الابتدائية ثقافة الكبار Myocytes قلب فأر

في هذه الورقة ، ووصف لنا طريقة نموذجية لعزل والثقافة myocytes الكبار قلب الفئران. وتستخدم كولاجيناز البروتيني لهضم وعزل myocytes واحد. Myocytes مثقف اتبع هذا البروتوكول تلبية الاحتياجات الأكثر تجربة.

يبدأ الإجراء باستئصال القلب من فأر بالغ وتعليقه على نظام التروية. يسمح لمحاليل الإنزيم بالانفتاء لمدة 30 دقيقة تقريبا وبعد ذلك تتم إزالة القلب. يسمح للهضم المفروم والأنزيمي بالاستمرار في دورق صغير.

في نهاية عملية الهضم ، يتم فصل الخلايا إلى معلق خلية واحدة عن طريق التحريك الميكانيكي وترشيحها في أنبوب معقم. يتم غسل خلايا القلب الأولية ثلاث مرات في مخازن مع زيادة تركيز الكالسيوم ، ويتم تعليقها في الثقافة ، ومتوسطة ومطلية على أطباق زراعة الأنسجة المغلفة بالصفائح. مرحبا ، أنا شاهي من مختبر هنري كوا في قسم علم وظائف الأعضاء والخلوية بالفيزياء في جامعة كولومبيا.

سنعرض لك اليوم إجراء لعزل واستزراع خلايا قلب الفئران الأخرى. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة قنوات الكالسيوم في القلب. لذلك دعونا نبدأ.

في اليوم السابق لجراحة الفئران ، تأكد من صنع جميع الحلول ، لكن لا تضيف أي إنزيمات بعد. يجب تصفية المخازن المؤقتة A B والمخزن المؤقت للغسيل للتعقيم قبل التخزين عند أربع درجات مئوية. ستة ، يجب طلاء ألواح زراعة أنسجة الآبار بمحلول صفائح في اليوم السابق أيضا وتخزينها عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2.

في يوم الجراحة. قم بإعداد الأدوات الجراحية عن طريق تعقيم مقص المشبك والملقط بنسبة 70٪ من الإيثانول واتركها تجف على منشفة ورقية. يتم تجهيز حقنة سعة مليلتر واحد مملوءة بنصف مليلتر من محلول الهيبارين.

الآن من الممارسات الجيدة غسل جهاز التروية الذي يمر عبر 70٪ من الإيثانول مع المضخة التمعجية في الاتجاه المعاكس. بمجرد الانتهاء ، الشطف بالإيثانول ، شطف الجهاز بالماء المقطر المزدوج وأخيرا شطف مع عازلة A. يتم جمع التدفق من خلال دورق ووضعه في حمام مائي 37 درجة مئوية. لإعداد جهاز الوفرة الذي تم تنظيفه ، املأ أنبوب الحقنة الأيمن ب 40 مل من المخزن المؤقت A وأنبوب المحقنة الأيسر ب 40 مل من العازلة B. قم بتوصيل أنبوب التروية إلى طرف القسطرة عن طريق السماح للمخزن المؤقت A بالتدفق عبر الجهاز.

أعد ملء المخزن المؤقت حقنة إلى مستوى 40 ملليلتر. تأكد من عدم وجود فقاعات هواء محاصرة في الأنبوب بعد هذه الخطوة ، والآن أغلق المخزن المؤقت ، وحقنة بصمام الديك المتوقف وكرر العملية بحيث يتم تجهيز أنبوب الوفرة الآن بالعازلة B. جهاز الوفرة جاهز أخيرا ويترك مع المخزن المؤقت. صمام الديك ب إيقاف مفتوح ، لكن التدفق متوقف.

باستخدام المنظم الموجود على الخط الوريدي ، تخلص من تدفق المخزن المؤقت في دورق التجميع. آخر شيء يجب فعله قبل الجراحة هو إضافة الإنزيمات المطلوبة إلى محلول المخزون الخاص بك ثم تصفية محلول الإنزيم تماما كما تم ترشيح المحاليل الأخرى في اليوم السابق. بمجرد تصفيته ، يمكن ترك هذا المحلول في درجة حرارة الغرفة باتباع البروتوكول القياسي.

قتل الفئران بالفلور الأيزو في غرفة الغاز. تعقيم منطقة الشق على الصدر بنسبة 70٪ من الإيثانول. افتح الصدر باستخدام المقص وكشف القلب.

حقن البطين الأيسر بمحلول هيبارين 0.5 مل. قم بإزالة القلب مع وجود جزء كبير من الشريان الأورطي سليما. أدخل القسطرة على الفور في الشريان الأورطي.

يجب أن ينتج قلب الفئران النموذجي جزءا كبيرا من الخلايا العضلية الصحية على شكل قضيب وعدد قليل من الخلايا المستديرة الميتة. إذا تم الالتزام بالإجراء التالي بشكل صحيح ، فابدأ بتثبيت الشريان الأورطي على القسطرة. لا ينبغي دفع طرف القسطرة بعيدا في القلب لضمان التروية الجيدة للقلب عبر الشريان التاجي.

بمجرد تثبيته ، اربط الشريان الأورطي بالقسطرة بالخياطة. بعد ذلك ، افتح منظم الخط الوريدي للسماح بمعدل تنقيط سريع والسماح للنحلة العازلة بغسل القلب أثناء غسل النحل العازل. استخدم المقص الصغير والملقط لإزالة الأذينين وأي أنسجة دهنية أو رئوية تلتصق بالقلب.

بعد الانتهاء من المخزن المؤقت B، قم بتبديل التدفق إلى التخزين المؤقت لفترة من الوقت. يسمح للمخزن المؤقت A بالتدفق لمدة خمس دقائق. قم بتسخين محلول الإنزيم في حمام مائي 37 درجة مئوية.

عندما يتم استنفاد المخزن المؤقت A من المحقنة ولكنه لا يزال موجودا في حمل الأنبوب 50 مل من محلول الإنزيم في المحقنة A من جهاز الوفرة. من الضروري الآن التخلص من كل التدفق من دورق التجميع في الحمام المائي حتى يطلع محلول الإنزيم على القلب. بمجرد أن يطلع محلول الإنزيم على القلب ، قم بتنشيط المضخة التمعجية ، والتي تم إعدادها لنقل محلول الإنزيم من دورق التجميع إلى المحقنة التي تم تجديدها.

أ السماح لمحلول الإنزيم بالتدفق عبر القلب لمدة 10 دقائق. عندما يهضم القلب ، يبدأ في الظهور منتفخا عند 37.5 ميكرولتر من 0.1 كلوريد كالسيوم مولار لمحلول الإنزيم في المحقنة A لإعطاء تركيز فعال يبلغ 0.1 مللي مولار من الكالسيوم. هذه هي الأولى من بين العديد من إضافات كلوريد الكالسيوم المستخدمة لزيادة التركيز بعد 10 دقائق ، وزيادة تركيز الكالسيوم إلى 0.2 مللي مولار عن طريق إضافة 50 ميكرولتر إضافي من 0.1 كلوريد الكالسيوم المولي إلى المحقنة A والسماح للوفرة بالاستمرار لمدة 10 دقائق أخرى.

بعد انقضاء 10 دقائق ، اقطع البطينين وانقل القلب إلى دورق صغير معقم يحتوي على 20 مل من محلول الإنزيم في الدورق قم بزيادة تركيز الكالسيوم إلى 0.4 ملليمولار عن طريق إضافة 40 ميكرولترا إضافيا من 0.1 مولي كلوريد الكالسيوم ، وقم بفرم القلب برفق إلى 10 قطع أو أكثر باستخدام مقص صغير معقم. الآن احتضن الدورق عند 37 درجة مئوية مع هزاز لطيف.

بعد خمس دقائق من الحضانة ، أضف 40 ميكرولترا من كلوريد الكالسيوم 0.1 مولار لإعطاء تركيز فعال يبلغ 0.6 مللي مولار من الكالسيوم وكرر قطع القلب برفق باستخدام ماصة نقل بلاستيكية ثلاث إلى خمس مرات بعد الحضانة لمدة خمس دقائق إضافية عند 37 درجة مئوية ، أضف 40 ميكرولترا من كلوريد الكالسيوم 0.1 مولار وكرر برفق كما كان من قبل. استخدم مرشحا معقما بحجم 500 ميكرومتر لفصل الخلايا العضلية المفردة المهضومة عن النسيج الضام غير المهضوم. اسمح للخلايا بالاستقرار في أنبوب سعة 50 مليلتر لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وتخلص من المادة الطافية بنقل VI أعد تعليق الخلايا برفق في مخزن الغسيل رقم واحد ، واترك الخلايا تستقر لمدة 10 إلى 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة أثناء استقرار الخلايا.

خذ كمية صغيرة واستخدم هذا الوقت كفرصة لتقييم جودة وصلاحية الخلايا المعلقة تحت المجهر المقلوب. سيكون للتحضير الجيد نسبة عالية من الخلايا الشبيهة بالقضيب ذات التشققات الواضحة. بمجرد أن تستقر الخلايا ، تخلص من snat وأعد تعليق الخلايا برفق في مخزن الغسيل.

ثانيا ، دع الخلايا تستقر في درجة حرارة الغرفة ، والتي يجب أن تستغرق مرة أخرى من 10 إلى 20 دقيقة وتخلص من المادة الطافية. أعد تعليق الخلايا برفق في وسط مصل بنسبة 5٪ قبل نقل الخلايا إلى ألواح زراعة الأنسجة. اغسل الأطباق ب XSFM واحد.

انقل الخلايا بالكثافة المرغوبة واحتضانها في حاضنة زراعة أنسجة CO2. لمدة ثلاث إلى خمس ساعات ، قم بتبديل الوسائط إلى واحدة يمكن زراعة خلايا XSFM لمدة تصل إلى أربعة أيام واستخدامها كما هو مطلوب للتجارب. يجب أن يكون هناك أكثر من 70٪ من خلايا عضلة القلب الحية تحت المجهر المقلوب عندما يتم البروتوكول بشكل صحيح.

هذه هي الخلايا العضلية المعزولة المنقولة باستخدام YFP REM بعد زراعتها لمدة 48 ساعة. عادة ما يتم زراعة الخلايا بهذه الجودة من هذا الإجراء. سنوضح لك فقط كيفية العزل والثقافة هي تلك الخلايا الساخنة.

عند القيام بهذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن تكون سريعا ونظيفا قدر الإمكان. هذا كل شيء. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.