Name: الابتدائية ثقافة الكبار Myocytes قلب فأر (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-06-16T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: تعلم عزل وزراعة الخلايا العضلية القلبية للجرذان البالغة باستخدام الكولاجينيز والبروتياز. يوفر هذا البروتوكول خلايا قابلة للحياة لدراسات الفسيولوجيا القلبية والاختبارات الدوائية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

إعداد الجزء الأول للجراحة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل يوم من الجراحة الفئران ، تأكد أن جميع الحلول ، ولكنها لا تضيف أي الانزيمات حتى الان. يجب على جميع المخازن ألف وباء ، وغسل العازلة تتم تصفيته للعقم قبل التخزين. يجب على جميع المخازن المؤقتة يمكن تخزينها في 4 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجب أن تكون مطلية 6 لوحات زراعة الأنسجة بشكل جيد مع 10-20 ميكروغرام / مل في laminin 1XSFM مل (2) وقبل يوم وكذلك ، ويجب أن يتم تخزينها في 37 درجة مئوية في حاضنة 2 CO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم من الجراحة ، وإعداد الأدوات الجراحية بواسطة تعقيم المشبك ، مقص ، وملقط مع الايثانول 70 ٪ والسماح لهم الجاف على منشفة ورقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم إجراء حقنة مليئة 1 مل 0.5 مل من محلول الهيبارين (90 يو / مل) جاهزة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الآن هو الممارسة السليمة لغسل الجهاز الارواء عن طريق تشغيل من خلال الايثانول 70 ٪ ، وذلك باستخدام مضخة تمعجية في الاتجاه المعاكس. بمجرد الانتهاء الشطف مع الإيثانول ، شطف مع الماء المقطر جهاز مزدوج ، وأخيرا مع شطف ألف الاحتياطي تدفق من خلال تجمع في كوب توضع في حمام مائي 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإعداد جهاز نضح تنظيفها ، وملء الأنبوب حقنة الحق مع 40 مل من الاحتياطي ألف والمحاقن أنبوب اليسار مع 40 مل من الاحتياطي B. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رئيس الأنبوب نضح لغيض من القسطرة عن طريق السماح الاحتياطي ألف إلى تدفق من خلال اجهزتها. الملء إلى المخزن المؤقت للحقنة إلى مستوى 40 مل. تأكد من عدم وجود فقاعات الهواء المحتبسة في الأنبوب بعد هذه الخطوة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الآن ، أغلق العازلة صمام محبس حقنة وتكرار هذه العملية مع B الاحتياطي بحيث يتم تستعد الآن للأنابيب العازلة نضح مع باء </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أخيرا ، بقي الجهاز الارواء مع B الاحتياطي فتح صمام محبس ، ولكن مع توقف تدفق باستخدام منظم على خط الرابع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل العازلة على الرغم من التدفق في الدورق جمع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> آخر شيء يجب القيام به قبل الجراحة هو اضافة الانزيمات اللازمة لمحلول المخزون الخاص بك ، ومن ثم تصفية حل انزيم تماما كما كانت الحلول الأخرى التي تمت تصفيتها في اليوم السابق. تصفيتها مرة ، يمكن ترك هذا الحل في درجة حرارة الغرفة. </li></ol> الجزء الثاني. تشريح الجرذ القلب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بروتوكول قياسي بعد الموت ببطء الفأر مع Isoflurane في غرفة الغاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم منطقة شق في الصدر مع الايثانول 70 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح صدره وباستخدام مقص كشف القلب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضخ البطين الأيسر مع 0.5 مل من محلول الهيبارين (90 يو / مل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> القلب مع إزالة جزء كبير من الشريان الأورطي سليمة ، في مكان مؤقت باء الجليد الباردة </li></ol> الجزء الثالث. Myocytes العزلة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي أن يكون قلب فأر نموذجية تسفر عن جزء كبير من قضيب على شكل myocytes (على العكس من خلايا ميتة مدورة) إذا تم الالتزام بها بشكل صحيح إلى الإجراء التالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتبدأ ، المشبك الأبهر إلى القسطرة. لا ينبغي للطرف القسطرة يتم دفع بعيدا جدا في قلب لضمان التروية الجيدة للقلب عن طريق الشريان التاجي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فرضت مرة واحدة ، التعادل الأورطى إلى القسطرة مع خياطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المقبل ، فتح خط الرابع المنظم للسماح بمعدل سريع بالتنقيط (~ 60 قطرات / دقيقة) ، والسماح ب العازلة لتغسل القلب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أثناء غسل B الاحتياطي ، استخدام مقص صغير وملقط لإزالة أي الأذينين والأنسجة الدهنية أو الرئة التشبث القلب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الانتهاء من الاحتياطي B ، والتحول إلى تدفق ألف العازلة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين يسمح للمخزن في التدفق لمدة 5 دقائق ، ينبغي تنفيذ المهام الصغيرة عدة بسرعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أولا ، دافئة الحل أنزيم في حمام ماء C ° 37. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أخيرا ، عندما يتم استنفاد الاحتياطي A من الحقنة (ولكن لا تزال موجودة في الأنبوب) ، تحميل 50 مل من محلول أنزيم في حقنة ألف من جهاز نضح </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فقد بات من الضروري لتجاهل كل من التدفق من خلال جمع الدورق في حمام مائي (بواسطة pipetting) ، حتى في قلب الحل perfuses الانزيم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بمجرد حلول perfuses أنزيم في القلب ، تنشيط مضخة تمعجية التي تم إعدادها لنقل الحل الانزيم من الدورق جمع ألف حقنة لتجديد </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انزيم يسمح الحل تتدفق في القلب لمدة 10 دقيقة. كما يساعد على هضم القلب ، فإنه يبدأ النظر المتضخمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 37.5 ميكرولتر من 0.1 م 2 CaCl في حل الانزيم في حقنة وإعطاء التركيز الفعال لكا 2 + 0.1 ملم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 10 دقيقة زيادة تركيز الكالسيوم إلى 0.2 ملي بإضافة مبلغ إضافي 50 ميكرولتر من CaCl م 2 إلى 0،1 ألف حقنة ، والسماح للنضح المضي قدما لمدة 10 دقائق أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع ونقل إلى البطينين دورق معقمة صغيرة تحتوي على 20 مل من محلول أنزيم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الدورق زيادة تركيز الكالسيوم إلى 0.4 ملي وذلك بإضافة 40 ميكرولتر أكثر من 0.1 م CaCl 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اللحم المفروم برفق القلب إلى 10 أو أكثر من قطعة مع زوج من مقص صغير العقيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الكأس لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية مع هزاز لطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 40 مل من CaCl م 2 إلى 0.1إعطاء التركيز الفعال لكا 2 + 0.6 مليمتر ومتمزج بلطف القطع القلب مع الماصة نقل البلاستيك 3-5 مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد حضانة لمدة 5 دقائق إضافية عند 37 درجة مئوية ، إضافة 40 مل من 0.1 م 2 CaCl متمزج بلطف وكما حدث من قبل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> myocytes منفصلة واحدة من المنظمات غير مهضوم مهضوم النسيج الضام باستخدام الترشيح من خلال شبكة العقيمة ميكرومتر 500. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للخلايا ليستقر في أنبوب 50 مل لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طاف مع تجاهل نقل الماصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend بلطف الخلايا في مخزن # 1 اغسل وتسمح للخلايا لتسوية لمدة 10-20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين أن الخلايا هي تسوية ، واتخاذ قسامة الصغيرة ، واستخدام هذا الوقت فرصة لتقييم جودة وسلامة الخلايا في تعليق تحت مجهر مقلوب. وسوف التحضير الجيد لها نسبة عالية (&gt; 80 ٪) من قضيب مثل الخلايا مع التصدعات هش. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة في الخلايا قد استقروا ، تجاهل الخلايا وطاف resuspend برفق في مخزن اغسل # 2. السماح للخلايا يستقر عند درجة حرارة الغرفة ، والتي ينبغي أن تأخذ مرة أخرى 10-20 دقيقة ، وتجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكرار عملية الغسيل ومرة ​​أخرى مع الاحتياطي اغسل # 3 ، وخلايا يكون جاهزا للثقافة. </li></ol> الجزء الرابع. الخلية العضلية الثقافة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend بلطف خلايا في وسائل الاعلام المصل 5 ٪. قبل نقل الخلايا لوحات زراعة الأنسجة ، وتغسل الصحون مع 1X SFM. نقل الخلايا في مناطق ذات كثافة المطلوبة واحتضان ثاني أكسيد الكربون في الأنسجة 2 ثقافة حاضنة لمدة 3-5 ساعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبديل وسائل الإعلام لSFM 1X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن أن يكون مثقف الخلايا لمدة تصل إلى أربعة أيام ، واستخدمت على النحو المطلوب لإجراء التجارب. </li></ol> الجزء الخامس الممثل النتائج / نتائج يجب أن يكون هناك أكثر من 70 ٪ myocytes القلب يعيش تحت المجهر المقلوب عندما يتم البروتوكول بشكل صحيح. <img src="/files/ftp_upload/1308/fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الجدول رقم 1 : وصفة الحل : 1 L 10X كا 2 + خالية من الاحتياطي KH : <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> كتلة </td><td> التركيز النهائي </td></tr><tr><td> كلوريد الصوديوم </td><td> ز 68.96 </td><td> 1180 ملي </td></tr><tr><td> بوكل </td><td> 3.58 ز </td><td> 48 ملم </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> ز 59.58 </td><td> 250 ملم </td></tr><tr><td> K 2 4 هبو </td><td> 2.85 ز </td><td> 12.5 ملم </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> 3.08 ز </td><td> 12.5 ملم </td></tr></tbody></table> الجدول 2 : وصفة لحلول الاحتياطي L 1 ج : إضافة 1،98 ز الجلوكوز إلى 100 مل العازلة KH 10X وتقديمهم إلى الحجم النهائي من 1 L. ضبط الأسمولية إلى حالة فسيولوجية قرب (~ 300) مع الجلوكوز. يرتفع الى 7.4 درجة الحموضة مع هيدروكسيد الصوديوم. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> -- </td><td> كتلة </td><td> التركيز النهائي </td></tr><tr><td> 10X KH العازلة </td><td> 100 مل </td><td> 100 مل </td></tr><tr><td> جلوكوز </td><td> 1.98 ز </td><td> 11 ملم </td></tr><tr><td> جلب إلى 1 L </td><td></td><td></td></tr><tr><td> يرتفع الى 7.4 درجة الحموضة مع هيدروكسيد الصوديوم </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> الأسمولية لضبط حالة فسيولوجية قرب (~ 300) مع الجلوكوز. </td></tr></tbody></table> الجدول 3 : وصفة الحل لأنزيم المخازن <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> كتلة </td><td> التركيز النهائي </td></tr><tr><td> كولاجيناز النوع الثاني </td><td> 25 ملغ </td><td> 0.05 ٪ (W / V) </td></tr><tr><td> البروتيني الرابع عشر </td><td> 10 ملغ </td><td> 0.02 ٪ (W / V) </td></tr><tr><td> BDM </td><td> 0،025 ز </td><td> 5 ملم </td></tr><tr><td> كارنيتيني </td><td> 0،020 ز </td><td> 2 ملم </td></tr><tr><td> توراين </td><td> 0،031 ز </td><td> 5 ملم </td></tr><tr><td> حمض الجلوتاميك </td><td> 0،020 ز </td><td> 2 ملم </td></tr><tr><td> 0.1 م 2 CaCl </td><td> 12.5 UL </td><td> 25 UM </td></tr><tr><td> والعازلة </td><td></td><td> لملء 50 مل </td></tr></tbody></table> الجدول 4 : وصفة الحل لBDM 25X / توراين / جيش صرب البوسنة (B / T / B) <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> كتلة </td><td> التركيز النهائي </td></tr><tr><td> BDM </td><td> 0،076 ز </td><td> 125 ملم </td></tr><tr><td> توراين </td><td> 0،094 ز </td><td> 125 ملم </td></tr><tr><td> BSA </td><td></td><td> 0.1 ٪ (W / V) </td></tr><tr><td> والعازلة </td><td></td><td> ملء إلى 6 مل </td></tr></tbody></table> الجدول 5 : وصفة لحلول B العازلة والمخازن اغسل <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> العازلة : </td><td> B </td><td> # 1 </td><td> # 2 </td><td> # 3 </td></tr><tr><td> إضافة : </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 0.5 م 2 CaCl </td><td> 0.4 مل </td><td> 0.1 مل </td><td> 0.125 مل </td><td> 0.15 مل </td></tr><tr><td> نهائي تركيز CaCl 2 </td><td> 1 ملم </td><td> 1 ملم </td><td> 1.25 مم </td><td> 1.5 ملم </td></tr><tr><td> 25X B / T / B </td><td> --- </td><td> 2 مل </td><td> 2 مل </td><td> 2 مل </td></tr><tr><td> العازلة وحدة تخزين إلى النهائي </td><td> 200 مل </td><td> 50 مل </td><td> 50 مل </td><td> 50 مل </td></tr></tbody></table> الجدول 6 : وصفة الحل للاعلام التثقيف <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> 2X المصل خالية من وسائل الإعلام (SFM) </td><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="2"> </td><td rowspan="2"></td><td> التركيز النهائي </td></tr><tr><td> (بعد التخفيف) </td></tr><tr><td> كارنيتيني </td><td> 0،099 ز </td><td> 10 ملم (5 ملم) </td></tr><tr><td> توراين </td><td> 0،063 ز </td><td> 10 ملم (5 ملم) </td></tr><tr><td> الكرياتين </td><td> 0،075 ز </td><td> 10 ملم (5 ملم) </td></tr><tr><td> مضاد حيوي / مضاد فطري </td><td> 0.5 مل </td><td> 1 ٪ (0.5 ٪) (V / V) </td></tr><tr><td> وسائل الإعلام 199 </td><td> 45 مل </td><td> لملء 50 مل </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1X SFM </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td> التركيز النهائي </td></tr><tr><td> 2X SFM </td><td> 25 مل </td><td> 1X </td></tr><tr><td> وسائل الإعلام 199 </td><td></td><td> لملء 50 مل </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1X الإعلام المصل 5 ٪ </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td> التركيز النهائي </td></tr><tr><td> 2X SFM </td><td> 25 مل </td><td> 1X </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 2.5 مل </td><td> 5 ٪ (V / V) </td></tr><tr><td> وسائل الإعلام 199 </td><td></td><td> لملء 50 مل </td></tr></tbody></table>

<ol><li>Miriyala, J., Nguyen, T., Yue, D. T., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+CaVbeta+subunits%2C+and+lack+of+functional+reserve%2C+in+protein+kinase+A+modulation+of+cardiac+CaV1.2+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Role of CaVbeta subunits, and lack of functional reserve, in protein kinase A modulation of cardiac CaV1.2 channels.</a> Circ Res. 102 (7), e54-e64 (2008).</li>
<li>SX, T. akahashi, Mittman, S., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinctive+modulatory+effects+of+five+human+auxiliary+beta2+subunit+splice+variants+on+L-type+calcium+channel+gating%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys%22%5BJournal%5D)">Distinctive modulatory effects of five human auxiliary beta2 subunit splice variants on L-type calcium channel gating.</a> Biophys. , 84-845 (2003).</li>
</ol>

والخطوة الحاسمة هي السرعة التي معلوق قلب معزولة حتى على نظام الارواء. ربما لطول فترة الهضم الأنزيمي تكون مختلفة قليلا عن كل فأر. التعديل يتوقف على مدى اللين قلب يصبح بعد فترة العادية الهضم. الانتعاش ببطء من كا 2 + بعد الهضم انزيم ضروري للحصول على الكالسيوم 2 + التي تتحمل الخلايا السليمة. لخنزير غينيا ، والبروتوكول هو نفسه ما عدا يستخدم بدلا من الرابع عشر هيالورونيداز البروتياز. عادة ، فإننا ...

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6191</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9666</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fluka</td><td>63068</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>ملح صوديوم الهيبارين</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4784</td><td></td></tr><tr><td>كولاجيناز من النوع II</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>بروتياز XIV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5147</td><td></td></tr><tr><td>2,3-بيوتان ديون مونوكسيم (BDM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0753</td><td></td></tr><tr><td>كارنيتين</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9500</td><td></td></tr><tr><td>تاورين</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0625</td><td></td></tr><tr><td>حمض الغلوتاميك</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1501</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3294</td><td></td></tr><tr><td>كرياتين</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3630</td><td></td></tr><tr><td>مضاد حيوي</td><td>Cellgro</td><td>30-009-CI</td><td></td></tr><tr><td>وسط Media 199</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11150</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>لامينين</td><td>BD Biosciences</td><td>354232</td><td></td></tr><tr><td>حمام مائي</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-462-5</td><td></td></tr><tr><td>مضخة كيميائية متغيرة التدفق</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-077-67</td><td></td></tr><tr><td>طبق زراعة بـ 6 آبار</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr></tbody></table>

الابتدائية ثقافة الكبار myocytes قلب فأر

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

مثقف القوارض خلايا البالغين قلب نظام الأساسي ونموذجا هاما للبحوث القلب والأوعية الدموية. ومع ذلك ، يمكن إنشاء وقابلة للحياة قوية myocytes الكبار مثقف أن يكون تحديا تقنيا ، ومعدل منظم الخطوة لكثير من الباحثين. وصف نحن هنا بروتوكولا للحصول على غلة عالية من البالغين myocytes قلب الفئران التي لا تزال قابلة للحياة في الثقافة لعدة أيام. معزول القلب وperfused مع كولاجيناز والبروتيني منخفض تحت كا<sup&gt; 2 +</sup&gt; الظروف لاستعادة myocytes واحد. كاليفورنيا<sup&gt; 2 +</supويتم الحصول على&gt; الخلايا التي تتحمل زيادات تدريجية في الكالسيوم خارج الخلية<sup&gt; 2 +</sup&gt; التركيز في ثلاث خطوات غسل اللاحقة. يتم تصفية الخلايا ، معلق في وسط الثقافة ، ومطلي عن زلات laminin المغلفة. myocytes مثقف تم الحصول عليها باستخدام هذا البروتوكول قابلة للبقاء لمدة تصل إلى أربعة أيام ، وتكون مناسبة لمعظم التجارب بما في ذلك الكهربية ، والكيمياء الحيوية ، والتصوير والبيولوجيا الجزيئية.

في هذه الورقة ، ووصف لنا طريقة نموذجية لعزل والثقافة myocytes الكبار قلب الفئران. وتستخدم كولاجيناز البروتيني لهضم وعزل myocytes واحد. Myocytes مثقف اتبع هذا البروتوكول تلبية الاحتياجات الأكثر تجربة.

الابتدائية ثقافة الكبار Myocytes قلب فأر

تعد خلايا قلب القوارض البالغة الأولية المستزرعة نظاماً نموذجياً هاماً لأبحاث القلب والأوعية الدموية. ومع ذلك، فإن تأسيس...

تبدأ العملية باستئصال القلب من جرذ بالغ وتعليقه في نظام التروية. تُترك المحاليل الإنزيمية للتروية لمدة 30 دقيقة تقريبًا، وبعد ذلك يتم إزالة القلب. يُفرم القلب ويُترك الهضم الإنزيمي ليستمر في بيكر صغير.في نهاية عملية الهضم، يتم تفكيك الخلايا إلى معلق من الخلايا المفردة عن طريق التحريك الميكانيكي وتصفيتها في أنبوب معقم. تُغسل خلايا القلب الأولية ثلاث مرات في محاليل منظمة بتركيزات متزايدة من الكالسيوم، ثم يُعاد تعليقها في وسط استزراع وتُزرع في أطباق استزراع أنسجة مطلية باللامينات. مرحباً، أنا شاهي من مختبر هنري كوا في قسم الفسيولوجيا والفيزياء الحيوية الخلوية بجامعة كولومبيا.سنعرض لكم اليوم إجراءً لعزل واستزراع خلايا أخرى من قلب الجرذ. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة قنوات الكالسيوم في القلب. لذا، دعونا نبدأ.في اليوم السابق للجراحة على الجرذ، تأكد من تحضير جميع المحاليل، ولكن لا تضف أي إنزيمات بعد. يجب ترشيح المحلولين المنظمين a و B ومحلول الغسيل لضمان التعقيم قبل تخزينها في درجة حرارة 4 °C. كما يجب تحضير أطباق زراعة الأنسجة ذات الستة آبار بمحلول التصفحي (laminate solution) في اليوم السابق أيضاً وتخزينها عند 37 °C في حضانة CO2.في يوم الجراحة، يتم تحضير الأدوات الجراحية عن طريق تعقيم المقصات والملاقط والملقط باستخدام 70%ethanol وتركها لتجف على مناديل ورقية. كما يتم تحضير حقنة سعة 1 mL مملوءة بـ 0.5 mL من محلول heparin.من الممارسات الجيدة الآن غسل جهاز التروية بتمرير ethanol بتركيز 70% باستخدام المضخة 연동ية (peristaltic pump) في الاتجاه العكسي. وبمجرد الانتهاء من الشطف باستخدام ethanol، يتم شطف الجهاز بماء مقطر مزدوج، وأخيرًا الشطف باستخدام buffer A. يتم تجميع السائل المتدفق في دورق ووضعه في حمام مائي عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. ولتجهيز جهاز التروية الذي تم تنظيفه، يتم ملء أنبوب المحقنة الأيمن بـ 40 milliliters من buffer A وأنبوب المحقنة الأيسر بـ 40 milliliters من buffer B. يتم تحضير أنابيب التروية وصولاً إلى طرف القسطرة عن طريق السماح لـ buffer A بالتدفق عبر الجهاز.أعد ملء محقنة المنظم حتى مستوى 40 milliliter. تأكد من عدم وجود فقاعات هواء محتبسة في الأنابيب بعد هذه الخطوة، ثم أغلق محقنة المنظم باستخدام صمام القفل وكرر العملية بحيث يتم تحضير أنابيب التدفق الآن بالمنظم B. وبذلك يصبح جهاز التدفق جاهزاً في النهاية ويترك مع بقاء صمام القفل للمنظم B مفتوحاً، مع إيقاف التدفق.باستخدام المنظم الموجود في خط التسريب الوريدي (IV line)، تخلص من التدفق المنفذ للمحلول المنظم في الكأس الجامع. والخطوة الأخيرة قبل الجراحة هي إضافة الإنزيمات المطلوبة إلى المحلول المخزون، ثم ترشيح محلول الإنزيم تماماً كما تم ترشيح المحاليل الأخرى في اليوم السابق. وبمجرد الترشيح، يمكن ترك هذا المحلول في درجة حرارة الغرفة وفقاً للبروتوكول القياسي.يتم القتل الرحيم للجرذ باستخدام iso fluorine في غرفة غاز. يتم تعقيم منطقة الشق في الصدر باستخدام 70%ethanol. يُفتح الصدر باستخدام المقص لإظهار القلب.احقن البطين الأيسر بـ 0.5 milliliters من محلول الهيبارين. استخرج القلب مع الإبقاء على جزء كبير من الأبهر سليمًا. أدخل القسطرة فوراً في الأبهر.يجب أن يعطي قلب الجرذ النموذجي نسبة عالية من الخلايا العضلية القلبية السليمة ذات الشكل العصوي وعددًا قليلاً من الخلايا المستديرة الميتة. إذا تم الالتزام بالإجراء التالي بشكل صحيح، فابدأ بتثبيت الشريان الأورطي بالقسطرة. يجب عدم دفع طرف القسطرة بعيداً جداً داخل القلب لضمان تروية جيدة للقلب عبر الشريان التاجي.بمجرد وضع الملقط، اربط الأبهر بالقسطرة باستخدام خيط الجراحة. بعد ذلك، افتح منظم الخط الوريدي للسماح بمعدل تنقيط سريع، واترك buffer bee يغسل القلب أثناء عملية غسيل buffer bee. استخدم المقص الصغير والملقط لإزالة الأذينين وأي أنسجة دهنية أو رئوية ملتصقة بالقلب.بعد الانتهاء من المحلول المنظم B، قم بتحويل التدفق إلى المحلول المنظم A لفترة وجيزة. يُترك المحلول المنظم A ليتدفق لمدة خمس دقائق. قم بتدفئة محلول الإنزيم في حمام مائي عند 37 °C.عند نفاد المحلول المنظم A من المحقنة مع بقائه في الأنابيب، قم بتعبئة 50 milliliters من محلول الإنزيم في المحقنة A في جهاز profusion. يجب الآن التخلص من جميع السوائل المتدفقة من كأس التجميع في الحمام المائي حتى ينفذ محلول الإنزيم من خلال القلب. وبمجرد نفاذ محلول الإنزيم من خلال القلب، قم بتشغيل المضخة 연동ية (peristaltic pump)، والمعدة لنقل محلول الإنزيم من كأس التجميع إلى المحقنة التي تم إعادة تعبئتها.اترك محلول الإنزيم يتدفق عبر القلب لمدة 10 دقائق. ومع هضم القلب، يبدأ في الظهور بشكل منتفخ؛ أضف 37.5 microliters من كلوريد الكالسيوم بتركيز 0.1 molar إلى محلول الإنزيم في السرنجة A للحصول على تركيز فعال قدره 0.1 millimolar من الكالسيوم. هذه هي الإضافة الأولى من عدة إضافات لكلوريد الكالسيوم تُستخدم لزيادة التركيز بعد 10 دقائق، قم بزيادة تركيز الكالسيوم إلى 0.2 millimolar عن طريق إضافة 50 microliters إضافية من كلوريد الكالسيوم بتركيز 0.1 molar إلى السرنجة A، واترك عملية التروية تستمر لمدة 10 دقائق أخرى.بعد مرور 10 دقائق، يتم قطع البطينين ونقل القلب إلى بيكر صغير معقم يحتوي على 20 milliliters من محلول الإنزيم. يتم زيادة تركيز الكالسيوم إلى 0.4 millimolar عن طريق إضافة 40 µL إضافية من كلوريد الكالسيوم بتركيز 0.1 molar، ثم يُقطع القلب برفق إلى 10 قطع أو أكثر باستخدام مقص معقم صغير. بعد ذلك، يتم تحضين البيكر عند 37 °C مع الرج الخفيف.بعد خمس دقائق من الحضن، أضف 40 µL من كلوريد الكالسيوم بتركيز 0.1 M للحصول على تركيز فعال من الكالسيوم قدره 0.6 mM، وقم بتحريك قطع القلب بلطف باستخدام ماصة نقل بلاستيكية من ثلاث إلى خمس مرات. بعد الحضن لمدة خمس دقائق إضافية عند 37 °C، أضف 40 µL من كلوريد الكالسيوم بتركيز 0.1 M وقم بالتحريك بلطف كما سبق. استخدم مرشحاً معقماً بمسامية 500 µm لفصل الخلايا العضلية القلبية المفردة المهضومة عن الأنسجة الضامة غير المهضومة. اترك الخلايا تترسب في أنبوب سعة 50 mL لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم تخلص من supernatant باستخدام ماصة نقل. أعد تعليق الخلايا بلطف في محلول الغسيل رقم 1، واترك الخلايا تترسب لمدة 10 إلى 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة أثناء عملية الترسيب.خذ كمية صغيرة واستغل هذا الوقت لتقييم جودة وحيوية الخلايا العالقة باستخدام مجهر مقلوب. يتميز التحضير الجيد بوجود نسبة عالية من الخلايا العصوية ذات التخطيطات الواضحة. وبمجرد ترسيب الخلايا، تخلص من السائل العلوي وأعد تعليق الخلايا برفق في محلول الغسيل المنظم.ثانيًا، اترك الخلايا تترسب في درجة حرارة الغرفة، وهو ما يستغرق مرة أخرى من 10 إلى 20 دقيقة، ثم تخلص من السائل الطافي. أعد تعليق الخلايا برفق في وسط غذائي يحتوي على 5% serum قبل نقل الخلايا إلى أطباق زراعة الأنسجة. اغسل الأطباق باستخدام 1X SFM.انقل الخلايا بالكثافة المطلوبة وحضنها في حضانة زراعة أنسجة تحتوي على CO2. بعد مرور ثلاث إلى خمس ساعات، استبدل الوسط الغذائي بـ one XSFM. يمكن زراعة الخلايا لمدة تصل إلى أربعة أيام واستخدامها حسب الحاجة في التجارب. يجب أن تكون نسبة الخلايا العضلية القلبية الحية أكثر من 70% عند فحصها تحت المجهر المقلوب إذا نُفذ البروتوكول بشكل صحيح.هذه خلايا عضلية معزولة تم نقل YFP REM إليها بعد استنباتها لمدة 48 ساعة. وعادة ما يتم استنبات خلايا بهذه الجودة باستخدام هذا الإجراء. سنوضح لكم كيفية عزل واستنبات هذه الخلايا.عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر ضرورة العمل بأقصى سرعة وبأكبر قدر ممكن من النظافة. هذا كل شيء. شكراً للمتابعة وبالتوفيق في تجاربكم.

primary-culture-of-adult-rat-heart-myocytes

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

الأولية الثقافات الماوس cardiomyocyte هي واحدة من الأدوات المحورية للتحقيق في منظمة myofibrillar وظيفة. يصف بروتوكول التالية العزلة وثقافة العضلية الأولية من قلوب الماوس حديثي الولادة. ويمكن استخدام الثقافات cardiomyocyte الناتجة لاحقا لمجموعة متنوعة من النشاط الحيوي، فحوصات البيوكيميائية وخلايا البيولوجية.

العزلة وثقافة الأطفال حديثي الولادة ماوس العضلية

نحن هنا وصف عزلة cardiomyoctyes فأر بالغ باستخدام نظام نضح Langendorff. الخلايا الناتجة CA2 +-تسامحا، هادئة كهربائيا ويمكن أن يكون مثقف وtransfected مع-الغدة أو lentiviruses للتلاعب الجيني. ويمكن أيضا تحليل وظائفها باستخدام نظام MMSYS وتقنيات المشبك التصحيح.

العزلة والثقافة، وتوصيف وظيفي من الكبار ماوس Cardiomyoctyes

نحن تصف طريقة موثوق بها لعزل العضلية الماوس الكبار. هذا البروتوكول تعطي نتيجة متسقة لثقافة الكبار العضلية وظيفية من مجموعة متنوعة من الفئران المعدلة وراثيا.

العزلة وثقافة الكبار ماوس العضلية للاشارة الخليوي و<em&gt; في المختبر</em&gt; تضخم القلب

عزل خلايا عضلة القلب لدى الفئران حديثي الولادة هو إجراء يستغرق وقتا طويلا ولا يمكن التنبؤ به.  تصف هذه الدراسة طرق حفظ وذوبان خلايا عضلة القلب لدى الفئران حديثي الولادة مما يسمح باستخدام الخلايا بشكل أكثر كفاءة. يمكن استخدام NRMs المذابة في تجارب مختلفة دون الحاجة إلى إجراء عمليات عزل في كل مرة.

العزلة والحفظ بالتبريد من الأطفال حديثي الولادة الجرذ العضلية

يصف هذا البروتوكول طريقة خطوة بخطوة للعزل القابل للتكرار والثقافة طويلة الأمد لخلايا عضلة القلب في الفئران البالغة ذات الغلة العالية والنقاء والجدوى.

العزلة والثقافة وتنبيغ الخلايا العضلية ماوس الكبار

وقد وضعت العديد من البروتوكولات ووصف لعزل أنواع مختلفة من خلايا القلب من القلب الفئران. هنا، يوصف بروتوكول الأمثل الذي يسمح لعزل عالية الجودة أنواع الخلايا القلب الرئيسية (الخلايا العضلية، الخلايا البطانية، والألياف الليفية) من إعداد واحد، والحد من التكاليف التجريبية.

العزلة في وقت واحد من كارديوميوسيتس عالية الجودة، الخلايا البطانية، والألياف الليفية من القلب الجرذ الكبار

نقدم هنا، على بروتوكول لعزل وزراعة cardiomyocytes البطين الفئران الكبار (أرفك). يمكن استخدام أرفك معزولة لزراعة قصيرة وطويلة الأجل. عزل وزراعة أرفك يمكن أن تلعب دوراً رئيسيا في تطوير نظم المعالجة الجديدة لأمراض القلب.

عزل وزراعة كارديوميوسيتيس الفئران الكبار

وهنا يصف لنا إجراء أمثل، على أساس لانجيندورف لعزل cardiomyocytes أذينية خلية واحدة من نموذج الفئران من فشل القلب المتصلة بالمتلازمة الأيضية مع كسر قذفي الحفاظ على. دليل تنظيم الضغط إينترالومينال تجاويف القلب ينفذ تؤتي myocytes وظيفيا سليمة مناسبة للدراسات الإثارة-الانكماش-اقتران.

عزل كارديوميوسيتيس خوارج من نموذج الفئران من فشل القلب المتصلة بالمتلازمة الأيضية مع كسر قذفي الحفاظ على

هنا، نقدم بروتوكولاً للعزلة، وtransfection، والثقافة طويلة الأجل من الماوس الكبار والجرذان cardiomyocytes.

العزلة، وTransfection، والثقافة طويلة الأجل من الماوس الكبار والجرذان Cardiomyocytes

يتم وصف طريقة لعزل في وقت واحد من myocytes وغير myocytes من كل من الأذينين والبطينين من قلب الماوس الكبار واحد. هذا البروتوكول يؤدي إلى نتائج متسقة من myocytes القلب قابلة للحياة للغاية وغير myocytes وتفاصيل الظروف المثلى ثقافة الخلية محددة للphenotyping وفي المختبر التحليل.

العزلة المتزامنة وثقافة Myocytes الأذينية، myocytes البطينية، وغير Myocytes من قلب فأرة البالغين

تعلم عزل وزراعة الخلايا العضلية القلبية للجرذان البالغة باستخدام الكولاجينيز والبروتياز. يوفر هذا البروتوكول خلايا قابلة للحياة لدراسات الفسيولوجيا القلبية والاختبارات الدوائية.

الابتدائية ثقافة الكبار Myocytes قلب فأر

استكشف المزيد من الفيديوهات