تحليل مزدوج الجديلة إصلاح الحمض النووي (DSB) فاصل في خلايا الثدييات

توضح هذه المقالة GFP المستندة مضان

كما هو موضح في بروتوكول الفيديو هذا طريقة لقياس كفاءة ودقة إصلاح فرامل الحمض النووي المزدوج بواسطة NHEJ أو HR في خط خلايا الثدييات. يبدأ الإجراء بإنشاء خط خلية يحتوي على نسخة واحدة متكاملة كروموسومية من كاسيت مراسل NHEJ أو HR. ثم يتم نقل خلايا المراسل هذه بمزيج من I SCE ، أحدهما يعبر عن البلازميد و DS الأحمر والآخر بلازميد.

أنا أ. ينتج نوكلياز داخلي واحد فاصلا مزدوجا في بناء المراسل ويعمل DS RED كعنصر تحكم في التعدين. ثم يتم تحليل النسبة المئوية للخلايا الإيجابية ل GFP والخلايا الإيجابية الحمراء DS عن طريق الفاكس من أجل تحديد كفاءة NHEJ أو HR إذا رغبت في ذلك.

يتم تحليل دقة الإصلاح عن طريق إنقاذ منتجات المراسل في الإشريكية القولونية وتسلسل منتجات الإصلاح. بهذه الطريقة ، يتم تحديد كفاءة ودقة كسر الخيوط المزدوجة أو إصلاح DSB في خط خلية معين بناء على القياس الكمي للتدفق الخلوي لأحداث الإصلاح وتسلسل منتجات الإصلاح. تتمتع هذه الطريقة بالعديد من المزايا مقارنة بالطرق الحالية لتحليل إصلاح الفرامل ذات السلسلة المزدوجة.

بادئ ذي بدء ، تميز هذه الطريقة على وجه التحديد بين إعادة التركيب المتماثل وغير المتماثل والانضمام. ثم تكون الطريقة كمية للغاية ، مما يسمح بتحليل ملايين الخلايا عن طريق قياس التدفق الخلوي ومن ثم لا تتطلب الطريقة تغليفا شاملا للخلايا بعد اكتمال الإصلاح لاختيار CLS المقاوم للمضادات الحيوية. وأخيرا ، يمكن مراقبة اكتمال الإصلاح في الوقت الفعلي من خلال النظر إلى مظهر الخلايا الخضراء.

ويمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الإصلاح مثل قياس معدل ضربات القلب وكفاءة إصلاح HEGA في أنواع الخلايا الطافرة الفيروسية أو اتباع العلاجات الدوائية. فحص إصلاح A في مراحل مختلفة من دورة الخلية وقياس معدل الإصلاح بشكل عام. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأنه من المهم تحقيق كفاءة جيدة في التعداد.

في هذا الإجراء. يتم استخدام كاسيتين للمراسلين لفحص إصلاح فواصل الحمض النووي المزدوجة التي تقطعت بهم السبل. يتم استخدام شريط واحد لفحص الربط النهائي غير المتماثل أو إصلاح N-H-E-J-D-N-A.

يستخدم الآخر للنظر في إعادة التركيب المتماثل أو إصلاح الحمض النووي للموارد البشرية للنهاية غير المتماثلة. يحتوي شريط المراسل المرتبط على جين GFP مع إنترون هندسي بثلاثة كيلو قاعدة من جين PEM واحد أو GFP PEM واحد. باختصار ، تحتوي مقدمة P one على exon غدي محاط بتسلسلات التعرف على Hindi three و I SCE واحد نوكلياز داخلي لتحريض فواصل مزدوجة تقطعت بهم السبل.

مواقع I SCE one هي اتجاه مقلوب I SCE واحد له تسلسل التعرف غير المتجانس ، وبالتالي فإن موقعين مقلوبين يولدان غير متوافقين. ينتهي الحمض النووي غير متوافق. نهايات الحمض النووي تحاكي بشكل أفضل DSS التي تحدث بشكل طبيعي.

كاسيت NAEJ غير المرتب سلبي GFP حيث يعطل exon الفيروسي الغدي G-F-P-O-R-F. عند تحريض فواصل الحمض النووي المزدوجة التي تقطعت بهم السبل بواسطة ISEE واحد ، تتم إزالة exon الفيروسي الغدي ويستعيد NHEJ وظيفة جين GFP. يعتمد كاسيت مراسل إعادة التركيب المتماثل أيضا على بناء GFP PEM واحد في كاسيت HR.

الإكسون الأول من G FP PEM على حذف 22 زوجا أساسيا جنبا إلى جنب مع إدخال ثلاثة مواقع تقييد. أنا SCE واحد هندي ثلاثة أنا SCE E واحد. يضمن الحذف أنه لا يمكن إعادة تشكيل GFP من خلال حدث NHEJ هنا أيضا.

مواقع I SCE one في اتجاه معكوس. لذا فإن I SCE واحد يترك نهايات غير متوافقة. النسخة الأولى من GFP PMM واحد يتبعها مروج أقل من TG ، أقل exon الأول ومقدمة GFP M1. الهيكل السليم هو GFP سلبي عند تحريض كسر حبلا مزدوج بواسطة I sce E هضم واحد.

يتم إعادة تكوين جين GFP الوظيفي عن طريق حدث تحويل جيني بين نسختين متحولتين من أول GFP PMM إكسون واحد ، وأنواع أخرى من إصلاح DSB ، مثل العبور على الركوع المفردة التي تقطعت بهم السبل. ولن يعيد NHEJ تكوين جين GFP. نظرا لعدم وجود نسخة ثانية من جين GFP.

يعيد أول كودون A TG ودقة exon الثانية عن طريق العبور أو الركوع أحادي الشريطة نشاط GFP. لذلك يسمح هذا التصميم بالكشف الحصري عن الدقة عن طريق تحويل الجينات ، وهو مسار الموارد البشرية السائد في خلايا الثدييات. لبدء هذا الإجراء ، استخدم مجموعة endo free من Kyogen لإعداد مخزون عالي الجودة من NHEJ أو HR reporter البلازميد الخطي 10 ميكروغرام من البلازميد وتنقية الحمض النووي من محلول الهضم.

راجع البروتوكول المكتوب المصاحب للحصول على تفاصيل تحضير البلازميد. استعدادا للتعداد. تأكد من الحفاظ على الخلايا الليفية البشرية الطبيعية في أفضل ظروف النمو.

إذا بدأت من قارورة مجمدة ، فقم بتقسيم الخلايا مرتين قبل التعداد. إذا بدأت من صفيحة من خلايا التقاء ، فإن الخلايا تنمو مرة واحدة إلى 70 إلى 80٪ من التقاء. يستغرق هذا حوالي يومين لخمسة أضعاف 10 إلى الخلايا الخامسة المطلية في صفيحة 100 ملم.

للحصول على أفضل كفاءة في التعداء ، اجلب الخلايا إلى نمو لوغاريتمي. تحتوي الثقافة التي تنمو بنشاط على خلايا في المرحلة M ، والتي ينظر إليها على أنها خلايا مستديرة متصلة بالسطح لحصاد التعدي ، حوالي مرتين في 10 من الخلايا الست من لوحين 100 ملم. من الأهمية بمكان عدم الإفراط في التربسين ، حيث توقف الخلايا عن التربسين بمجرد انفصال 80٪ من الخلايا عن اللوحة.

أعد تعليق الخلايا في محلول NHDF. نظرا لأن الخلايا حساسة لمحلول NHDF ، قلل من وقت الحضانة واخلط الخلايا برفق. بعد ذلك ، استخدم مستجيب نواة amaxa لنقل الخلايا ب 0.5 ميكروغرام من بناء المراسل الخطي للأرومات الليفية البشرية الطبيعية.

تؤدي ظروف التعدي هذه إلى تكامل نسخة واحدة من بناء المراسل لغالبية التكامل 24 ساعة بعد التعدي بمعدل واحد ملليغرام لكل مليلتر من الوراثي أو G أربعة 18. من أجل تحديد الخلايا ذات التركيبات المراسلة المتكاملة كروموسومات ، استمر في التحديد لمدة سبعة إلى 10 أيام ، ثم اختر إما مستعمرات مقاومة فردية من G 4 1 8 أو تجمع المستنسخة المقاومة. قم بتوسيع الثقافة إلى ما يقرب من خمس ألواح 100 ملم.

قم بتجميد ثلاث لوحات لاستخدامها في المستقبل ، وقم بتوسيع اللوحين المتبقيين إلى خمسة أضعاف 10 إلى الخلايا الخامسة لكل لوحة 100 ملم. عادة ما تكون عشر ألواح مائة ملم كافية لخمسة ألواح شفافة. بعد يومين من الطلاء عندما وصلت الخلايا التي تحتوي على بناء المراسل إلى 70 إلى 80٪ من التقاء مع مزيج من خمسة ميكروغرامات من I sce واحد يعبر عن البلازميد و 0.1 ميكروغرام من البلازميد الأحمر DS.

كعنصر تحكم في كفاءة التعدي ، استخدم مستجيب نواة AM maxon لنقل حوالي مرتين في 10 من الخلايا الست من ثقافة تنمو لوغاريتميا. نظرا لأن كفاءة DSP تقاس كنسبة من الخلايا الموجبة ل GFP إلى الخلايا الموجبة الحمراء DS ، فقد تؤثر الاختلافات في خليط البلازميد الأحمر ISCE one و DS على النتائج. قد تؤثر جودة البلازميد أيضا على النتائج عن طريق تغيير كفاءة التعداد.

لذلك ، للحصول على قياسات متسقة ، من المهم استخدام نفس مزيج البلازميد في تجربة واحدة في نفس الوقت ، قم بإعداد ثلاثة عناصر تحكم في المعايرة للحقائق لكل عنصر تحكم. ترانسفكت حوالي مرتين في 10 من الخلايا الست. الضوابط الثلاثة هي خمسة ميكروغرامات من EGFP تعبر عن البلازميد ، وخمسة ميكروغرامات من DS ، وبلازميد أحمر ، وخمسة ميكروجرامات.

بلازميد تحكم لا يعبر عن بروتين الفلورسنت. بعد ثلاثة أيام من التعدي ، تحقق من كفاءة التعدي والتعبير عن البروتينات الحمراء GFP و DS بواسطة المجهر المقلوب الفلوري مع مرشحات للكشف عن GFP و DS. تنمو الخلايا الحمراء ليوم إضافي قبل تحليل الفاكس ، بعد أربعة أيام من حصاد التعداء ، يتم نقل الخلايا وخلايا التحكم في I SCE. في هذه المرحلة ، من الأهمية بمكان حصاد جميع الخلايا والحصول على خلايا مستديرة الشكل.

لتحقيق ذلك ، استخدم وقتا أطول لتحويل التربسين أو تركيزا أعلى من التربسين. افحص الخلايا تحت المجهر للتأكد من أن 99٪ من الخلايا منفصلة عن اللوحة ولها شكل دائري. أعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من PBS ونقلها إلى أنابيب الفاكس.

احتفظ بالخلايا على الجليد واحميها من الضوء بينما يمكن تخزين الخلايا على الجليد لبضع ساعات. للحصول على أفضل النتائج ، قم بتحليل الخلايا مباشرة بعد الحصاد. بعد ذلك ، قم بمعايرة الحقائق باستخدام TFP DS RED وعناصر التحكم السلبية.

اضبط الجهد وتعويض اللون لتضمين جميع خلايا الفلورسنت في التحليل. ضع في اعتبارك أن شدة الفلورسنت للعينات التجريبية أقل من شدة الضوابط. بعد معايرة الحقائق مع عناصر التحكم, تحليل I SCE واحدة الخلايا المنقولة عد ما لا يقل عن 20,000 خلية لكل علاج لمنع التداخل المحتمل بين GFP و ds.

التألق الأحمر يحافظ على النسبة المئوية للخلايا الإيجابية ل GFP أو الخلايا الإيجابية الحمراء DS أقل من 25٪ إذا كانت النسبة أعلى ، قلل من كمية DS RED أو I sce E بلازميد واحد. تتوافق النسبة المئوية للخلايا الإيجابية GFP مع كفاءة إصلاح D-N-A-D-S-P وتشير النسبة المئوية للخلايا الموجبة الحمراء DS إلى كفاءة التعداد. احسب الكفاءة النسبية لإصلاح D-N-A-D-S-P كنسبة من الخلايا الموجبة GFP إلى الخلايا الموجبة الحمراء DS.

من أجل تحديد دقة الأوامر التي تم إصلاحها ، قم بإنقاذ المراسل عن طريق هضم الحمض النووي الجيني مع تدفئة إنزيم واحد eco R وتحويله إلى خلايا الإشريكية القولونية المختصة. هذا الإنقاذ ممكن لأن التركيبات الأصلية تحتوي على أصل بكتيري للنسخ المتماثل تم تحليله عن طريق التقييد والهضم والتسلسل. هذه حقائق نموذجية ونتائج عمليات التحكم وتجارب NHEJ و HR.

شدة الفلورسنت وعدد الخلايا الفلورية أقل في الخلايا المنقولة I SCE مقارنة بالضوابط. يرجع الاختلاف في إشارة التألق إلى الاختلاف في عدد نسخ تركيبات GFP و DS RED في هذه الخلايا. تحتوي كل خلية في التجربة على نسخة واحدة من بنية المراسل المتكامل.

وبالتالي ، فإن أحداث الإصلاح الناجحة تعيد تكوين جين GFP في جزء صغير من الخلايا. يتم حساب كفاءة NHEJ و HR كنسبة من الخلايا الموجبة ل GFP إلى الخلايا الموجبة الحمراء DS. NHEA هي عملية أكثر كفاءة من الموارد البشرية في الخلايا البشرية ، في الخلايا الليفية البشرية ، تكون كفاءة NHEJ عادة من 0.6 إلى 1.3 وكفاءة الموارد البشرية من 0.05 إلى 0.3.

مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال إصلاح الحمض النووي لاستكشاف أدوار العوامل المختلفة في HEG و HR ودراسة حركية ولوائح NHEG و HR في خلايا الثدييات. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية قياس كفاءة ودقة HR و GJ في خلايا الثدييات باستخدام مقايسة الفلورسنت.