فيروس من صنع جين إسكات (VIGS) في نيكوتيانا benthamiana والطماطم

يبدأ بروتوكول إسكات الجينات المستحث بالفيروس بتنمية سلالات aphasian. يتم استنبات PT RV one و PT RV two pt و RV two PT S و PT RV two target gene على أطباق LB. وبعد يومين، يتم تلقيح هذه السلالات في وسط LB السائل وتنميتها طوال الليل.

تُستخدم هذه المزرعة بعد ذلك لتلقيح مزرعة سائلة ثانوية من وسط التحريض، والتي تُنمى أيضاً طوال الليل. وفي اليوم التالي، يتم تحضير معلق بكتيري من كل مزرعة، ويُخلط كل من PT RV one وPT RV two أو الجين المستهدف PT RV two بنسبة واحد إلى واحد. ثم يتم حقن الخليط البكتيري في شتلات end ana أو الطماطم باستخدام سرنجة بدون إبرة.

مرحباً، أنا أندريه فيلازكيز من مختبر غريغ مارتن في قسم أمراض النباتات والميكروبيولوجيا النباتية بجامعة كورنيل. سنوضح لكم اليوم كيفية إجراء عملية إسكات الجينات المستحث بالفيروسات في نباتات الطماطم والنيكوتيانا. نحن نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة التفاعلات بين مسبب مرض نباتي وعائله.

لنبدأ الآن. لبدء هذا الإجراء الخاص بنقل Agrobacterium إلى سلالات fassan، حيث تحمل كل منها بلازميدات الجينات المستهدفة PT RV one أو PT RV two pt أو RV two PDS أو PT RV two host، يتم استزراع السلالات على أطباق LB مضاف إليها kanamycin وrifampicin. يعمل kanamycin على اختيار بلازميد PTRV، بينما يعمل rifampicin على اختيار Agrobacterium.

قم بتحضين الأطباق عند 30 °C لمدة يومين، وعندما تنمو المستعمرات البكتيرية على أطباق LB، استخدم كل سلالة لتلقيح أربعة مزارع من وسط LB السائل بحجم 2 إلى 3 mL تحتوي على kanamycin و rifampicin. قم بتحضين المزارع عند 30 °C مع الرج بسرعة 200 RPM لمدة تتراوح من 16 إلى 18 ساعة. وفي اليوم التالي، قم بتلقيح تخفيف بنسبة 1 إلى 25 من كل مزرعة أولية في 5 mL من مزرعة وسط تحريض سائل ثانوي يحتوي على kanamycin و rifampicin و 200 µM من acetophenone.

تُحاكي هذه البيئة (IM) الوسط الذي تواجهه بكتيريا Agrobacterium في العائل Alast، ويقوم الأسيتوفينون (Acetophenone) بتحفيز جينات VI البكتيرية الضرورية لنقل الـ TD NA إلى النبات. تُحضن المزارع عند درجة حرارة 30 °C مع الرج بسرعة 200 RPM لمدة تتراوح من 20 إلى 24 ساعة. وفي اليوم التالي، يتم حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 3000 ×g.

بعد إزالة الطافي S، أضف خمسة ملليلترات من كلوريد المغنيسيوم بتركيز 10 millimolar، وMES بتركيز 10 millimolar وبدرجة pH 5.5 إلى الراسب، وأعد تعليق الخلايا عن طريق الرج اللطيف باستخدام جهاز vortex، ثم قم بطرد الخلايا مركزياً مرة أخرى لمدة 10 دقائق عند 3000 Gs، وبعد ذلك أعد تعليق الخلايا في نصف حجم المزرعة الأصلي باستخدام محلول كلوريد المغنيسيوم وMES. قم بتحضير معلق بكتيري بقيمة OD 600 تبلغ 0.3 لكل مزرعة بكتيرية. أضف الأسيتون بتركيز نهائي قدره 400 micromolar إلى مزرعة PT RV one.

امزج المزارع التي تحتوي على PT RV one و PT RV two أو PT RV two الخاص بالجين المستهدف في المضيف بنسبة واحد إلى واحد، مع تضمين PT RV two PDS كعينة ضابطة. أصبح تركيز الأسيتون النهائي الآن 200 micromolar، وبلغت الكثافة الضوئية OD 600 لكل مزرعة 0.15. المزارع الآن جاهزة للاستخدام في عملية الارتشاح الفيروسي لنباتات nicotiana و hamana والطماطم، ويجب أن يكون عمر نباتات hamana المستخدمة في عملية الإسكات حوالي أسبوعين ونصف عند ظهور السبلات وأول ورقتين إلى أربع أوراق حقيقية.

تُستخدم نباتات الطماطم بعد سبعة إلى ثمانية أيام من الإنبات، وذلك قبل ظهور الأوراق الحقيقية. يتم وضع علامات على الشتلات المراد حقنها بالجين المستهدف لإسكاته وتدوين تاريخ التجربة لحقن الطماطم لكل من olean و for Ana. يتم حقن أكبر ورقتين حقيقيتين.

اصنع ثقباً في كل ورقة سيتم ترشيحها باستخدام إبرة. استخدم حقنة سعة 1 mL بدون إبرة لترشيح المعلق البكتيري في الشتلات لتجنب التلوث الخلطي. قم بتغيير القفازات بين عمليات الترشيح، ولا تقم بري النباتات حتى اليوم التالي للتلقيح.

بعد عملية الارتشاح، تُحفظ النباتات في درجة حرارة تتراوح من 20 إلى 22 درجة Celsius داخل غرفة نمو مع فترة إضاءة نهارية تبلغ 16 ساعة ورطوبة نسبية تصل إلى 50% لمدة لا تقل عن ثلاثة أسابيع ونصف قبل استخدامها في المقايسات. هذه نتيجة ممثلة لتجربة أجريت على نباتات ana ونباتات الطماطم بعد ثلاثة أسابيع ونصف من إسكات جين phyto desaturated. يظهر كلا النباتين نمط التبييض المميز الذي يُلاحظ في النباتات التي تعاني من نقص في كميات carotinoids.

بالنسبة للنباتات الضابطة التي تم إسكات جين PDS فيها، يبدأ ظهور التبييض الضوئي بعد أسبوع ونصف من عملية التسلل. لقد عرضنا لكم للتو كيفية إجراء الإسكات المستحث بالفيروس في نبات الأرابيدوبسيس والطماطم. في هذا الإجراء، من المهم تذكر توخي الحذر لتجنب التلوث الخلطي، والحفاظ على النباتات في الظروف البيئية المناسبة التي تعزز انتشار الفيروس وعملية الإسكات.

هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة، وبالتوفيق في تجاربكم.