توليد الثقافات الأولية لتصوير الخلايا الحية للخلايا الكيراتينية

الهدف من هذا البروتوكول هو توفير القدرة على تتبع الخلايا الكيراتينية الفردية في المزرعة على مدى فترة طويلة نسبيا (عدة أسابيع) تم تمكينها من خلال كثافة البذر المنخفضة والتصوير الفوتوغرافي بفاصل زمني. يتيح تصوير الخلايا الحية بكثافة منخفضة للباحثين الفرصة لتصور سلوك الخلية في المختبر على مستوى خلية واحدة. على الرغم من أنه غير ممكن في زراعة الخلايا التقليدية ، إلا أن تصوير الخلايا الحية يجعل من الممكن تطوير أشجار النسب في الوقت الفعلي ، دون استخدام الملصقات ، والتي يمكن للمرء من خلالها التأكد من المعلومات المتعلقة بحركية الانقسام ، مثل مدة دورة الخلية ونسبة انقسامات التكاثر والتمايز في المستعمرة. كما يسمح بدراسة هجرة الخلايا وحركتها. قد يكون الأمر صعبا من الناحية الفنية ، مع الجوانب التي تحتاج إلى تحسين ، اعتمادا على نوع الخلية والبيانات التي سيتم التقاطها. استخدمت مختبرات أخرى الخلايا الكيراتينية لحديثي الولادة و / أو الخلايا الكيراتينية التي يسهل^{نموها 1}.

ومع ذلك ، فإن خطوط الخلايا التي تخضع لمرور متكرر تختلف اختلافا كبيرا في السلوك والتشكل عن حالتها في الجسم الحي ². للحصول على أكبر أهمية بيولوجية من أجل الحصول على أقرب سلوك في الجسم الحي ، يتم استخدام مرور 0 خلايا. في مجموعات الخلايا الكيراتينية ، من الممكن التمييز بين الخلايا الجذعية والسلف الملتزم دون فرز أو تسميات لأن هناك اختلافات واضحة في سلوك الانقسام يمكن ملاحظتها من خلال تصوير الخلايا الحية³.

نحن نستخدم تصوير الخلايا الحية لدراسة حركية تكاثر الخلايا الكيراتينية. تم استخدام نهج مماثل لدراسة حركة خلايا الورم الميلانيني الجلدي المزروعة مع الخلايا الكيراتينية⁴ ، وهجرة الخلايا الملتصقة لمقايسات الخدش⁵ ، وكيف تؤثر مثبطات ROCK على تكاثر الخلايا الكيراتينية⁶. تم تصميم هذا البروتوكول خصيصا لزراعة الخلايا لتسهيل تتبع النسب عن طريق تصوير الخلايا الحية ، على الرغم من أنه يمكن تكييفه لأغراض أخرى.

يحدد هذا البروتوكول عزل مرور 0 خلايا كيراتينية لغرض تصوير الخلايا الحية ، ويناقش المضاعفات التي قد تنشأ ، ويوفر الاعتبارات التي قد تتطلب تعديلات على البروتوكول (الشكل 1).

مطلوب موافقة من لجنة البحوث البشرية التابعة للمؤسسة لاستخدام الأنسجة البشرية. غالبا ما يتم الحصول على عينات بشرية للبحث من مصادر تجارية (على سبيل المثال ، ATCC ، وتقنية خلايا شريان الحياة ، و Zen-Bio). تستخدم دراساتنا الأنسجة المهملة في وقت العمليات الجراحية أو عينات خزعة الجلد المأخوذة خصيصا لأغراض الدراسة. تتطلب هذه الحالات موافقات وإجراءات موافقة مختلفة. يتم الحصول على جميع المناديل بعد موافقة لجنة البحوث البشرية بجامعة كاليفورنيا في سان فرانسيسكو ، باستخدام موافقة خطية مستنيرة واتباع مبادئ إعلان هلسنكي.

1. فصل البشرة عن الأدمة

1. التأكد من الحصول على الموافقات المناسبة لاستخدام الأنسجة البشرية للدراسة.
2. احصل على عينة من الجلد وانقلها في وعاء معزول مع كيس ثلج. ضع العينة في وسائط التجميع التي تحتوي على تركيز 5x من البنسلين والستربتومايسين والأمفوتريسين.
   ملاحظة: تعتمد الكمية المطلوبة على التطبيق. في تجربتنا ، يتم الحصول على ما يقرب من 1،000،000 خلية كيراتينية لكل سم² من بشرة البالغين والمسنين. ومع ذلك ، يمكن أن يختلف هذا بشكل كبير لكل عينة.
   1. ضع قلفة حديثي الولادة في وسط زراعة الخلايا وابدأ إجراء عزل الخلايا الكيراتينية لمدة لا تزيد عن 48 ساعة بعد الختان لتقليل موت الخلايا. قم بتخزين الأنسجة على حرارة 4 درجات مئوية حتى المعالجة. عادة ما تبدأ معالجة عينات البالغين والمسنين في غضون ساعات قليلة من جمعها.
3. احصل على إمكانية الوصول إلى خزانة السلامة الحيوية مع معدات من مستوى BS2 مصممة للعمل مع العوامل التي تسبب المرض عن طريق الابتلاع أو الغشاء المخاطي أو التعرض عن طريق^{الجلد 7}. تأكد من تعقيم خزانة السلامة الحيوية بالأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة على الأقل وأن جميع الأسطح يتم رشها بالكحول بنسبة 70٪ قبل الاستخدام.
4. ارتد القفازات ، ورش حاوية التجميع بنسبة 70٪ كحول ، وضع الحاوية في غطاء الدخان. ضع وسادة تبريد أسفل المنديل لمنعها من التسخين إلى درجة حرارة الغرفة والحفاظ على سلامتها. إذا كانت الأنسجة كبيرة جدا ، فقم بقطع جزء للمعالجة وحافظ على رطوبة الباقي في حاوية التجميع.
   ملاحظة: نظرا لأن العديد من العينات القديمة عبارة عن جلد كبير في البطن أو الثدي من العمليات الجراحية ، فإن قطع الأنسجة ومعالجتها يستغرق وقتا. لا ينبغي أبدا وضع الأنسجة مباشرة على الوسادة ، لأن البرد القارس يمكن أن يتسبب في تجميدها. بدلا من ذلك ، يجب وضعها على سطح وسيط ، مثل لوح رخامي.
5. ضع طبقين من بتري مقاس 100 مم × 15 مم ومشرط جراحي معقم # 23 في الغطاء.
6. افتح أطباق بتري وضعها على سطح الخزانة بحيث تكون الأسطح الداخلية لكل طبق متجهة لأعلى. أضف 10 مل من غلوكونات الكلورهيكسيدين بنسبة 10٪ إلى أحد أطباق بتري. أضف 10 مل من 5 أضعاف البنسلين / الستربتومايسين / الأمفوتريسين / الجنتاميسين في محلول الملح المتوازن من هانك (HBSS ؛ 5x) إلى نصفين آخرين من أطباق بتري (انظر جدول المواد).
7. قم بإعداد طبق من 6 آبار لخطوة Dispase. بالنسبة لأنسجة حديثي الولادة ، استخدم 3 مل من Dispase لكل بئر. بالنسبة لعينات الأنسجة القديمة، استخدم 4 مل. يمكن أن يؤدي استخدام كميات غير كافية من Dispease لحجم الأنسجة إلى صعوبة فصل البشرة عن الأدمة.
8. استخدم مشرطا لتقطيع الأنسجة إلى قطع أصغر بحيث يتم اختراقها بشكل أفضل بواسطة Dispase. يخترق Dispase ما يصل إلى 5 مم فقط من حواف الأنسجة ، لذا قم بقطع شرائط طويلة من الأنسجة بعرض 0.5-1 سم. إذا لم يتم قطعه صغيرا بما يكفي ، فلن يحدث فصل البشرة عن الأدمة.
   1. قطع الأنسجة السميكة إلى قطع أصغر. قطع قلفة حديثي الولادة إلى 3 أو 4 قطع (~ 5 مم × 7 مم). استخدم اثنين من القلفة الكاملة كحد أقصى لكل بئر من Dispase. تميل اللوحات البطنية السطحية إلى أن تكون أرق بكثير ، مع وجود حد أدنى من الأنسجة تحت الجلد أو بدونها ، قم بتقطيعها إلى شرائط أطول (~ 5 مم × 15 مم).
   2. ضع أربع شرائح كحد أقصى لكل بئر من Dispase. إذا كان النسيج الذي تم الحصول عليه يحتوي على الكثير من الدهون تحت الجلد ، فقم بقص الأنسجة تحت الجلد للمساعدة في اختراق الأنسجة بالكامل. إذا تم قطع الأنسجة بشكل صغير جدا ، فقد تكون هناك حاجة إلى مجهر تشريح لتحديد الجانب الذي يكون البشرة والجانب الجلدي أثناء تقشير البشرة. يمكن أن يؤدي شد الجانب الخطأ من الجلد إلى صدمة إضافية في الأنسجة.
9. ضع جانب بشرة الأنسجة لأسفل في طبق بتري الأول المحضر في الخطوة 1.6 ، والذي يحتوي على غلوكونات الكلورهيكسيدين بنسبة 10٪ ، لمدة 10-20 ثانية ثم انقل جانب بشرة الأنسجة لأسفل إلى طبق بتري الثاني ، الذي يحتوي على 5x البنسلين / الستربتومايسين / الأمفوتريسين (PSA) مع HBSS ، وقم بتحريكه لمدة 10-20 ثانية. انقل جانب بشرة الأنسجة لأسفل إلى طبق بتري الثالث ، الذي يحتوي مرة أخرى على 5x PSA مع HBSS ، وقم بتحريكه لمدة 10 ثوان أخرى. معالجة عينات متعددة بنفس الحل مقبولة.
10. انقل جانب بشرة الأنسجة لأسفل إلى لوحة Dispase المكونة من 6 آبار المحضرة في الخطوة 1.7.
    ملاحظة: نوصي بجانب البشرة لأسفل وفقا لاتفاقيتنا. توصي البروتوكولات الأخرى بالأدمة⁸. كل Dispase ليس فعالا بنفس القدر. ثبت أن تقشير البشرة من البشرة المسنة يمثل تحديا مع بعض المنتجات ، حتى بتركيزات تصل إلى 4 أضعاف المستوى الموصى به من قبل الشركة المصنعة. أدى ذلك إلى ضياع الوقت والعينات. تستخدم الشركات وحدات غير موحدة ل Dispase، مما يجعل من الصعب تحديد كيفية اختلاف التركيزات بين العلامات التجارية. بسبب هذه التحديات ، يوصى بشدة باستخدام إحدى العلامات التجارية Dispase المدرجة في جدول المواد .
11. قم بتسمية اللوحة المكونة من 6 آبار التي تحتوي على التباعد والعينات ، وانقلها إلى 4 درجات مئوية. احتضان عينات حديثي الولادة لمدة 16-18 ساعة في عينات مختلفة وعينات البالغين / الكبار لمدة 24 ساعة.
    ملاحظة: هناك بروتوكول بديل لمدة ساعتين يمكن استخدامه للعينات ، حيث يتم وضع العينة في Dispase عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين ، ثم يتم تقشير البشرة. لسوء الحظ ، لا ينجح هذا دائما ، ويمكن أن تتعرض سلامة الأنسجة للخطر بعد الحضانة ، مما يؤدي إلى فقدان العينة. يفضل الحضانة بين عشية وضحاها كلما أمكن ذلك.

2. عزل الخلايا الكيراتينية

1. ضع 0.05٪ Trypsin-EDTA (أو TrypLE) ، ومحلول تحييد التربسين ، ووسائط الخلايا الكيراتينية في حمام مائي 37 درجة مئوية قبل 20 دقيقة من بدء المجموعة التالية من الخطوات
2. قم بإزالة لوح 6 آبار من 4 درجات مئوية ، ورشه بنسبة 70٪ من الإيثانول ، وضعه في خزانة أمان حيوي معدة (انظر الخطوة 1.3).
3. ضع ملقطا معقما مسننا وملقطا غير مسنن في أنبوب مخروطي سعة 50 مل يحتوي على 20 مل من الإيثانول بنسبة 70٪. إذا كان خارج غطاء المحرك في البداية ، فقم برش الملقط بنسبة 70٪ من الإيثانول قبل وضعه في الغطاء.
4. باستخدام ملقط معقم كيميائيا ، أمسك قطعة من الأنسجة وضعها على سطح معقم من جانب البشرة لأعلى (استخدم طبق بتري أو داخل النصف العلوي من اللوحة المكونة من 6 آبار). أمسك الجزء الجلدي من الأنسجة بالملقط المسنن باستخدام اليد غير المهيمنة وفي نفس الوقت أمسك البشرة بإحكام بالملقط غير المسنن واسحبها من الحافة إلى الحافة. يجب أن تؤتي ثمارها بسلاسة كقطعة واحدة.
5. ضع البشرة داخل شفة أنبوب مخروطي سعة 15 مل. يجب أن يحتوي كل أنبوب مخروطي سعة 15 مل على بشرة من قلفة كحد أقصى.
   1. العمل بكفاءة. إذا جفت الأنسجة ، فسوف يتعرض المحصول للخطر. إذا لم يخترق Dispase الأنسجة بشكل مناسب ، فقد تكون هناك صعوبة في تقشير البشرة. في مثل هذه الحالة ، اسحب / كشط البشرة من الأدمة الأساسية. ينتج عن هذا أيضا عائد أقل بكثير ولا ينصح به.
6. أضف 4 مل من 0.05٪ Trypsin-EDTA في الأنبوب المخروطي سعة 15 مل ، ثم أغلق الأنبوب واقلبه مع التأكد من تعليق كل البشرة في التربسين وعدم الثبات على جانب الأنبوب / الغطاء. ضعها في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. حرك الخلايا كل 2 دقيقة باليد.
   ملاحظة: قد يؤدي التربسين لأكثر من 10 دقائق إلى انخفاض إنتاجية الخلايا. أيضا ، إذا كانت سلامة بروتينات سطح الخلية مصدر قلق ، فاستخدم TrypLE لأنه أكثر تحديدا لموقع الانقسام ، مما يؤدي إلى تقليل الضرر للخلايا وقد ثبت أنه لا يقلل بشكل كبير من تعبير المستضد السطحي مقارنة ب Trypsin-EDTA⁹. علاوة على ذلك ، يعد الحمام المائي مصدرا شائعا للتلوث ، لذا تأكد من تنظيفه بانتظام. قم بتغيير الماء بانتظام بالماء منزوع الأيونات الذي يحتوي على محلول aquaguard-2.
7. ضع أنبوبا مخروطيا سعة 50 مل في خزانة السلامة الحيوية. قم بفك الغطاء وضع مصفاة خلية 100 ميكرومتر على فتحة الأنبوب المخروطي.
8. قم بإزالة الأنبوب المخروطي سعة 15 مل الذي يحتوي على العينة المهضومة من الحمام المائي ، وجففه جيدا ، ورشه بنسبة 70٪ من الكحول قبل وضعه مرة أخرى في خزانة السلامة الحيوية. اضغط على الأنبوب المخروطي 3x على سطح غطاء الدخان ثم اقلب 6x. كرر دورة التنصت والانعكاس 3x.
9. أضف 6 مل من محلول تحييد التربسين إلى الأنبوب المخروطي. صب من خلال مصفاة الخلية في الأنبوب المخروطي سعة 50 مل من الخطوة 2.7.
10. اشطف الأنبوب المخروطي سعة 15 مل الذي يحتوي على العينة ب 5 مل من محاليل تحييد التربسين (TNS). صب من خلال مصفاة خلوية في الأنبوب المخروطي سعة 50 مل. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق.
11. قم بإزالة المادة الطافية على الفور من جهاز الطرد المركزي والماصة لمنع فقدان الخلايا في الوسط. يجب أن يكون هناك فقط الحبيبات المتبقية مع مجموعة صغيرة من السوائل. قد يكون من الصعب رؤية الحبيبات من عينات الأنسجة الأصغر.
    ملاحظة: يوجد التربسين في المادة الطافية ، لذلك من الأفضل إزالة أكبر قدر ممكن دون فقد الحبيبات.
12. أعد تعليق حبيبات الخلايا الكيراتينية في 2 مل من وسط الخلايا الكيراتينية.
    ملاحظة: هناك اعتباران هنا. أولا ، ما هي الوسائط التي يجب استخدامها. لهذا الغرض ، يوصى باستخدام وسائط خالية من المصل بدون كولاجين. تاريخيا ، كان معيار زراعة الخلايا الكيراتينية هو Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) + 10٪ مصل بقري الجنين (FBS) + Ham's F-12 على طبقة تغذية الخلايا الليفية (3t3-J2s) ¹⁰. ومع ذلك ، مع ظهور الوسائط الخالية من المصل وتوافر الكولاجين ، تظل العديد من الاحتمالات الأخرى قابلة للتطبيق (انظر المناقشة)¹¹. الاعتبار الثاني هو ما إذا كان استخدام المضادات الحيوية في وسط الاستزراع مناسبا لتطبيق تصوير الخلايا الحية. سيعتمد هذا على مدة التصوير والخبرة في نظام التصوير. يتم تصوير المستعمرات على مدى عدة أسابيع باستخدام نظام تصوير مشترك ، مما يجعل استخدام المضادات الحيوية نهجا مفضلا على الرغم من التأثير المحتمل على الثقافات (انظر المناقشة). يتم استخدام البنسلين والستربتومايسين والأمفوتريسين ب ووسط الخلايا الكيراتينية المحتوية على الجنتاميسين أثناء إعادة التعليق ، متبوعا بالتبديل إلى الوسائط المحتوية على البنسلين / الستربتومايسين بعد تغيير الوسائط الأولي. منعت هذه الطريقة بشكل فعال التلوث أثناء تصوير الخلايا الحية الممتدة.
13. عد الخلايا وبذر اللوحة (انظر المناقشة للحصول على تعليقات حول اختيار كثافة البذر). لضمان توزيع منتظم للبذر ، قبل الطلاء ، أعد تعليق خلايا الخلايا الكيراتينية في الكمية الإجمالية للوسط المراد طلاءه. بعد التحريض اللطيف عن طريق الانعكاس ، قم بالدوامة برفق لمدة 1-2 ثانية ، وطبقة. بعد ذلك ، حرك الصفيحة الدقيقة بنمط يشبه الصليب (لأعلى لأسفل ، من اليسار إلى اليمين) 3x في الحاضنة.
14. بعد 24 ساعة ، ضع اللوحة في حاضنة نظام تصوير الخلايا الحية. قم بإجراء تصوير الخلايا الحية بمعدل 10x مع التقاط الصور كل 20 دقيقة. ضع العينات عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ في الحاضنة المرفقة بالمجهر.

بالنظر إلى المتغيرات المتعددة التي يمكن التلاعب بها في هذه الطريقة والتي تؤدي في النهاية إلى مجموعة متنوعة من النتائج ، فإننا هنا نحدد العثرات الشائعة ونتائجها الناتجة ، بالإضافة إلى تقديم نتائج نموذجية والظروف الكامنة وراءها.

كما هو الحال مع أي تقنية لزراعة الخلايا ، فإن التلوث هو احتمال (فيديو تكميلي 1). إلى جانب تقنيات التعقيم الدقيقة ، ضع في اعتبارك استخدام المضادات الحيوية في الوسائط ، خاصة إذا كانت الزراعة لفترات طويلة من الزمن. لوحظ تلوث متكرر عندما تم نقل الخلايا المستنبتة إلى نظام تصوير في مكان آخر دون استخدام المضادات الحيوية. يرجى الاطلاع على قسم المناقشة لمعرفة سلبيات استخدام المضادات الحيوية.

كما هو مذكور في البروتوكول ، يعد اختيار الوسائط أمرا بالغ الأهمية. تم استخدام DMEM مع 10٪ FBS و Ham's F-12 في البداية على طبقة تغذية الخلايا الليفية. ومع ذلك ، كانت هناك مشاكل في هذا الاختيار (الفيديو التكميلي 2). كانت كثافة البذر الأولية للأرومات الليفية المستخدمة عالية جدا ، ومع مرور الوقت ، بدا أن الخلايا الليفية تتوسع ، مما يحجب رؤية الخلايا الكيراتينية. أدى تقليل كثافة بذر الخلايا الليفية إلى حل مشكلة حجب الخلايا الليفية. ومع ذلك ، بالإضافة إلى ذلك ، بدا أن الخلايا الكيراتينية تتمايز بسرعة أكبر من الوسط الخالي من المصل ، مما أدى إلى مناطق غير موحدة من الخلايا الكيراتينية ، والتي كان من الصعب تتبعها لأغراض تتبع النسب (الفيديو التكميلي 3). يتم توسيع القضايا الأخرى المتعلقة بوسائل الإعلام المستندة إلى DMEM في المناقشة.

بعد مواجهة مشكلات مع F-12 التقليدية من DMEM / FBS / Ham ، تم اختيار الوسائط الخالية من المصل كبديل. مع وسائط الاستزراع المكملة ب HKGS والخلايا الكيراتينية بكثافة نسيلة ، كانت هناك مستعمرات موحدة يمكن تتبعها (فيديو تكميلي 4 ، فيديو تكميلي 5). مع الوسائط الخالية من المصل ، يحدث التمايز بشكل أبطأ (ربما بسبب انخفاض الكالسيوم) ، والعديد من الخلايا الملتصقة لا تنقسم أبدا ولكنها لا تنفصل (كما هو الحال في الوسائط الأخرى. الفيديو التكميلي 4 ، الفيديو التكميلي 3).

يمكن أن تؤثر كثافة البذر على القدرة على تتبع الخلايا. يمكن أن يؤدي وجود عدد كبير جدا من الخلايا إلى عدم القدرة على تتبع الخلايا بدقة ، وعلى العكس من ذلك ، يؤدي عدد قليل جدا من الخلايا إلى نمو غير كاف. يوصي العديد من مصنعي الوسائط الخالية من المصل بإقران وسطهم المحدد بالكولاجين ، مما يسمح بانخفاض كثافة البذر (الشكل 2). انظر المناقشة لمعرفة المزيد حول هذا الموضوع.

يتضح تمايز الخلايا الكيراتينية شكليا من خلال الخلايا الكبيرة المسطحة والتشكل المكدس. انظر الفيديو التكميلي 2. تقييم التمايز النهائي هو عدم وجود قسمة على 48 ح 3,12,13.

الشكل 1: خطوات عزل الخلايا الكيراتينية. يوضح هذا الرسم البياني خطوات عزل الخلايا الكيراتينية كما هو موضح في هذا البروتوكول. تم إنشاؤه في عام BioRender.com الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: التصاق الخلية وتكوين المستعمرة. الفرق في التصاق الخلية وتشكيل المستعمرة في 2 أيام 23 ح مع وبدون الكولاجين. يحسن الكولاجين الالتصاق الأولي بالخلايا الكيراتينية بشكل كبير. تم إنشاؤه في عام BioRender.com الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

فيديو تكميلي 1: تلوث مستعمرة الخلايا الكيراتينية. الصور التي تم التقاطها كل 20 دقيقة بواسطة تصوير الخلايا الحية مجمعة في فيديو. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

فيديو تكميلي 2: النمو السريع للخلايا الكيراتينية باستخدام المغذيات التقليدية والوسائط القائمة على DMEM. الصور التي تم التقاطها كل 20 دقيقة بواسطة تصوير الخلايا الحية مجمعة في فيديو. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الفيديو التكميلي 3: زيادة تمايز الخلايا الكيراتينية باستخدام المغذي التقليدي والوسائط القائمة على DMEM. الصور التي تم التقاطها كل 20 دقيقة بواسطة تصوير الخلايا الحية مجمعة في فيديو. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

فيديو تكميلي 4: مستعمرة الخلايا الكيراتينية القابلة للتتبع. الصور التي تم التقاطها كل 20 دقيقة بواسطة تصوير الخلايا الحية مجمعة في فيديو. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

فيديو تكميلي 5: مستعمرة الخلايا الكيراتينية القابلة للتتبع. الصور التي تم التقاطها كل 20 دقيقة بواسطة تصوير الخلايا الحية مجمعة في فيديو. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.