نموذج انسداد الشريان الدماغي الأوسط العابر للسكتة الدماغية

السكتة الدماغية هي مرض مدمر يصيب ما يقرب من 15 مليون شخص في جميع أنحاء العالم سنويا ، وفقا لمنظمة الصحة العالمية. حوالي ثلث المرضى يستسلمون لهذه الحالة ، بينما يعاني ثلث آخر من إعاقة دائمة. السكتة الدماغية هي أمراض معقدة تشمل أنواعا مختلفة من الخلايا ، مثل الخلايا المناعية العصبية والمحيطية ، والأوعية الدموية ، والاستجابات الجهازية¹. لا يمكن حاليا تكرار الشبكة المعقدة من التفاعلات الناتجة عن السكتة الدماغية على مستوى الأنظمة باستخدام النماذج في المختبر . وبالتالي ، فإن النماذج الحيوانية التجريبية ضرورية للتعمق في آليات المرض وتطوير واختبار علاجات جديدة. حاليا ، إعادة تروية الأنسجة المبكرة هي التدخل الوحيد المعتمد ، إما من خلال انحلال الخثرة باستخدام منشط البلازمينوجين من نوع الأنسجة (tPA) أو استئصال الخثرة داخل الأوعية الدموية¹.

انسداد الشريان الدماغي الأوسط (MCA) متكرر في مرضى السكتة الدماغية. وبالتالي ، تم تطوير نماذج القوارض من انسداد MCA العابر (tMCAo) في البداية في الفئران^2،3،4. في الوقت الحاضر ، الفئران المعدلة وراثيا هي الأكثر استخداما في نماذج السكتة الدماغية التجريبية. في هذه الدراسة ، وصفنا نموذجا طفيف التوغل ل tMCAo داخل اللمعة في الفئران. يتم تنفيذ النهج عن طريق الشريان السباتي على مستوى الرقبة ، دون استئصال الجمجمة.

مدة فترة الانسداد هي عامل حاسم يحدد مدى الآفة الإقفارية. حتى الانسداد القصير لمدة 10 دقائق يمكن أن يسبب موتا عصبيا انتقائيا دون احتشاء واضح ، في حين أن الانسداد الطويل ، الذي يستمر عادة من 30 إلى 60 دقيقة ، يؤدي إلى درجة معينة من الاحتشاء الدماغي. على عكس الفروع القريبة والبعيدة من MCA التي تغذي القشرة ولها ضمانات ، فإن الشرايين العدسية المخططة التي توفر الدم للمخطط تفتقر إلى الضمانات⁵. نتيجة لذلك ، هناك انخفاض أكبر في تدفق الدم في المخطط منه في القشرة بعد tMCAo. وبالتالي ، فإن انسداد 30 دقيقة أو أقل يؤثر بشكل عام على المخطط ولكن ليس القشرة ، في حين أن الانسدادات الأطول ، من 45 دقيقة فصاعدا ، غالبا ما تولد آفة إقفارية في منطقة MCA بأكملها ، بما في ذلك المخطط والقشرة الظهرية الجانبية.

لضمان رفاهية الفئران ، نقوم بإدارة المسكنات قبل الإجراء واستخدام التخدير أثناء الجراحة. ومع ذلك ، يمكن للتخدير إدخال تغييرات اصطناعية في فسيولوجيا الفأر ويؤثر على بعض مقاييس النتائج⁶. عادة ما يستمر التدخل الجراحي ، عندما يتم إجراؤه من قبل موظفين ذوي خبرة ، حوالي 15 دقيقة لتحفيز MCAo. بعد ذلك ، يعتمد إجمالي الوقت تحت التخدير على فترة الانسداد. بالنسبة للتجارب التي يكون فيها تقليل التخدير أمرا بالغ الأهمية ، تتضمن الخطوة البديلة في الإجراء إيقاف التخدير خلال فترة الانسداد وقصره فقط على الخطوات الجراحية لإدخال وسحب الفتيل الذي يسد MCA. يقلل هذا النهج من مدة التخدير ويقلل من آثاره الأثرية المحتملة على النموذج التجريبي ^7,8. لذلك ، يتم تقديم طريقة إحداث نقص التروية البؤري العابر عن طريق انسداد MCA داخل اللمعة مع نوعين مختلفين: مع تخدير الماوس خلال فترة الانسداد بأكملها أو مع استيقاظ الماوس خلال هذه الفترة. في كلتا الحالتين ، يجب إجراء جراحة وهمية بالتوازي مع التدخل الذي يتم إجراؤه على الفئران الإقفارية. بالإضافة إلى ذلك ، يتم توفير البيانات المتعلقة بتقييم النتائج كما تم قياسها بواسطة الاختبارات السلوكية والتصوير بالرنين المغناطيسي في نقاط زمنية مختلفة بعد إعادة التروية. أخيرا ، تتم مناقشة العوامل الرئيسية التي يجب مراعاتها عند تنفيذ الإجراء التجريبي.

تم إجراء العمل الحيواني وفقا للقوانين الكاتالونية والإسبانية (Real Decreto 53/2013) والتوجيهات الأوروبية ، بموافقة اللجنة الأخلاقية (Comité Ètic d'Experimentació Animal ، CEEA) بجامعة برشلونة ، والهيئات التنظيمية المحلية ل Generalitat de Catalunya. يتم الإبلاغ عن الدراسات وفقا لإرشادات ARRIVE. تم تصميم هذا الإجراء ليتم إجراؤه في الفئران البالغة ، بدءا من عمر 8 أسابيع ، بدون حد للسن. يتم توفير أمثلة على الإجراء الجراحي الذي تم تطويره في الفئران C57BL / 6 من عمر 10-12 أسبوعا هنا. يجب مراعاة الاختلافات التشريحية اعتمادا على سلالة الماوس.

1. إعداد

1. قبل البدء في العملية الجراحية ، قم بجمع وتعقيم جميع المواد والأدوات المطلوبة. قم بإعداد طاولة العمليات بجميع المواد الجراحية اللازمة (المدرجة في جدول المواد).
2. تخدير باستخدام استنشاق الأيزوفلوران في خليط من الأكسجين وأكسيد النيتروز (30٪ / 70٪).
3. يجب تطبيق البوبرينورفين (انظر جدول المواد) تحت الجلد بجرعة 0.05 ملغم/كغ من وزن الجسم لتوفير التسكين وتخفيف أي ألم أو إزعاج.
   ملاحظة: التسكين إلزامي ، ولكن يتم قبول بروتوكولات مختلفة. يجب أيضا التحكم في علامات الألم وعدم الراحة خلال الأيام الأولى بعد MCAo (انظر الخطوة 4). تطبيق الحلول التصحيحية عند الضرورة.
4. ضع في صندوق تحريض التخدير (انظر جدول المواد) مع 5٪ إيزوفلوران حتى يصل إلى حالة التخدير العميق (فقدان المنعكس في ثقب المخلب ومنعكس العين).
5. ضع الماوس على طاولة العمليات وقلل مستوى الأيزوفلوران إلى 1.5٪ ، ويتم تسليمه بواسطة قناع الوجه. ضع مرهم الطبيب البيطري لتجنب جفاف العين أثناء العملية.
6. الحفاظ على درجة حرارة الجسم عند 37 ± 0.5 درجة مئوية يتم التحكم فيها بواسطة مسبار مستقيمي متصل بوسادة تدفئة (انظر جدول المواد).
7. حلق الجزء البطني من الرقبة والرأس (كالفاريا) بشفرة كهربائية. قم بإزالة حطام الفراء بعناية وتطهير مناطق الجلد ثلاث مرات في حركات دائرية باستخدام مطهر قائم على اليود و 70٪ كحول.
   .

2. تقييم تدفق الدم الدماغي (CBF) باستخدام قياس تدفق دوبلر بالليزر (LDF)

1. باستخدام المقص ، قم بعمل شق على جلد الرأس ، في اتجاه الخيط السهمي ، من الأذنين إلى المنطقة الواقعة بين العينين.
2. سحب الجلد وإزالة السمحاق على الجانب الأيمن من الجمجمة.
3. ابحث عن الإحداثيات (2.5 مم جانبي من Bregma) وأرفق حامل دوبلر (انظر جدول المواد) باستخدام cyanoacrylate. بعد أن يجف الغراء ، قم بتوصيل مسبار دوبلر وتحقق من قراءة الإشارة الصحيحة.

3. انسداد الشريان الدماغي الأوسط العابر (tMCAo)

1. اقلب الماوس إلى وضع ضعيف ، وقم بتثبيته على طاولة الجراحة بشريط طبي.
2. جعل شق خط الوسط على الرقبة. اسحب الجلد والغدد اللعابية بشكل جانبي باستخدام المبعدات (انظر جدول المواد) لفضح المنطقة السباتية.
3. تحديد تشريح الأوعية الدموية للشريان السباتي المشترك (CCA) ، و ICA ، و ECA ، وكذلك الشرايين المختلفة المشتقة منها (الفك العلوي واللساني ، الغدة الدرقية العلوية ، القذالي ، والظفرة الحنكية) (الشكل 1 أ).
4. افصل الشرايين الرئيسية عن النسيج الضام المجاور بحيث يمكن التعامل معها.
   ملاحظة: احرص بشكل خاص على عدم إتلاف الأعصاب ، وخاصة العصب المبهم ، الذي يعمل بالتوازي مع CCA.
5. لف خياطة حريرية 6-0 (انظر جدول المواد) حول ECA عند التشعب الفكي / اللساني. تأمين عقدة بإحكام لمقاطعة الدورة الدموية بشكل دائم.
6. مرر خياطة ثانية حول نفس الشريان ، بين العقدة الأولى وتشعب CCA ، وحافظ على هذه العقدة فضفاضة.
7. ضع خيطا ثالثا حول CCA واربط عقدة انزلاقية يمكن فكها بسهولة.
   ملاحظة: يمكن أيضا إجراء ذلك باستخدام مشبك الأوعية الدموية ، لكن الخيط يسمح بمزيد من الحركة والمرونة. في هذه المرحلة ، من الممكن ملاحظة أول انخفاض في CBF في إشارة LDF.
8. ضع مشبك الأوعية الدموية (انظر جدول المواد) يقطع الدورة الدموية من ICA.
9. قم بعمل شق صغير في ECA ، بالقرب من المنطقة التي توجد بها العقدة الضيقة.
10. أدخل الشعيرات الأحادية حتى يدخل الطلاء السميك تماما إلى التجويف الشرياني.
11. شد العقدة الثانية لتثبيت الشعيرات الأحادية داخل الشريان ومنع الضغط الذي يمارسه الدم من دفعه للخارج (الشكل 1 ب).
12. قم بإزالة مقطع الأوعية الدموية من ICA.
13. اقطع ECA أسفل العقدة الأولى وقم بتدوير الجذع لتوجيهه في اتجاه ICA (الشكل 1C).
14. تقدم الشعيرات الأحادية عبر ICA حتى النقطة التي يتفرع فيها MCA.
    ملاحظة: ينعكس الانسداد في انخفاض مفاجئ في تدفق الدم في قراءات LDF. نحن نعتبر انسدادا ناجحا عندما يكون الانخفاض في CBF أكبر من 70٪ من القيمة القاعدية. إذا لم تكن أنظمة قياس CBF متوفرة ، يمكن ملاحظة نقطة الانسداد من خلال مقاومة التقدم ، والتي عادة ما تكون في الفئران البالغة حوالي 11 مم من تشعب CCA.
    1. إذا استمر التخدير خلال فترة الانسداد ، راقب الماوس واحتفظ به تحت المراقبة المستمرة لمدة 45 دقيقة.
    2. في حالة استيقاظ الماوس خلال فترة الانسداد ، قم بخياطة جلد الرقبة بعدة غرز. بدون فصل مسبار LDF ، ضع الماوس في الصندوق الذي يتم التحكم في درجة حرارته ، مما يسمح بالتعافي من التخدير.
       ملاحظة: من الشائع أن يظهر الفأر سلوكا دائريا عفويا خلال هذه الفترة ، مما يدل على الانسداد الناجح.
    3. بعد 40 دقيقة ، قم بتخدير الماوس مرة أخرى باتباع نفس إجراءات التخدير والتطهير كما هو موضح في النقاط 1.4 و 1.5 و 1.7. ضعه مرة أخرى على طاولة الجراحة ، وقم بإزالة الغرز من الرقبة.
15. بعد 45 دقيقة من الانسداد، قم بفك العقدة التي تثبت الشعيرات الأحادية في مكانها. اسحب الفتيل ببطء ورفق وتحقق من حدوث إعادة استقناء الأنسجة.
16. اسحب الفتيل وشد العقدة لمنع فقدان الدم.
17. فك عقدة CCA. تأكد من عدم وجود تلف جدار الشرايين.
18. قم بإزالة المبعدات وأعد وضع العضلات والغدد والجلد. خياطة الجلد (6-0) وتطبيق مطهر.
19. افصل مسبار دوبلر وافصل الحامل. خياطة وتطهير جلد الرأس.
20. خلال فترة الشفاء من التخدير ، اترك الماوس في قفص مزود بسخان للحفاظ على درجة الحرارة. احتفظ بها تحت الملاحظة المستمرة حتى يتم استردادها بالكامل من التخدير. بعد الشفاء ، يمكن إعادة الماوس إلى قفصه.
    ملاحظة: يوصى بشدة بالسكن مع الإثراء الاجتماعي. ومع ذلك ، لا تخلط أبدا الفئران التي تعمل مع الفئران غير المشغلة في نفس القفص دون أي فصل جسدي من أجل منع العدوان.

4. رعاية ما بعد الجراحة

1. الإشراف الدوري على باتباع الإجراءات واللوائح الموضوعة وفقا للوائح المحلية. توفير العلاج المسكن في الجدول الزمني المناسب لتقليل الألم بعد الجراحة.
   ملاحظة: في هذه الدراسة ، تم تطبيق نفس المسكن كما في بداية التدخل (البوبرينورفين 0.05 ملغم / كغم من وزن الجسم) في 6 ساعات و 24 ساعة بعد الجراحة.
2. قم بإجراء القتل الرحيم عندما تشير معلمات الإشراف إلى ذلك ، باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا.
3. مراقبة يومية لوزن. توفير الطعام اللين للحيوانات خلال الأيام القليلة الأولى بعد الجراحة. بالإضافة إلى ذلك ، قم بترطيبها عن طريق الحقن تحت الجلد من محلول ملحي (200 ميكرولتر) مباشرة بعد الجراحة وبشكل دوري بعد ذلك إذا لوحظ أن الفأر لا يرطب من تلقاء نفسه. رتب الطعام والماء بطريقة يسهل على الوصول إليها.
4. بمجرد الانتهاء من الدراسة في الجسم الحي ، قم بتخدير الفئران ، والقتل الرحيم لها ، وإزالة أنسجة المخ لمزيد من التحليل النسيجي المرضي (إذا لزم الأمر).

هناك طرق مختلفة لتقييم نتائج إجراء tMCAo. يتم استخدام طرق التصوير العصبي في الجسم الحي (MRI) والاختبارات السلوكية هنا.

تصاب الفئران بآفات إقفارية في الدماغ ، تؤثر بشكل رئيسي على المنطقة التي يوفرها MCA المماثل للانسداد ، مثل المخطط والقشرة الظهرية الجانبية. توجد عدة طرق لتحديد مدى الآفة ، بما في ذلك تلطيخ الأنسجة 2،3،5-ثلاثي فينيل تترازوليوم كلوريد (TTC) ، والتلوين النسيجي (الهيماتوكسيلين / يوزين ، أسيتات الثيونين) ، وطرق التصوير العصبي في الجسم الحي مثل التصوير بالرنين المغناطيسي. تم اختيار التصوير بالرنين المغناطيسي هنا نظرا لطبيعته غير الغازية والقدرة على استخدام نفس الأنسجة لدراسات أخرى ، مما يوفر تقييما شاملا للآفة في كل فأر. بالإضافة إلى ذلك ، يسمح التصوير بالرنين المغناطيسي بإجراء قياسات متكررة في نفس ، مما يزيد من قابلية استنساخ النتائج وغالبا ما يقلل من عدد المطلوبة للدراسة.

تم استخدام نفس بروتوكول التخدير مع الأيزوفلوران (الحث 5٪ ، الصيانة 1.5٪) في جلسات التصوير بالرنين المغناطيسي. لتقييم حجم الآفة ، تم استخدام تسلسل سريع مرجح T2 (T2w turbo RARE Fast spin-echo)9 لتقليل الوقت الذي يتم فيه تخدير ، وهو أمر مهم عند إجراء دراسات طولية مع عمليات الاستحواذ بالرنين المغناطيسي في أوقات مختلفة في نفس الفئران. يسمح هذا الإجراء بتقييم التغيرات في الآفة بمرور الوقت في نفس ، وهو مفيد جدا عند تطبيقه لدراسات الحماية العصبية أو لاختبار فعالية الدواء ، من بين أمور أخرى. أجريت تجارب الصور على ماسح ضوئي أفقي للحيوانات 7T. المواصفات الفنية للتسلسل التشريحي (قد تختلف تبعا لشدة المجال المغناطيسي): T2_TurboRARE ؛ 22 قسم إكليلي ؛ سمك 0.5 مم وقت الصدى (TE) = 33 مللي ثانية ؛ وقت التكرار (TR) = 2336.39 مللي ثانية. 2 المتوسطات. زاوية الوجه ، 90 درجة ؛ مجال الرؤية (FOV) = 20 مم × 20 مم ، بحجم مصفوفة 256 × 256. يوضح الشكل 2 أ مثالا تمثيليا لصور التصوير بالرنين المغناطيسي لتطور الآفة في نفس الفأر ، والتي تم تقييمها في 40 دقيقة و 6 ساعات و 24 ساعة و 48 ساعة بعد إعادة التروية. يستغرق تطور حجم الآفة ساعات إلى يومين تقريبا حتى يكتمل. يظهر القياس الكمي لحجم الآفة هذا التطور بمرور الوقت (الشكل 2 ب).

تم وصف مجموعة متنوعة من المقاييس العصبية لتقييم الضعف العصبي الناجم عن الإهانة الإقفارية. نقترح استخدام اختبارات neuroscore التي تم وصفها على نطاق واسع في المخطوطات السابقة. على سبيل المثال ، يوصى بالاختبار الذي أبلغ عنه بالتفصيل Orsini et al. (2012) 10 .

تتوفر مجموعة متنوعة من الاختبارات السلوكية ، وذلك أساسا للكشف عن الاختلافات في ضعف الوظيفة الحركية والحسية. لهذا الغرض ، تم استخدام اختبار قوة القبضة واختبار الزاوية. يستخدم اختبار قوة القبضة لتقييم الوظيفة الحركية. يتم قياس قوة الأطراف الأمامية باستخدام مقياس قوة القبضة المتصل بمحول قوة رقمي (انظر جدول المواد). يمسك الماوس بشريط أفقي مع كلا القدمين الأماميين بينما يسحبه برفق للخلف عبر الذيل. ويلاحظ أقصى قوة للقبضة قبل إطلاق forepaws. يتم إجراء خمس تجارب لكل ، ويتم حساب القيمة الرئيسية بعد استبعاد القيم القصوى والدنيا. يستخدم اختبار الزاوية للكشف عن التشوهات أحادية الجانب للوظائف الحسية والحركية. يتكون الجهاز من زاوية مع لوحين (30 سم × 20 سم × 1 سم) متصلين بزاوية 30 درجة وفتحة صغيرة في النهاية. يتم وضع الماوس في منتصف الطريق في مواجهة الزاوية. عندما يدخل الماوس في عمق الزاوية ، يتم تحفيز جانبي الاهتزازات معا. ثم يعود الماوس لمواجهة الطرف المفتوح. يتم إجراء ما مجموعه 10 تجارب لكل ، ويلاحظ الجوانب المختارة. من المتوقع حدوث 50٪ من المنعطفات اليمنى واليسرى في ظل الظروف الفسيولوجية ، في حين يتوقع التفضيل الأيمن في الفئران ذات MCAo الأيمن. تعتبر التجربة صالحة عند تحقيق دورة كاملة أو عندما يدير الماوس رأسه ≥ 90 درجة. يتم عرض النتائج كنسبة مئوية من المنعطفات اليمنى (المماثلة).

تم عرض النتائج التمثيلية التي تظهر فقدان القوة التي أظهرتها الفئران بعد 24 ساعة من tMCAo المقاسة بواسطة اختبار قوة القبضة (الشكل 3 أ) ، بالإضافة إلى تفضيلها للتحول إلى الجانب المماثل للآفة عند تحفيزها في اختبار الزاوية (الشكل 3 ب). قد يكون إجراء الاختبارات السلوكية في نفس يوم الجراحة أقل دقة حيث يمكن تغيير بعض المعلمات بسبب قرب التخدير وفترة ما بعد الجراحة.

الشكل 1: تمثيل تخطيطي للشجرة الوعائية للرقبة (الجانب الأيمن). (أ) توضح الصورة الشرايين الرئيسية (الشريان السباتي المشترك - CCA ، الشريان السباتي الخارجي - ECA ، الشريان السباتي الداخلي - ICA) والفروع المختلفة (الشريان الظفري الحنكي Pt; الشريان القذالي Occ; شارع الشريان الدرقي العلوي ؛ الشرايين الفكية واللسانية ماكس / لين). (ب) الخطوات الأولى من العملية الجراحية، مع ربط CCA بالخيط، يتم قطع دوران ICA بواسطة مشبك وعائي، ويتم إدخال الشعيرات الأحادية عبر ECA. (ج) إعادة توجيه جهاز حماية البيئة لدفع الشعيرات الأحادية إلى منطقة الانسداد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: صور الرنين المغناطيسي التمثيلية. (أ) تظهر صور T2-w لنفس الفأر في نقاط زمنية مختلفة بعد إعادة التروية تطور الآفة في المرحلة الحادة. تزداد المنطقة المتأثرة بالاحتشاء بسرعة خلال الساعات الأولى وتشهد اختلافا طفيفا بعد ذلك. (ب) تطور حجم الآفة في المرحلة الحادة بعد MCAo. يمثل كل شريط متوسط ± SD للنسبة المئوية (٪) من حجم الآفة. يزداد حجم الآفة بشكل ملحوظ خلال ال 24 ساعة الأولى بعد إعادة التروية (* p = 0.0182 ؛ ** p = 0.0088 ؛ اختبار ANOVA / Kruskal-Wallis في اتجاه واحد). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: الاختبارات السلوكية قبل (القاعدية) و 24 ساعة بعد tMCAo (ن = 16 فئران). (أ) يظهر اختبار قوة القبضة القوة القصوى (القصوى) لكل ماوس. (B) يظهر اختبار الزاوية النسبة المئوية (٪) للانعطاف الأيمن. تظهر الرسوم البيانية المربع والشعيرات (القيم الدنيا إلى القصوى) لكل مجموعة ، وتتوافق النقاط مع الفئران الفردية (****p < 0.0001 ؛ ويلكوكسون مطابقة أزواج وقعت اختبار رتبة). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.