إصابة التجمد في عضلة ماستر الفأر لإنشاء نموذج لتليف عضلات الفم والوجه

تعتبر عضلات الفم والوجه ضرورية في الأنشطة الفسيولوجية اليومية مثل المضغ والكلام والتنفس وتعبيرات الوجه¹. ومع ذلك ، في التشوهات الخلقية الفموية الوجهية ، تظهر هذه العضلات تغيرات ضامرة وتليفية ، مما يؤدي إلى ضعف صحة الجسم والإدراك الاجتماعي². لا تزال الجراحة الترميمية للوجه هي علاج الخط الأول ، ولكن ما يصل إلى 30-70٪ من مرضى ما بعد الجراحة لا يزالون يعانون من فقدان العضلات واختلال وظيفي في العضلات ^3,4 يعزى فشل تجديد عضلات الفم والوجه إلى عوامل جوهرية لا يمكن تصحيحها بالجراحة وحدها.

ظهور عضلات الفم والوجه هو حداثة تطورية ، يرافق رأس الفقاريات المعقدة والقلب^{الحجرة 5,6}. على عكس نظرائهم من الأطراف المشتقة من سوميت ، تنشأ عضلات الفم والوجه من القوس المتفرع⁷. هذه الخصائص التطورية والجينية قد تهيئهم لسلوكيات تجددية متميزة⁸. تم الإبلاغ عن أن عضلة العضلة العضلية (MAS) أصيبت بتليف شديد في الوقت الذي تجددت فيه عضلة الظنبوب الأمامية (TA) بالكامل بعد التعرض لنفس القدر من الإصابة ^1,9. ومع ذلك ، فإن الآلية الأساسية للتجديد لا تزال غير مفهومة بشكل جيد.

في هذه الدراسة ، تم إنشاء نموذج إصابة التجمد لعضلة الفئران لتسهيل التحقيق في تجديد عضلات الفم والوجه. اخترنا 14 يوما بعد الإصابة كنقطة زمنية لتقييم النمط الظاهري للتليف لأنها كانت أقرب نقطة زمنية يمكن فيها اكتشاف تباعد ملحوظ بين عضلتين. يتطلب التجديد الكامل ل MAS بعد الإصابة 40 أسبوعا على الأقل¹. باستمرار ، كشفت هذه الدراسة عن ترسب ملحوظ للكولاجين بعد إصابة التجمد في MAS مقارنة بالتجديد المنتظم ل TA في 14 يوما بعد الإصابة. بمساعدة هذا النموذج ، يمكن إجراء المزيد من الدراسات الميكانيكية لضمور العضلات والتليف ، مما سيساعد بدوره في تطوير طرق علاجية محتملة لتعزيز تجديد عضلات الفم والوجه بعد الجراحة.

تمت مراجعة جميع الإجراءات الحيوانية في هذه الدراسة والموافقة عليها من قبل اللجنة الأخلاقية لمدرسة غرب الصين لطب الأسنان ، جامعة سيتشوان (WCHSIRB-D-2020-114). تم تربية ذكور الفئران C57BL / 6 (5 أسابيع) في منشأة يتم التحكم فيها بالرطوبة (53 ± 2٪) ويتم التحكم في درجة حرارتها (23 ± 2 درجة مئوية) وكانت في دورة الضوء / الظلام لمدة 12 ساعة. انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بجميع المواد والكواشف والأدوات المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. إصابة التجمد

1. التخدير: قم بتخدير الفئران بكرات قطنية مبللة بالإيزوفلوران وحقن تيلتامين-زولازيبام داخل الصفاق بجرعة 50 مجم / كجم. تم توفير التسكين قبل وبعد الجراحة عن طريق حقن ميلوكسيكام داخل الصفاق بجرعة 1 ملغ/كغ. حماية عيونهم مع مرهم الطبيب البيطري. تم وضع وسادة تدفئة عند 38 درجة مئوية تحت الستارة الجراحية أثناء الإجراء بأكمله لتوفير الدعم الحراري للحيوان. ثبت الفئران بشريط لاصق بعد وضعها على جانبها على طاولة جراحية (الشكل 1). تقييم كفاية التخدير عن طريق فقدان منعكس الجفن ، منعكس التصحيح ، ومنعكس سحب الدواسة.
   ملاحظة: عند تطبيق تخدير الأيزوفلوران ، أمسك الماوس بيد واحدة وكرة القطن المنقوعة بالإيزوفلوران في يد أخرى. تأكد من إبقاء كرة القطن على مسافة من لتجنب الانزعاج وتهيج الجلد.
2. إزالة الشعر قبل الجراحة: استخدم ماكينة حلاقة كهربائية لحلق الشعر على ربلة الساق ووجه الفأر وتطبيق معجون إزالة الشعر بقطعة قطن على الجلد ، وتغطي عضلة العضل وعضلة الظنبوب الأمامية. بعد 1-2 دقيقة ، اغسل العجينة بمناديل جراحية أساسها الإيثانول (الشكل 2 أ والشكل 2 جي). تم تطهير المواقع الجراحية بثلاث جولات من فرك اليود و 75٪ من الإيثانول.
   ملاحظة: لم تكن ماكينة الحلاقة الكهربائية وحدها كافية لإزالة الشعر ، خاصة في منطقة الماستر. عند تطبيق معجون مزيل الشعر ، من المهم عدم استخدام معجون مفرط. امسح الجلد برفق عند غسل العجينة لتجنب حروق الجلد.
3. التعرض للمجال الجراحي: قم بتغطيتها بالستائر الجراحية قبل العملية الجراحية. بالنسبة لعضلة MAS ، جس أولا على طول الحافة السفلية للفك السفلي. على بعد 5 مم من الحافة ، قم بعمل شق 7 مم على طول الخط الذي يربط المفصل الفموي بالزنمة (يشير الخط المتقطع إلى موقع الشق في الشكل 2 ب).
4. بالنسبة لعضلة TA ، جس أولا على طول ربلة الساق لتحديد الحافة الأمامية لعظم الظنبوب. قطع 2 مم إلى الخلف إلى الحافة من خلال الجلد بمشرط ، بدءا من الركبة وينتهي عند الكاحل (يشير الخط المتقطع إلى موقع الشق في الشكل 2H). لكل ماوس ، إذا أصيبت عضلة MAS و TA على الجانب الأيسر ، فاستخدم العضلة الأخرى على الجانب المقابل كعنصر تحكم.
   ملاحظة: هذا القطع سطحي للغاية لضمان عدم إصابة العضلات أثناء الشق. لا ينبغي أن يكون شق الوجه قريبا جدا من الزنمة. خلاف ذلك ، سوف تتعرض الغدة النكفية ، مما يؤدي إلى نزيف مفرط أثناء عملية التجميد التالية.
5. تجميد الثلج الجاف: امسك قطعة واحدة من الثلج الجاف بالملقط المبرد مسبقا على طول المحاور الطويلة لعضلات MAS و TA (الشكل 2C والشكل 2I ، على التوالي). ضع الثلج الجاف مباشرة على سطح العضلات لمدة 5 ثوان. تأكد من أن العضلات تبدو متيبسة وشاحبة بيضاء مباشرة بعد إزالة الثلج الجاف (الشكل 2D والشكل 2J) لكنها تعود إلى لونها وملمسها الطبيعي في غضون 22-25 ثانية ، على غرار العضلات المجاورة غير المصابة (الشكل 2E والشكل 2K).
   ملاحظة: يجب تبريد الملقط الذي يحمل الثلج الجاف مسبقا لتجنب التسامي السريع للثلج الجاف. المؤقت إلزامي في إجراء إصابة التجميد لمدة 5 ثوان وحساب وقت التعافي 22-25 ثانية للعضلة. يجب التخلي عن أي عضلة ذات وقت تعافي أقصر من 22 ثانية أو أطول من 25 ثانية. هذه الخطوة تتطلب الممارسة.
6. إغلاق الجرح: بعد الشفاء التام للعضلة ، أغلق جرح الجلد بثلاث خيوط على الأقل 7-0 (الشكل 2F والشكل 2L).
7. الإنعاش: عند اكتمال الخيط ، ضع الفئران في القفص مع الدعم الحراري وراقبها باستمرار حتى يتم استعادة جميع ردود الفعل الصحيحة.

2. جمع العضلات

1. القتل الرحيم للفئران بجرعة زائدة من الأيزوفلوران ، يليه خلع عنق الرحم. حصاد عضلات MAS و TA على كلا الجانبين للتحليل النسيجي.
2. تشريح العضلات MAS: قطع الجلد على وجه الفأر وإزالة الغدة النكفية لكشف الجزء الخلفي من عضلة MAS. تشريح MAS من ملحقه الأمامي وصولا إلى ملحقه الخلفي على الفك السفلي. تشير المنطقة المنقطة البيضاء إلى الجزء المكشوف من MAS (الشكل 3 أ).
   ملاحظة: تتكون عضلة MAS من مقصورات عميقة وسطحية ، وكلاهما مرتبط ارتباطا وثيقا بسطح الفك السفلي. تأكد من الضغط على المقص إلى الفك السفلي أثناء التشريح لضمان العزل التام ل MAS. كن حذرا لتمييز الفك السفلي الوجني عن MAS من خلال حدوده بين الوجني والفك السفلي.
3. تشريح العضلات TA: قطع الجلد من الكاحل إلى الركبة وإزالة اللفافة لكشف عضلة TA. استخدم طرف ملقط التشريح الدقيق لعزل وتر TA وحركه بالكامل حتى الركبة لكسر الألياف المرتبطة بالساق. ثم قطع الوتر على الكاحل (الشكل 3 ب).
   ملاحظة: بالنسبة لعضلة TA ، هناك عدد قليل من أوتار العضلات حول كاحل الفأر. سيتطلب الأمر ممارسة لتمييز وتر TA ، وهو الأكبر والأقرب إلى الظنبوب.
4. التبريد المسبق للأيزوبنتان: تحضير برميلين عازلين ؛ املأ البرميل الصغير بالإيزوبنتان والبرميل الكبير بالنيتروجين السائل. ضع البرميل الصغير داخل البرميل الكبير قبل 10 دقائق من تشريح العضلات (الشكل 3 د).
5. تحضير قالب التضمين: اصنع قالب رقائق قصدير أسطواني لكل عينة واملأها بمركب درجة حرارة القطع المثلى (OCT).
6. مجمدة طازجة: اغمر العضلات في OCT ، مع الاحتفاظ بها بشكل عمودي على مركب OCT (الشكل 3C). استخدم حامل إبرة لنقل القالب إلى الأيزوبنتان المبرد مسبقا. انتظر 40 ثانية حتى يصبح OCT أبيض وصلب (الشكل 3D).
   ملاحظة: تأكد من أن موضع القالب ليس منخفضا جدا. خلاف ذلك ، سوف يختلط الأيزوبنتان مع OCT ويضعف عملية تجميد العضلات. يجب أن يكون مستوى OCT في القالب مشابها لارتفاع عينة العضلات. تجنب كمية زائدة من OCT لضمان التجميد السريع والفعال.
7. تخزين العينات: قم بتخزين عينات العضلات المجمدة الطازجة في لوحات 24 بئر تحمل علامات واضحة. قسم العينات على الفور أو خزنها في -80 درجة مئوية للاستخدام على المدى الطويل.

3. التحليل النسيجي

1. استخدم جهاز التبريد لقطع مقاطع بسمك 10 ميكرومتر من عينة العضلات على شرائح معالجة سطحيا.
2. ضع الشرائح في الأسيتون المثلج لمدة 20 دقيقة وجففها في الهواء في غطاء الدخان لمدة 20 دقيقة.
3. اغسل الشرائح لمدة 3 × 5 دقائق بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
   ملاحظة: من هذه الخطوة فصاعدا ، تم الاحتفاظ بالشرائح في غرفة الرطوبة لتجنب الجفاف.
4. سيريوس تلطيخ أحمر
   1. تحضير محلول عمل Sirius Red عن طريق إذابة 0.5 غرام من مسحوق Sirius Red في 500 مل من حمض البكريك المشبع.
   2. قم بتلطيخ الشرائح باستخدام حل عمل Sirius Red لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
   3. اغسل الشرائح لمدة 2 × 5 دقائق بحمض الخليك 0.5٪.
   4. بعد عملية التلوين ، يجب تجفيف العينات أولا في 95٪ إيثانول لمدة 15 ثانية ، يليه الجفاف في الإيثانول اللامائي لمدة 1 دقيقة. تتضمن الخطوة الأخيرة تركيب الشريحة باستخدام بلسم محايد.
5. تلطيخ الأنسجة المناعية
   1. قم بتخلل الأقسام بنسبة 0.3٪ Triton في PBS لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، متبوعا بغسل PBS.
   2. بالنسبة لتلطيخ Pax7 ، قم بسد الأقسام باستخدام الكاشف المزود بالمجموعة المشار إليها ؛ لتلطيخ laminin و Pdgfrα ، كتلة مع 5 ٪ ألبومين مصل البقر (BSA) و 5 ٪ مصل الحمير في PBS لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
   3. احتضان الأقسام بالأجسام المضادة الأولية ضد Pax7 و laminin و Pdgfrα طوال الليل عند 4 درجات مئوية ، متبوعا بالغسيل باستخدام PBS لمدة 3 × 5 دقائق.
   4. احتضان الأقسام بأجسام مضادة ثانوية مترافقة صبغة الفلورسنت لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة ، تليها الغسيل باستخدام PBS لمدة 3 × 5 دقائق.
   5. احتضان مع 4 '، 6-دياميدينو -2-فينيليندول (DAPI) لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، تليها الغسيل مع برنامج تلفزيوني لمدة 3 × 5 دقائق.
   6. ضع وسيط التثبيت على القسم ، ضع غطاء الغطاء في الأعلى ، واستخدم طلاء الأظافر لإغلاق غطاء الغطاء.

كشف تلطيخ HE و Sirius Red (الشكل 4 والشكل التكميلي S1) عن تجديد كامل لعضلات TA في نموذج إصابة التجمد هذا. في المقابل ، أظهر MAS ضعف تجديد الألياف العضلية وترسب المصفوفة خارج الخلية المفرط. تظهر أنسجة عضلة MAS و TA السليمة في الشكل 4A ، B ، حيث تكون الألياف العضلية في محاذاة وتظهر المنطقة الليفية فقط في الفضاء الخلالي وبين الحزم المختلفة. بينما ظلت عضلة TA إلى حد كبير نفس بنية العضلات مثل سيطرتها السليمة في 14 يوما بعد الإصابة (الشكل 4G-J) ، كانت بنية عضلة MAS مضطربة بشدة (الشكل 4C-F). ظهرت المناطق الليفية في مكان جميع الألياف العضلية تقريبا في المقاطع العرضية الأمامية والوسطى والخلفية لعضلة MAS (الشكل 4C-F).

سهل التلوين المناعي ل Pax7 (الشكل التكميلي S2) و Pdgfrα إجراء مزيد من التحقيق في الخلايا الساتلية العضلية (MuSCs) والأسلاف الليفية الأديبوجينية (FAPs) ، على التوالي. في عضلة MAS ، عند 14 نقطة في البوصة ، ظهرت نوى مكتظة بالسكان ولكن دون زيادة MuSCs بشكل متناسب (الشكل 5A ، B). تم الكشف عن عدد كبير من الألياف العضلية ذات النواة المركزية (كما هو موضح في رأس السهم الأزرق) في TA عند 14 نقطة في البوصة (الشكل 5H) ، في حين أن محيط الألياف العضلية كان بالكاد ملحوظا في MAS في المنطقة المصابة (الشكل 5E ، F). بدلا من ذلك ، لوحظ تسلل FAPs إيجابية Pdgfrα والألياف العضلية ذات القطر الصغير المشكلة حديثا (مدببة بأسهم بيضاء) (الشكل 5F).

الشكل 1: نظرة عامة على الإعداد الجراحي. (أ) تم تخدير الفأر وتثبيته على طاولة العمليات. تمت إزالة الشعر من الوجه والساق على الجانب الأيسر. تم استخدام جهاز توقيت لمراقبة تجميد العضلات ووقت الشفاء. (ب) ثلج جاف، قطره 3.5 مم وارتفاعه 6-12 مم، أعد في كأس زجاجية للتجميد. تم تبريد الملقط في الثلج الجاف لاستخدامه لاحقا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: السجل أثناء العملية لإصابة تجميد MAS و TA. (أ) إزالة الشعر لتجميد MAS. (ب) افتح الجلد لكشف عضلة MAS. ج: التجمد بالثلج الجاف على طول المحور الطويل ل MAS. د: ظهور MAS مباشرة بعد 5 ثوان من التجمد. (ه) ظهور MAS بعد 22-25 ثانية من التعافي. (و) إغلاق جرح الوجه. (ز) إزالة الشعر لتجميد TA. (H) افتح الجلد لكشف عضلة TA. (I) التجميد باستخدام الثلج الجاف على طول المحور الطويل ل TA. (ي) ظهور TA مباشرة بعد 5 ثوان من التجمد. (ك) ظهور TA بعد 22-25 ثانية من التعافي. (L) إغلاق جرح الساق. الاختصارات: MAS = مدلك. TA = الظنبوب الأمامي. تشير الخطوط المتقطعة في الشكلين 2B و 2H إلى موقع الشقوق. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: حصاد العضلات MAS و TA. أ: ظهور عضلة MAS بعد 14 يوما من إصابة التجمد. يشير الشكل البيضاوي الأحمر المتقطع إلى MAS. يظهر المثلث الأبيض المتقطع تعرض عضلة MAS. ب: ظهور عضلة TA بعد 14 يوما من إصابة التجمد. يشير الشكل البيضاوي الأحمر المتقطع إلى TA. ج: غمر عينة العضلات في مركب OCT بطريقة عمودية. د: نقل عينة العضلات إلى الأيزوبنتان المبرد بالنيتروجين. الاختصارات: MAS = مدلك. TA = الظنبوب الأمامي. OCT = درجة حرارة القطع المثلى. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: التحليل النسيجي لعضلات MAS و TA. تلطيخ سيريوس الأحمر للقسم العضلي السليم (A-E) السليم من MAS والأقسام الأمامية والمتوسطة والخلفية من MAS عند 14 نقطة في البوصة. (ف-ج) قسم العضلات السليم من TA والقسم الأمامي والأوسط والخلفي من TA عند 14 نقطة في البوصة. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. الاختصارات: MAS = مدلك. TA = الظنبوب الأمامي. نقطة في البوصة = أيام بعد الإصابة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: التحليل المناعي لعضلات MAS و TA. تلطيخ مناعي ل Pax7 و DAPI (أزرق) في (A) MAS سليمة ، (B) 14 نقطة في البوصة MAS ، (C) TA سليمة ، و (D) 14 نقطة في البوصة TA. تلطيخ مناعي للامينين ، Pax7 ، و DAPI (أزرق) في (E) MAS سليمة ، (F) 14 نقطة في البوصة MAS ، (G) TA سليمة ، و (H) 14 نقطة في البوصة TA. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. الاختصارات: MAS = مدلك. TA = الظنبوب الأمامي. نقطة في البوصة = أيام بعد الإصابة ؛ DAPI = 4 '، 6-دياميدينو -2-فينيليندول. تشير الأسهم البيضاء إلى الألياف التمثيلية ذات القطر الصغير ل MAS. تشير المنطقة المنقطة الزرقاء والسهام إلى تجديد الألياف العضلية التمثيلية والنوى المركزية ل TA. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي S1: التليف المستمر أثناء تجديد العضلات. (أ) رسم تخطيطي لتجديد العضلات TA و MAS الناجم عن إصابة التجمد. (ب-ز) صور تمثيلية لتلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوزين في المقاطع العرضية للعضلات TA و MAS في نقاط زمنية مختلفة بعد الإصابة. قضبان المقياس = 100 ميكرومتر. وهذا الرقم مستنسخ من تشنغ وآخرين.8. الاختصارات: MAS = مدلك. TA = الظنبوب الأمامي. نقطة في البوصة = أيام بعد الإصابة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي S2: ضعف عملية تكوين العضلات. (أ) صور التألق المناعي ل Pax7 (أخضر) و DAPI (أزرق) في عضلة TA و MAS. (ب) التحديد الكمي للنسبة المئوية لنوى Pax7 الإيجابية/DAPI. شريط المقياس = 100 ميكرومتر * يشير إلى اختلاف كبير عن التحكم في العضلات السليمة. # يشير إلى اختلاف كبير عن العضلات الأخرى في نفس النقطة الزمنية. ** ف < 0.01 ، # #p < 0.01. وهذا الرقم مستنسخ من تشنغ وآخرين.8. الاختصارات: MAS = مدلك. TA = الظنبوب الأمامي. نقطة في البوصة = أيام بعد الإصابة ؛ DAPI = 4 '، 6-دياميدينو -2-فينيليندول. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.