهمية بمكان تجنب إزعاج الحبيبات عن طريق السحب ، لأن هذا سيقلل من تركيزات sgRNA بشكل كبير. بدلا من ذلك ، ماصة برفق 80٪ من الإيثانول حتى يتم غمر الحبيبات ، وإزالة الحجم برفق باستخدام ماصة.
   10. كرر الخطوة السابقة (الخطوة 2.2.9) وجفف الحبيبات في الهواء لمدة لا تزيد عن 5-6 دقائق وإلا سيتم ربط sgRNA بشكل دائم بالخرز.
   11. قم بإخراج sgRNA ب 20 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز عن طريق سحب الحبيبات 10x ، والتحضين لمدة دقيقتين عند (RT) ، ثم وضعها مرة أخرى على الحامل المغناطيسي لفصل الخرز عن sgRNA المنقى الآن.
   12. لتقييم جودة وكمية sgRNA ، استخدم أداة مثل مقياس الطيف الضوئي أو المحلل الحيوي. بدلا من ذلك ، على هلام الأغاروز 2٪ ، قم بتشغيل 2 ميكرولتر من sgRNAs ، على غرار الخطوة 2.1.3.
       ملاحظة: يتم تأكيد الجودة من خلال نطاق واحد واضح. يمكن استخدام ما تبقى من sgRNA على الفور أو تخزينه في ظروف -80 درجة مئوية.

3. الإباضة

1. لتوفير أجنة كافية لاختبار كل تصميم من تصميم sgRNA ، قم بالإباضة من اثنين إلى ثلاثة إناث C57BL / 6J تتراوح أعمارهن بين 3-5 أسابيع ، كما هو موضح سابقا⁹. يوصى بالكهرباء 20-30 جنينا لكل sgRNA لتوليد نتائج كافية لتأكيد الفعالية.
   ملاحظة: إذا نجح الإخصاب ، فتوقع 10-20 جنينا لكل تزاوج.
2. للحث على الإباضة ، اتبع جدول حقن الهرمونات هذا:
   1. اليوم الأول: تطبيق 5 وحدة دولية من موجهة الغدد التناسلية في مصل الفرس الحوامل (PMSG) (100 ميكرولتر) من خلال حقنة داخل الصفاق (IP) باستخدام حقنة 26 جم في إناث الفئران البالغة من العمر 3-5 أسابيع.
   2. يوم 3: بعد 46-48 ساعة من حقن PMSG ، حقن 5 وحدة دولية من موجهة الغدد التناسلية المشيمية البشرية (hCG) (100 ميكرولتر) من خلال حقن IP للحث على الإباضة.
   3. لإعداد التربية ، قم بإقران الإناث 1: 1 مع ذكر من تربية موثوقة مباشرة بعد حقن قوات حرس السواحل الهايتية.
      ملاحظة: لمنع الهرمونات من التدهور وفقدان النشاط ، قم بإجراء الحقن في أقل من 30 دقيقة من الذوبان.

4. جمع الأجنة ومعالجتها

1. جمع الأجنة
   1. للقتل الرحيم للإناث واسترداد المواد اللازمة ، كما هو موضح سابقا³¹ ، تأكد أولا من تأكيد الطريقة المناسبة وفقا للسياسات المؤسسية. على سبيل المثال ، استخدم اختناق CO₂ و / أو خلع عنق الرحم و / أو طرق أخرى معتمدة.
      ملاحظة: عادة ، تظهر >75٪ من الإناث المحفزات بالهرمونات سدادات جماعية ، مما يشير إلى التزاوج الناجح.
   2. لمنع الشعر من جعل جمع الأنسجة صعبا ، ضع الإناث الرحيمة على ظهورهن ورش 70٪ (حجم / حجم) من الإيثانول على منطقة البطن ليتم فتحها جراحيا.
      ملاحظة: من هذه النقطة فصاعدا ، ينصح بإجراء الخطوات الجراحية في غطاء جيد التهوية من أجل الحفاظ على بيئة معقمة وتقليل احتمالية التلوث.
   3. لفتح تجويف البطن وإزالة قنوات البيض ، قم بقص طبقة الجلد / الشعر (تحت الجلد) بمقص جراحي ، وحدد موقع المبيضين (الشكل 4) ، الموجودان بالقرب من الكلى ويتشاركان جزءا من وسادة دهنية. تقع قنوات البيض بالقرب من المبايض (الشكل 4). قم بإزالة قناتي البيض جراحيا من الأنثى ووضعهما في قطرات فردية سعة 50 ميكرولتر من وسط M2 + BSA (4 مجم / مل BSA) (الشكل 5 أ).
      ملاحظة: يمكن عرض الإرشادات التفصيلية لهذا القسم من الإجراء بصريا³¹ أو اتباعها خطوة بخطوة⁹ باستخدام البروتوكولات المنشورة مسبقا.
   4. لتحرير مجمعات الخلايا الركامية والبويضة (CoCs) التي تحتوي على البويضات (الشكل 4) ، استخدم ملقط التشريح لشق أمبولة قناة البيض أثناء المشاهدة من خلال المجهر المجسم.
   5. لتقليل كمية الحطام (الدم والدهون والأنسجة) ، قم بنقل ودمج كل CoC في قطرة واحدة سعة 50 ميكرولتر من وسائط M2 + BSA مع ماصة محمولة باليد مضبوطة على 20-30 ميكرولتر لتجنب ترحيل الحطام.
2. إزالة الخلايا الركامية
   1. للبدء في إزالة الخلايا الركامية من الزيجوت (الشكل 4) ، انقل CoCs بأقل قدر ممكن من الوسائط الإضافية إلى قطرة من 100 ميكرولتر M2 + hyaluronidase (الشكل 5B) ، واخلطها برفق عن طريق سحب CoCs حتى يتم فصل الأجنة بشكل واضح عن الخلايا الركامية الأصغر بكثير. تأكد من تقليل تعرض M2 + hyaluronidase للأجنة إلى الحد الأدنى ، لأنه قد يؤثر على البقاء.
      ملاحظة: يمكن للمرء إما التسخين المسبق (37 درجة مئوية) أو إضافة 50 ميكرولتر إضافية من M2 + hyaluronidase إذا لم تنفصل الأجنة عن الخلايا الركامية في غضون دقيقتين.
   2. لتخفيف الهيالورونيداز وإزالة الخلايا الركامية السائبة من الزيجوت ، استخدم ماصة تعمل بالفم لنقل الزيجوت إلى قطرة جديدة 50 ميكرولتر M2 + BSA.
      ملاحظة: تتطلب معظم الخطوات التي تتجاوز هذه النقطة استخدام ماصة تعمل بالفم ما لم يذكر خلاف ذلك. في حين أن خطر التلوث من المستخدم منخفض ، يوصى باستخدام مرشح هواء مضمن للحفاظ على بيئة معقمة. يرجى الرجوع إلى الطرق الموضحة سابقا لإعداد واستخدام هذه الأداة ^9,31.
   3. باستخدام ماصة الفم ، مرر الأجنة عبر ما لا يقل عن أربع إلى خمس قطرات أخرى 50 ميكرولتر M2 + BSA لتقليل عدد الخلايا الركامية.
3. (اختياري) ترقق المنطقة pellucida بمحلول حمض التيرود (AT).
   1. لتآكل المنطقة الشفافة للجنين وتقليل العوائق المادية الإضافية لتسليم الكاشف ، انقل الأجنة إلى قطرة 100 ميكرولتر من محلول AT قبل التسخين (37 درجة مئوية) على لوحة 60 مم (الشكل 5C). راقب الزيجوت باستمرار باستخدام مجهر مجسم حتى يتآكل حوالي 30٪ من المنطقة الشفافة⁹. يجب أن يكون إجمالي التعرض ل AT 60-90 ثانية. يمكن أن يؤدي التعرض المطول ل AT إلى إذابة المنطقة الشفافة تماما وتعريض بقاء الجنين للخطر.
      ملاحظة: للحصول على إرشادات وصور مفصلة لهذا القسم من الإجراء ، يرجى الرجوع إلى الطرق المنشورة مسبقا^9،16.
   2. لتخفيف AT، استخدم ماصة الفم لتمرير الأجنة من خلال ما لا يقل عن أربع قطرات 50 ميكرولتر من M2 + BSA.
   3. لتحديد ما إذا كان قد تمت معالجة عدد مناسب من الأجنة ، استخدم مجهرا مجسما لعد الأجنة. اعتمادا على عدد الفئران الإناث المستخدمة ، يمكن للمرء أن يتوقع ما يقرب من 10-20 زيجوت قابلة للحياة لكل أنثى.
      ملاحظة: في هذه المرحلة، ينبغي أن تكون الأجنة خالية نسبيا من الحطام الذي من شأنه أن يحول دون تقييم الكمية والنوعية. على سبيل المثال ، إذا كنت تستخدم خمس إناث ، فمن المحتمل أن تكون أعداد الزيجوت المتوقعة بين 50-100 ، وسيكون عداد الخلايا الميكانيكية مناسبا لتتبع الأجنة. من الشائع فقدان حوالي 10٪ -20٪ من الأجنة بسبب الفشل في الإخصاب أو التبويض بويضات منخفضة الجودة. خلال الخطوة التالية ، قم بتخزين الأجنة لفترة وجيزة في 50 ميكرولتر من M2 + BSA لمدة لا تزيد عن 30 دقيقة في حاضنة.

5. تجميع RNP والتثقيب الكهربائي

1. تجميع RNP
   1. لتجميع مركب RNP ، استخدم جداول الأمثلة المرفقة لدمج مخاليط التفاعل المناسبة بناء على استراتيجية التحرير المطلوبة في المخزن المؤقت RNP (100 mM HEPES pH 7.5 ، 750 mM KCl ، 5 mM MgCl 2 ، 50٪ جلسرين ، و 100 mM Tris (2-carboxyethyl) فوسفين هيدروكلوريد [TCEP] في ماء خال من النيوكلياز)
      ملاحظة: TCEP هو عامل اختزال مناسب ولكن له عمر نصف قصير في المحاليل المائية. لذلك ، أضف TCEP قبل تجميع مجمع RNP مباشرة.
      1. للحصول على إندلس غير متماثل للانضمام النهائي (NHEJ) ، راجع الجدول التكميلي 4.
      2. للتحرير بوساطة الإصلاح الموجه بالتماثل (HDR) ، راجع الجدول التكميلي 5.
      3. للاطلاع على عمليات الحذف الهندسية باستخدام sgRNAs المقترنة، يرجى الرجوع إلى الجدول التكميلي 6.
         1. بغض النظر عن الاستراتيجية ، اجمع الكواشف المطلوبة في RT في أنبوب PCR.
         2. للسماح بتكوين مركب RNP ، احتضن الخليط لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية.
            ملاحظة: يمكن تخزين مجمع RNP في RT لمدة تصل إلى 1 ساعة.
2. التثقيب الكهربائي
   1. لتخفيف BSA قبل التثقيب الكهربائي ، مرر الأجنة من خلال قطرتين على الأقل من 50 ميكرولتر من وسائط المصل المخفضة.
      ملاحظة: يزيد BSA من المقاومة أثناء التثقيب الكهربائي ويمكن أن يتلف الزيجوت.
   2. لتحضير وخلط الزيجوت (الخطوة 4.3.2) مع مركب RNP (الخطوة 5.1.1.2) للتثقيب الكهربائي ، ماصة الفم 25-30 أجنة في قطرة 10 ميكرولتر من وسائط المصل المخفضة ، ثم استخدم ماصة محمولة بإضافة 10 ميكرولتر من مركب RNP (الخطوة 5.1.1.2).
   3. لتخفيف الجلسرين اللزج من مركب RNP وتجانس العينة ، اخلطه عن طريق سحب 10x أو حتى لا يظهر الخليط علامات اللزوجة (نمط دوامة) باستخدام مجهر مجسم.
   4. لتحضير العينة لإدخالها في جهاز التثقيب الكهربائي ، ماصة 20 ميكرولتر من خليط الجنين + RNP في كفيت كهربي 0.1 سم مع تجنب الفقاعات.
   5. لتوصيل كواشف التحرير إلى الزيجوت ، قم بكهرباء الأجنة باستخدام بروتوكول الموجة المربعة مع هذه الشروط: 30 فولت ، 4-6 نبضات ، طول نبضة 3 مللي ثانية ، و 100 فترة نبضة.
   6. لاسترداد الزيجوت من الكوفيت ، استخدم ماصة يدوية لتوصيل 50 ميكرولتر من KSOM + BSA (1 مجم / مل BSA) إلى الجزء العلوي من الكوفيت لطرد الأجنة التي ربما استقرت في القاع. ماصة برفق هذا الخليط للخارج وعلى طبق 60 مم.
   7. كرر الخطوة 5.2.6 على الأقل 2x-3x وادمج كل تدفق على طبق 60 مم حتى يتم استرداد معظم الأجنة.
      ملاحظة: الانتعاش النموذجي هو >90٪ من الأجنة المحملة في الأصل. لضمان بقاء الجنين ، اختبر الحاضنة وتحقق من تواريخ انتهاء الصلاحية لجميع الكواشف. الأجنة عرضة لظروف الثقافة غير المثالية مثل درجة الحرارة ومستوى CO₂ والرطوبة ودرجة الحموضة.

6. زراعة الأجنة والتنميط الجيني

1. زراعة الأجنة
   1. لزراعة الزيجوت إلى المرحلة المرغوبة ، استخدم ماصة الفم لنقل 20-30 زيجوتا إلى قطرة من KSOM + BSA في صفيحة زراعة متوازنة مسبقا ونقل الأجنة إلى القطرة (الشكل 5D). احتضان اللوحة طوال الليل في 5٪ CO₂ ، عند 37 درجة مئوية ، مع رطوبة 95٪.
      ملاحظة: قم بالتوازن المسبق عن طريق وضع لوحة استزراع 35 مم محضرة في حاضنة إما في اليوم السابق أو قبل 4 ساعات على الأقل من الحضانة (الشكل 5D).
   2. لتعزيز ظروف النمو المثالية ، انقل الأجنة المكونة من خليتين فقط في اليوم التالي إلى قطرة جديدة من خليط KSOM + BSA باستخدام مجهر مجسم والعودة إلى الحاضنة. تأكد من ترك أو التخلص من الأجنة الميتة أو غير المخصبة.
      ملاحظة: تنمو الأجنة في المرحلة البدائية النووية عادة لتصبح توتية بعد 72 ساعة من المزرعة والكيسات الأريمية بعد 84 ساعة.
2. التنميط الجيني
   1. لتخفيف مكونات الوسائط التي قد تتداخل مع تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل ، اغسل أجنة التوتية / الكيسة الأريمية باستخدام ماصة الفم عن طريق المرور عبر قطرتين من DPBS.
   2. لتحميل أجنة مفردة للتحلل ، انقل الأجنة الفردية إلى بئر واحد من شريط تفاعل البوليميراز المتسلسل المكون من 8 آبار عن طريق ضبط ماصة على 1 ميكرولتر ، ثم أضف 10 ميكرولتر من محلول التحلل (50 mM KCl ، 10 mM Tris-HCl ph 8.5 ، 2.5 mM MgCl 2 ، 0.1 مجم / مل جيلاتين ، 0.45٪ Nonidet P-40 ، 0.45٪ توين 20 ، 0.2 مجم / مل بروتين K في H₂ O الخالي من النيوكلياز).
      ملاحظة: أضف بروتيناز K قبل تحضير محلول التحلل مباشرة.
   3. لتحليل الأجنة ، قم ببرمجة دورة حرارية إلى 55 درجة مئوية لمدة 4 ساعات ، ثم قم بإلغاء تنشيط البروتين K مع حضانة لمدة 10 دقائق عند 95 درجة مئوية.
      ملاحظة: خاصة للمستخدمين لأول مرة ، حاول تجربة تحرير في موقع Tyr . تم تحسين سير العمل هذا ويمكن أن يكون بمثابة عنصر تحكم إيجابي. إذا لزم الأمر ، قم بتخزين محللات الجنين عند 4 درجات مئوية لمدة 2-3 أيام أو في الفريزر لمدة تصل إلى أسبوعين قبل تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل. منع دورات التجميد والذوبان المتكررة.
   4. لزيادة فرص تحليل التنميط الجيني الناجح ، قم بإجراء إستراتيجية PCR متداخلة عن طريق تضخيم شظايا الحمض النووي الأطول قليلا التي تحيط بالموقع المستهدف بالإضافة إلى المناطق التي سيتم استخدامها لتضخيم جزء أكثر دقة من الحمض النووي. اتبع الشروط الواردة في الجدول التكميلي 7.
   5. اتبع شروط الدورة الحرارية المذكورة أدناه:
      95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة
      30+ دورة: 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ، 60 درجة مئوية لمدة 10 ثوان ، و 72 درجة مئوية لمدة 10 ثوان
      72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة
   6. لإعداد المرحلة الثانية من استراتيجية تفاعل البوليميراز المتسلسل المتداخلة ، قم بإجراء تخفيف 1:10 لمنتج PCR الأول (الخطوة 6.2.5) وقم بتحميل 2 ميكرولتر من هذا في تفاعل PCR التالي (مع البادئات المصممة لتكون داخل amplicon السابق).
      ملاحظة: يجب تخفيف تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل الأول لتقليل ترحيل البادئات المرافقة في تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل الثاني. قم بإعداد PCR المتداخل باتباع الخطوات الواردة في الجدول التكميلي 8.
   7. ضع تفاعل PCR في جهاز تدوير حراري باستخدام ظروف الدورة التالية:
      95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة
      30 دورة: 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ، 60 درجة مئوية لمدة 10 ثوان ، و 72 درجة مئوية لمدة 10 ثوان
      72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة
      ملاحظة: عادة ما تكون >90٪ من تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل ناجحة عندما يكون حجم amplicon 500 نقطة أساس أو أقل.
   8. (تحكم اختياري) بالنسبة للطفرات in/del بوساطة NHEJ باستخدام Tyr كعنصر تحكم إيجابي، قم بهضم 10 ميكرولتر من منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل المتداخلة من الخطوة 6.2.7 عن طريق الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات باستخدام 10 U من HinfI في تفاعل 20 ميكرولتر (انظر الجدول التكميلي 9). على هلام الأغاروز 2٪ ، قم بتشغيل المنتج المهضوم لتقييم التحرير واستخدام منتج PCR غير مهضوم كعنصر تحكم في التحميل. قم بتشغيل الجل عند 135 فولت لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: تم اختيار استخدام HinfI كإنزيم تقييد مناسب بسبب وجود موقع HinfI في مكان مناسب داخل المنطقة المستهدفة sgRNA والتي من المتوقع أن يتم استئصالها عند تحرير NHEJ الناجح. تم وصف طريقة ونتائج مفصلة سابقا ^9,16.
   9. (تحكم اختياري) بالنسبة للطفرات بوساطة HDR باستخدام Tyr كعنصر تحكم إيجابي ، اهضم 10 ميكرولتر من منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل المتداخلة من الخطوة 6.2.7 عن طريق الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات باستخدام 10 U من EcoRI في تفاعل 20 ميكرولتر (انظر الجدول التكميلي 10). على هلام الأغاروز 2٪ ، قم بتشغيل المنتج المهضوم لتقييم التحرير واستخدام منتج PCR غير مهضوم كعنصر تحكم في التحميل. قم بتشغيل الجل عند 135 فولت لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: يستفيد اختيار EcoRI كإنزيم تقييد تشخيصي من التسلسل الأصلي الموجود في المنطقة المستهدفة sgRNA ، حيث ، عند HDR الناجح ، يتم استبدال موقع HinfI الذي يحدث بشكل طبيعي بموقع EcoRI ، ويتم إجبار طفرة إزاحة الإطار التي تتداخل مع جين Tyr. بالنسبة لتحليل HDR ، قم بإجراء كل من تحليلات NHEJ (الخطوة 6.2.8) و HDR (الخطوة 6.2.9) على كل عينة حيث يمكن أن تحدث كلتا النتيجتين ويمكن أن تساعد في تحديد الفسيفساء. تم وصف طريقة ونتائج مفصلة سابقا ^9,16.

تولد هذه الطريقة أكثر من 100 ميكروغرام من sgRNA (20 ميكرولتر بتركيز >6000 نانوغرام / لتر) لتجميع Cas9 / sgRNA RNP الفعال. عادة ما تنتج طريقة الإباضة الفائقة الروتينية الموصوفة هنا 10-20 جنينا قابلا للحياة لكل أنثى مسدودة. بسبب أخطاء التعامل والخسائر النموذجية المرتبطة بالتلاعب بالأجنة ، من المتوقع أن يتم تخصيب 80٪ من الأجنة وقابلة للحياة وفي حالة ممتازة بعد التثقيب الكهربائي. لمساعدة الباحثين في تنفيذ تجربة ناجحة ، قدمنا مثالا على استراتيجية لاستهداف موضع صور للفأر كعنصر تحكم إيجابي (الشكل 6) ، بما في ذلك تصميمات oligo (الشكل 6A ، الجدول التكميلي 1) واستراتيجيات التنميط الجيني لكل من أحداث NHEJ و HDR (الشكل 6B) (الخطوة 6.2). تتوفر أمثلة مفصلة للنجاح التجريبي والنتائج 9,16.

في محاولة سابقة لمقارنة هذا البروتوكول بالحقن المجهري ، بشكل جماعي ، كانت أكثر من 30 محاولة تحرير متميزة تتضمن سبعة مختبرات متميزة لإنشاء نماذج فأرة ناجحة 9,16. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام هذه الطريقة للتحقيق والإبلاغ عن أول ارتداد أساسي في تطور الثدييات27. عند استخدام استراتيجية بسيطة مثل توصيل sgRNA واحد ، كان تسليم RNPs يصل إلى 100٪ في سلالات الماوس C57BL / 6J و C57BL / 6N ، مع حدوث تكوين في / del بنسبة 50-100٪ وبدائل صغيرة قائمة على oligo تتراوح من 14٪ -63٪ 9,16 (الجدول 1). عند هندسة عمليات الحذف الجينومية ، يمكن أن تختلف فعالية التحرير من 3٪ إلى 100٪ ، حيث تشمل العوامل المساهمة الموقع الجينومي وتصميم sgRNA وحجم الحذف (الجدول 2). على سبيل المثال ، عمليات الحذف الأصغر من 1,000 نقطة أساس تكون أكثر نجاحا من تلك الأكبر من 1,000 نقطة أساس 9,16.

عند استخدام 60 جنينا للتثقيب الكهربائي ، يتجاوز هذا البروتوكول الحقن المجهري من حيث فعالية التحرير ، مما ينتج عنه 3-4 مؤسسة مقارنة بمؤسس واحد من الحقن المجهري9. بالنسبة لتجارب خروج المغلوب الجيني في سلالة الفئران C57BL / 6N باستخدام sgRNA متطابقة ، تفوقت هذه الطريقة على الحقن المجهري ، مما أسفر عن متوسط أربعة مؤسسة9 (الجدول 2). بالنسبة للإدخالات الصغيرة ، مثل وضع علامات V5 أو HA ، تم اختبار ssODNs حتى 162 nt بنجاح ، وتهدف الجهود حاليا إلى توسيع نطاق 1000-2000 nt. يعتمد نجاح هذه التجارب إلى حد كبير على فعالية sgRNA المستخدمة لتكون نتائج HDR قوية. جميع نتائج HDR تقريبا هي فسيفساء ، ولكن ما بين 31٪ -64٪ من الأجنة تظهر بعض الأدلة على الإدراج 9,16.

الشكل 1: نظرة عامة على كريسبر-EZ. نظرة عامة رسومية على سير العمل. بمجرد وضع استراتيجية وتصميم ، يمكن إنشاء الأجنة المحررة واختبارها في حوالي 1 أسبوع. تم تعديل هذا الرقم بإذن من Modzelewski et al.9. وتشن وآخرون 16. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2: التوقيت المثالي لتنفيذ الإجراء. يوضح الشكل السمات والنقاط الزمنية ذات الصلة أثناء الانقسام الخلوي الأول بعد الإخصاب. لتنفيذ هذا النهج ، يتم تزويد الباحثين ببعض القرائن المرئية ، مثل التغيرات المورفولوجية ، وتقديرات وقت دورة الخلية ، والعلامات الكيميائية التي يتم ملاحظتها بشكل متكرر قبل الانقسام الأول. نظرا لأن التوقيت الدقيق للتلقيح والإخصاب غير معروف ، فإن التوصية المعقولة هي اعتبار الساعة 0 منتصف الليل. قبل دخول الزيجوت إلى المرحلة S هي اللحظة المثالية لتقديم آلات التحرير إما ل NHEJ أو HDR ، والتي تترجم إلى تنفيذ هذا البروتوكول بين الساعة 7 صباحا و 11 صباحا في الصباح. تم تعديل هذا الرقم بإذن من Modzelewski et al.9. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3: نجاح استراتيجيات التحرير. تؤدي الاستراتيجيات البسيطة مثل sgRNA واحد إلى إدخال / del عبر إصلاح NHEJ أو طفرة دقيقة عند دمجها مع قالب ssODN من خلال HDR. يمكن أيضا استخدام إصلاح NHEJ لعمليات الحذف باستخدام sgRNAs متعددة. بشكل عام ، كلما كانت الإستراتيجية أبسط ، كانت CRISPR-EZ أكثر فعالية دون مزيد من التحسين. تم تعديل هذا الرقم بإذن من Modzelewski et al.9. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 4: تحديد موقع قناة البيض والأمبولة. بعد عزل الأنسجة التناسلية جراحيا ، يجب على المرء تأمين المنطقة عن طريق الضغط اللطيف على وسادة الدهون بالملقط. وسادة الدهون هي منطقة آمنة نسبيا للتلاعب بها حتى لا تضر المبايض / قناة البيض. يجب إزالة المنطقة الموجودة في المربع المتقطع ووضعها في قطرة من M2 لمزيد من التشريح. يوضح الرسم التخطيطي للرسوم المتحركة المنطقة محل الاهتمام مع الهياكل التشريحية ذات الصلة المسماة. تم تعديل هذا الرقم بإذن من Modzelewski et al.9. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 5: الإعداد المقترح للمعالجة والاستزراع. مخططات تظهر إعدادات لوحة مختلفة لمساعدة الباحثين في إجراء كل من معالجة الأجنة والثقافة. (أ) لوحة غسيل M2 + BSA نموذجية. (ب) M2 + لوحة هيالورونيداز لإزالة الخلايا الركامية. (C) لوحة حل AT اختيارية لتخفيف Zona. (د) لوحة KSOM + BSA لزراعة الأجنة ، مع تراكب الزيت المعدني الضروري للحفاظ على درجة الحموضة والرطوبة ودرجة الحرارة. تم تعديل هذا الرقم بإذن من Modzelewski et al.9. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 6: مثال التنميط الجيني لنواتج NHEJ وHDR . (أ) رسم كاريكاتوري للمنطقة المحيطة بجين صور في جينوم الفأر. فيما يلي تفاصيل التسلسل غير المحرر (WT) حيث يوجد موقع تقييد HinfI يحدث بشكل طبيعي ، والذي يقع داخل موقع التعرف على الهدف ل sgRNA (النص الأحمر). يوجد أدناه أحد النتائج العديدة المحتملة بعد استهداف CRISPR / Cas9 الناجح حيث يتم تشكيل "in/del". من الصعب التنبؤ بالطبيعة الدقيقة لهذا التعديل ولكن من شبه المؤكد أنه سيعطل موقع HinfI. علاوة على ذلك ، يوجد أدناه تسلسل oligo للمانحين الذي يغير زوجين أساسيين لتحويل موقع HinfI إلى موقع التعرف على EcoRI. (ب) نتائج تعدد الأشكال لطول جزء التقييد التمثيلي (RFLP) بعد التحرير. يتم عرض أمثلة تحرير NHEJ (أعلى) و HDR (أسفل). تم تعديل هذا الرقم بإذن من Modzelewski et al.9. تم تعديل هذا الرقم بإذن من Modzelewski et al.9. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الجدول 1: النمط الظاهري وصلاحية الزيجوت والفئران المحررة من صور. تم تكييف هذا الجدول بإذن من Modzelewski et al.9. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول 2: نتائج تجارب حذف كريسبر-إيز والحقن المجهري. تم تكييف هذا الجدول بإذن من Modzelewski et al.9. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول التكميلي 1: قائمة oligos و ssODN المانحة. تم تكييف هذا الجدول بإذن من Modzelewski et al.9. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الجدول التكميلي 2: قالب الحمض النووي لإعداد تفاعل sgRNA. تم تكييف هذا الجدول بإذن من Modzelewski et al.9. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الجدول التكميلي 3: إعداد النسخ في المختبر . تم تعديل هذا الجدول بإذن من Modzelewski et al.9. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الجدول التكميلي 4: إعداد مجمع RNP لتشكيل NHEJ. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الجدول التكميلي 5: الإعداد المعقد RNP لتشكيل HDR. تم تكييف هذا الجدول بإذن من Modzelewski et al.9. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الجدول التكميلي 6: الإعداد المعقد RNP للحذف. تم تعديل هذا الجدول بإذن من Modzelewski et al.9. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الجدول التكميلي 7: التنميط الجيني لإعداد تفاعل البوليميراز المتسلسل. تم تعديل هذا الجدول بإذن من Modzelewski et al.9. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الجدول التكميلي 8: التنميط الجيني المتداخل إعداد تفاعل البوليميراز المتسلسل. تم تعديل هذا الجدول بإذن من Modzelewski et al.9. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الجدول التكميلي 9: إعداد ملخص تقييد HinFi. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الجدول التكميلي 10: إعداد ملخص تقييد EcoRi. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

ولا توجد إقرارات مالية ذات صلة من جانب أصحاب البلاغ.