في التصوير Bioluminescent المجراة من أورام الثدي باستخدام IVIS الطيف

لبدء هذا الإجراء ، يتم إذابة لوسيفيراز الذي يعبر عن خط خلايا ورم الثدي من السيقان المجمدة ثم يتم توسيعه في الثقافة إلى 90٪ من طلاقة COF. ثم يتم زرع التخفيف التسلسلي للخلايا العالقة في 96. يتم تحديد ألواح الآبار المعرضة لوسيفيريان ثم الرقم الأمثل للخلية التي تولد انبعاثات فلورية تزيد عن 500 فوتون باستخدام لوحة قارئ ثم يتم حقن خلايا قارئ اللوحة ، تحت الجلد في جناح ، ثم يتم حقن لوسيفيراز.

يمكن تصوير الخلايا داخل الصفاق في وقت مبكر يصل إلى 10 دقائق بعد إعطاء لوسيفر ، ويمكن تصور كتلة الورم لمدة تصل إلى شهر في الجسم الحي حتى بداية النخر. مرحبا ، أنا إد ليم من مختبر التصوير في Caliper Life Sciences في ألاميدا ، كاليفورنيا. سنعرض لك اليوم إجراء لمراقبة نمو الورم في الفئران باستخدام التلألؤ البيولوجي بشكل غير جراحي.

يستخدم هذا الإجراء في مختبرنا وفي مختبر IVUS ، في جميع أنحاء العالم لدراسة نمو الورم وتطوره ، خاصة بعد العلاج بمركبات الأدوية. لذلك دعونا نبدأ. يبدأ هذا الإجراء بإعداد خط الخلايا السرطانية للحقن في الفأر.

يمكن استخدام مجموعة واسعة من خطوط الخلايا السرطانية التي تعبر عن لوسيفيراز في التجارب قبل السريرية المضيئة بيولوجيا. يتم توفير هذه الخلايا كثقافة مجمدة خالية من مسببات الأمراض ، والتي ستنمو بسهولة في الوسائط القياسية دون الحاجة إلى علامات الاختيار. في تجربتنا ، سنستخدم خط خلايا ورم الثدي الفئراني 41 Luke two ، والذي يعبر عن جين لوسيفيراز الذي يعمل كمؤشر بصري للتعبير الجيني أو تكوين الورم.

في الجسم الحي ، سنستخدم تعبير لوسيفيراز لتتبع نمو الورم الأساسي بشكل غير جراحي ، ولكن يمكن استخدامه أيضا لتحديد موقع الآفات النقيلية ومراقبتها. يجب التحقق من نشاط لوسيفيراز قبل الحقن ، ومن أجل القيام بذلك ، يتم حصاد قارورة متجمعة بنسبة 90٪ بواسطة التربسين ثم عدها. ثم يتم توزيع 50 ، 000 خلية في بئر واحد من صفيحة ميكروتيتر ويتم إجراء التخفيف التسلسلي.

يضاف لوسيفر إلى الآبار بمعدل 150 ميكروغرام لكل مليلتر ويحتضن لمدة دقيقتين. يمكن تصوير الصفيحة الدقيقة في ivus أو قارئ لوحة مضيئة لتحديد مستويات التعبير. يعبر خط الخلية هذا عن ما يصل إلى 6،500 فوتون في الثانية لكل خلية ، ولكن يمكن تصوير أي مستوى تعبير أعلى من 30 فوطنا في الثانية لكل خلية بنجاح في الجسم الحي.

الآن بعد أن أصبح لدينا خلايا ذات نشاط مثالي ، يمكننا المتابعة إلى خطوة الحقن تحت الجلد. من أجل تسهيل الكشف الأمثل عن الورم ، نستخدم سلالة الفأر العارية المصابة بنقص المناعة الصعترية. قبل الحقن ، يتم تخدير باستخدام 3٪ فلور ISO لمدة خمس دقائق للتخدير العميق.

بعد ذلك ، سنقوم بحقن 250 ، 000 خلية في مائة ميكرولتر من PBS تحت الجلد في الجناح. قم بتحميل الخلايا في حقنة سعة مليلتر واحد وقم بإرفاق إبرة قياس 26. ارفع الجلد برفق باستخدام الملقط لعمل خيمة وحقن الخلايا في القاعدة.

يمكن تصوير الخلايا المحقونة حديثا على الفور. ثم يتم إعطاء ما مجموعه 150 ملليغرام من لوسيفر لكل كيلوغرام من وزن الجسم عن طريق حقنتين في التجويف البريتوني. في هذه الدراسة ، يتم تصوير بعد 10 دقائق من حقن لوسيفيريان لضمان تدفق الفوتون المتسق.

سنعرض لك هذا في الخطوة التالية. في تجربتنا ، سنستخدم طيف IVUS في الجسم الحي نظام التصوير ، والذي يستخدم جهازا مقترنا بشحنة رقيقة من الخلف يتم تبريده إلى سالب 90 درجة مئوية لتحقيق أقصى قدر من الحساسية. لدعم الكمية المطلقة ، يقيس النظام الشحنة المظلمة أثناء التوقف عن العمل ويقوم بإجراء معايرة ذاتية أثناء التهيئة.

لبدء التصوير ، قم بتهيئة نظام IVUS وتعيين معلمات التصوير للتجربة. حدد مجال العرض. بالنسبة لعدد التي يتم تصويرها ، يمكن الاحتفاظ بما يصل إلى خمسة في الأداة باستخدام مشعب التخدير المتكامل.

ثابتة 37 درجة مئوية للحفاظ على درجة حرارة الجسم في. يتم توفير منفذ مخطط كهربية القلب لمراقبة صحة أثناء الإجراءات المجهدة في التعرض لبرامج الصور الحية ، ويمكن تحسين وقت F-stop و pix الربط بناء على مستوى التعبير عن خط الخلية. يمكن تغيير هذه الإعدادات في أي وقت أثناء التجربة دون التأثير على النتيجة الكمية.

يكتسب Ivus صورة فوتوغرافية للحيوان تحت الضوء الأبيض في إشارة مضيئة حيوية أو فلورية كمية ، والتي يتم تراكبها على الصورة ، ويتم التعبير عن إشارة الإضاءة الحيوية بالفوتونات في الثانية ويتم عرضها كخريطة شدة. يتم ضبط عرض الصورة لتوفير التباين والدقة المثلى في الصورة دون التأثير على الكمية. يمكن قياس اللمعان من الخلايا في موقع الحقن باستخدام منطقة الاهتمام. أداة.

يتم عرض بيانات القياس في الجدول مع جميع المعلمات التجريبية المتعلقة بالتقاط الصورة ، والتي يمكن حفظها أو تصديرها. للتحليل ، يمكن الحصول على صور متعددة ومقارنتها والدراسات الطولية التي تغطي ثواني أو شهور اعتمادا على طبيعة التجربة. سنقوم بقياس تدفق الفوتون من الورم في الوقت صفر ونراقبه لمدة أربعة أسابيع.

مع التصوير على فترات نصف أسبوعية ، يتناسب تدفق الفوتون من الورم مع عدد الخلايا الحية التي تعبر عن لوسيفيراز. لذلك يرتبط التلألؤ البيولوجي ارتباطا مباشرا بحجم الورم بعد خمسة أيام من الزرع. الورم غير واضح بعد ، ولكن يمكن قياس الخلايا من خلال التلألؤ البيولوجي وينظر إلى الورم على أنه ينمو بنشاط.

في هذه المرحلة ، تكون إشارة التلألؤ البيولوجي أقوى بكثير. يمكن ضبط وقت التعريض الضوئي وتوقف f-stop ودوران البكسل بحيث تكون الصورة واضحة ولا تشبع الكاميرا. يعوض IVUS تلقائيا عن التغييرات في جمع الضوء.

لذلك يمكن مقارنة هذه القياسات بتلك التي تم جمعها في وقت مبكر ولاحق. في التجربة. بعد 15 يوما من الزرع ، تكون الأورام واضحة وقد أنتج قياس التلألؤ البيولوجي بالفعل 15 يوما من البيانات.

في عمر 28 يوما ، تصبح الأورام بعد الزرع نخرية وتبدأ الخلايا في الموت. لا يتغير حجم الورم المقدر بقياس الفرجار بشكل ملحوظ ، لكن اللمعان من الورم سينخفض. يمكن الاستمرار في قياس قياس موت الخلية والتلألؤ البيولوجي حتى يتم الوصول إلى نقطة نهاية إنسانية.

سيتم الإشارة إلى نخر الورم بسبب نقص الأكسجة أو أنظمة العلاج عن طريق تقليل التلألؤ البيولوجي حتى لو لم تقلل من كتلة الورم. لقد أوضحنا لك للتو كيفية مراقبة تطور الورم تحت الجلد ، وهو نموذج فأر بسيط للطعم الطبيعي باستخدام التصوير الحيوي. عند القيام بهذا الإجراء، من المهم أن تتذكر التحقق من مستوى التعبير عن خلاياك قبل الزرع.

ثانيا ، للحصول على أقصى قدر من القابلية للتكرار ، قم بتصوير في الوقت الأمثل بعد حقن لوسيفيريان. تتيح حساسية الطريقة للمرء مراقبة تطور الورم في المراحل المبكرة لأنه يمكن قياس الأورام عن طريق التلألؤ البيولوجي قبل وقت طويل من قياسها بشكل موثوق بواسطة الفرجار. تذكر تحسين معلمات التصوير الخاصة بك في كل مرحلة لا تشبع إشارة التلألؤ هذه ، ولكن عن طريق التلألؤ ، يمكن مراقبة كميا لأشهر لدراسة آثار المغفرة والانتكاس.

هذا كل شيء. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.