الكبار والعضلات والهيكل العظمي الجنينية Microexplant الثقافة وعزل خلايا جذعية عضلية هيكلية

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل المجموعات المخصبة من الخلايا الجذعية العضلية الهيكلية من غرسات الأنسجة التشريح الدقيقة التي تم الحصول عليها من العضلات أو الأجنة البالغة من أجل دراسة سلوكها ووظيفتها. قد يكون لهذه الخلايا أيضا استخدام علاجي. يتم تحقيق ذلك عن طريق تشريح العضلات المستهدفة أولا من جثث الفئران البالغة أو الأجنة من أنسجة الرحم في ظل ظروف معقمة.

تتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في غسل وتنظيف أنسجة العضلات للأنسجة العضلية البالغة ، وتشريح الدهون والأنسجة الضامة ونقلها إلى وسط DF 20 جديد للأجنة. قم بإزالة الأغشية الخارجية والأعضاء الداخلية ونقلها إلى DF 20 الجديد. متوسطة ، ثم تشريح لعزل المناطق الغنية بالعضلات.

الخطوة الثالثة من الإجراء هي تقسيم الأنسجة المعزولة إلى مكعبات 400 ميكرومتر. انقل الخطة المنفردة في مركز 60 بئرا من صفيحة 96 بئر واحتضانها عند 37 درجة مئوية. الخطوة الأخيرة من الإجراء هي تسجيل الخلايا.

ستبدأ الخلايا في الظهور من نبتة x ناجحة بين بضع ساعات أو ما يصل إلى أسبوعين ، وما بعد الانتهاء من التوسع اعتمادا على أصل الأنسجة. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر أن الخلايا التي بدأت في الظهور من خلايا X explan الناجحة يمكن توسيعها واستخدامها لاحقا لمجموعة من الأغراض المختلفة في المختبر وفي الجسم الحي ، بما في ذلك التكاثر وموت الخلايا المبرمج ، والدراسات وتحديد علامات البروتين. يمكن أيضا اشتقاق هذه الخلايا استنساخا ، وتعديلها وراثيا ، وزرعها في النهاية في مضيف لدراسة التجديد أو لاختبار التطبيقات العلاجية.

مرحبا ، أنا جانيت سميث من مختبري لبيولوجيا الخلايا الجذعية للعضلات الهيكلية كلية العلوم البيولوجية ، جامعة برمنغهام. أنا دين لانا من مختبر جانيت سميث وأنا بايرون تشين ، أيضا من مختبر جانيت سميث. سنعرض لك اليوم إجراء للحصول على مزارع الخلايا الجذعية العضلية الهيكلية من دهون Microdisect X التي تم الحصول عليها من العضلات والأجنة البالغة.

نستخدم هذا الإجراء في المختبر لدراسة سلوكيات الخلايا الجذعية العضلية الهيكلية مثل التكاثر وموت الخلايا المبرمج والتمايز ، بالإضافة إلى دراسة وظيفة الخلايا الجذعية العضلية الشاذة في أمراض مثل ضمور العضلات. لذلك دعونا نبدأ. تبدأ الطريقة الأساسية لاشتقاق ثقافات النثر الدقيقة من عضلات الهيكل العظمي بتشريح العضلات المستهدفة من فأر بارد حديثا في ظل ظروف معقمة.

في هذا العرض التوضيحي ، يتم تشريح عضلات الأطراف الخلفية ، وغسل العضلات المعزولة من خلال تغييرين من وسط DF 20 ثم وضعها في وسط DF 20 جديد في طبق 60 ملم. باستخدام مجهر تشريح ستيريو ، قم بتقطيع العضلات بعناية في ظل ظروف معقمة لاستبعاد الأنسجة الضامة الدهنية والعظام. بعد ذلك ، قم بتقطيع قطع العضلات النظيفة إلى مكعبات مكعبات 400 ميكرومتر باستخدام ملقط صائغ.

ضع قطع العضلات بشكل فردي في مركز 60 بئر من 96 لوحة بئر تحتوي على 50 ميكرولتر من DF 20 لكل املأ آبار ألتا جيدا بالمحلول الملحي لمنع جفاف الآبار التي تحتوي على explan. افحص الآبار تحت المجهر ثم ضع لوحة البئر 96 في حاضنة ثاني أكسيد الكربون 37 درجة مئوية 5٪.

يتم تسجيل التعلق والنتاج الجزئي بعد 24 إلى 48 ساعة من الحضانة وبعد ذلك على فترات 48 إلى 72 ساعة اعتمادا على معدل نمو العضلات التي يتم زراعتها. فيما يلي أمثلة على نمو اليوم الثاني من العضلات الهيكلية البالغة المزروعة سابقا ونمو الزرع السابق مع الثقافات المجمعة وكثافة الخلايا العالية. تم تسجيل X explant وفقا لمستوى التقاء الخلايا في كل بئر فردي ، والذي سيتم إثباته لاحقا لتوسيع وعزل خلايا SMS.

يجب مراقبة ثقافة النمو بشكل فردي للخلايا ذات مورفولوجيا الخلايا القصيرة في الغالب ، أي خلايا أحادية النواة كروية ذات انكسار عال والتي تنمو في مجموعات مجمعة. ابدأ هذا الإجراء بتشريح الأجنة E 12.5 من الرحم. يمكن أيضا تشريح أجنة المرحلة E 11.5 إلى E 17.5 بهذه الطريقة.

ضع الأجنة بشكل فردي في أطباق بتري التي تحتوي على PECM استعدادا للتشريح الدقيق التفصيلي. ثم يتم تشريح الأجنة الفردية لعزل المناطق الغنية بالعضلات الهيكلية. أولا ، قم بإزالة الأعضاء الداخلية ، وتشريح الجزء الخلفي من الذيل والأطراف الساقطة ، وكذلك جدران الجسم العلوية والسفلية.

ضع جميع الأنسجة المقطوعة في PECM الطازج لتعليق الجنين. تقوم الثقافات الدقيقة بتقسيم الأطراف الأربعة المقطعة والأطراف الخلفية وجدران الجسم العلوية والسفلية لإنتاج مكعبات صغيرة من الأنسجة متساوية الحجم. ضع هذه النباتات الدقيقة بشكل فردي في الوسط 60 بئرا من صفيحة 96 بئر تحتوي على 50 ميكرولترا من PECM لكل بئر.

يجب إنشاء ما لا يقل عن 60 بئرا تحتوي على نبتة x واحدة لكل بئر لكل جنين تمت دراسته لزراعة الأجنة. يمكن تقسيم مركز 60 بئرا إلى مناطق تشير إلى المكان الذي اشتق منه التخطيط. يسمح هذا التصميم ب 15 بئرا يحتوي كل منها على التوالي للأطراف والجدار العلوي للجسم والطرف الخلفي والجدار السفلي للجسم.

احتضان Explan explan عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ثلاثة أسابيع. خلال فترة الحضانة التي استمرت ثلاثة أسابيع ، يتم تسجيل explan في اليوم الثالث والسابع والرابع عشر والحادي والعشرين من الزراعة باستخدام مجهر مقلوب. يتم تسجيل Explan وفقا لمستوى التقاء الخلايا في كل فرد. حسنا.

هذا المثال المستويات المختلفة من التقاء الثقافات الجنينية الأولية E 15.5 الملطخة بالأسطورة خمسة صفر إلى 14٪ 15 إلى 24٪ 25 إلى 49٪ 50 إلى 74٪ و 75 إلى 100٪ يمكن أيضا التقاط صور فوتوغرافية للثقافات بمجرد أن تكون ثقافات COFLUENT X التي تعرض السمات المورفولوجية لخلايا SMS ثقافة فرعية. قم بإزالة وسط الاستزراع من الآبار المحددة وقم بتصفيته باستخدام قرص ACR 0.2 ميكرومتر. مرشح حقنة R.

الاحتفاظ بالوسيط للاستخدام مكيف لكل منهما. أضف جيدا 100 ميكرولتر من الأقراص المخففة من واحد إلى 10 في PECM. ثم أعد الطبق إلى حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.

بعد 20 دقيقة ، استخدم طرف ماصة لكشط الخلايا المفككة برفق من سطح البئر التالي ، وقم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 1000 مرة من الجاذبية لمدة ثلاث دقائق لحبيبات الخلايا. يتم تخفيف الخلايا عن طريق إعادة التشكيل ، وتعليقها في ملليلترين من PECM ثم نقلها إلى آبار صفيحة جديدة من 48 بئر. أخيرا ، انقل خليط الخلية إلى 48 لوحا جيدا لمزيد من التوسع.

لإعداد الخلايا لتحليل لوحة عرض الثقافة الفرعية ، مزارع Splunk الجنينية الأولية في PECM والوسط المكيف على زلات الغطاء في 48. يتم طلاء خلايا ألواح البئر بكثافة ثلاثة أضعاف 10 إلى ثلاث خلايا سنتيمتر مربع حاضنة 37 درجة مئوية للسماح للخلايا بالالتصاق ، والتي تستغرق عادة من أربع إلى ست ساعات لتقييم موت الخلايا المبرمج والانتشار. اغسل الخلايا الموجودة على الغطاء ، والزلات مرتين في PBS وثبتها في 4٪ من الفورمالديهايد لمدة 20 دقيقة من درجة حرارة الغرفة ، وبعد التثبيت ، اغسل الغطاء ينزلق لمدة 10 دقائق باستخدام PBS ، ثم قم بتلطيخ 10 ميكروغرام لكل مليلتر من DPI لمدة ثلاث دقائق.

لف الطبق بزلات غطاء غسيل من رقائق الألومنيوم مرة واحدة في PBS لمدة خمس إلى 10 دقائق. بعد ذلك ، قم بإزالة زلة الغطاء من البئر واقلبها على بقعة من أمة داكو سيتو. تغلق وسط التركيب على شريحة زجاجية حواف زلة الغطاء بورنيش الأظافر للتخزين.

لف الشرائح بورق القصدير وضعها على حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر للعد. يتم عرض الشرائح تحت التألق على مجهر عمودي ويتم تسجيلها للخلايا المبرمج والانقسامي باستخدام IP. عندما يتم زرع explan بعناية من العضلات الهيكلية البالغة أو من الأجنة ، فإنها ستبدأ في توليد الخلايا في غضون ساعات قليلة إلى 72 ساعة من الحضانة عند 37 درجة مئوية.

اعتمادا على مصدرها ، سيحدث توسع في عدد الخلايا على مدى أيام لزراعة الأجنة أو أسابيع لزراعة العضلات الهيكلية القديمة لتوليد ثقافات أولية عالية الكثافة لخلايا SMS ، يتم عرض النتائج التمثيلية للاشتقاق النسيلي الناجح لخلية SMS هنا. تصبح الخلية الواحدة المعزولة في صفيحة 96 بئر مستعمرة من أصل خلية واحدة تؤدي في النهاية إلى مجموعة نسيلة راسخة. يتم استخدام الكيمياء المناعية الخامسة MIF لاحقا للتحقق من هوية خلية SMS.

يتم زرع الخلايا الجذعية البالغة المشتقة من العضلات الهيكلية في العضلة الأمامية للفئران المضيفة ويتم تحديد هذه الخلايا عن طريق وضع العلامات بيتا GC في هذه الصورة التي تم التقاطها بعد ثلاثة أشهر من الحقن لوحظت ثلاث خلايا إيجابية من بيتا جالاكتو مدمجة مؤخرا ملطخة باللون الأزرق في ألياف عضلية بعد 14 شهرا من الحقن ويتم الكشف عن مساهمة واسعة من الخلايا الإيجابية btic galacto في ألياف العضلات بواسطة الجسم المضاد المضاد بيتا جالاكتو الملطخ باللون البني. يشار إلى خلية القمر الصناعي موجبة بيتا جالاكتو بالسهم الموجود في هذه الصورة. التلوين غائب في العنصر الضابط حيث لم يتم استخدام أي جسم مضاد أولي عند عزله من عضلات المضيف المحقونة بعد 12 شهرا من الحقن.

تكشف خلايا بيتا جالاكتو الإيجابية التي تتكاثر التنميط النووي للثقافة لخط خلية SMS النسيلي للفأر عن تعبير كروموسوم ثنائي الصبغيات الطبيعي مكمل بيتا جالاكتو في مستعمرة من خلايا PD خمسة صفر يظهر من خلال الكيمياء النسيجية في التحليلات المختبرية للأسطورة الجنينية الضمور تكشف خمسة أرومات عضلية إيجابية أن هذه الأرومات العضلية مفرطة التكاثر وعرضة لموت الخلايا المبرمج كما هو موضح في هذا الرسم البياني ، يزداد معدل نمو الخلايا العضلية الجنينية من ثقافة Muscle X explan في كل من MDX و CAV ثلاثة طفرات بالضربة القاضية عند مقارنتها بالنوع X البري. يظهر هنا مثال على MIF خمسة بقع مناعية. لوحظ فرط تكاثر الأرومات العضلية الجنينية في هذه الطفرات الثلاثة بالضربة القاضية MDX و CAV على النحو الذي يحدده النشاط المناعي الإيجابي KI 67.

بالإضافة إلى ذلك ، يحدث موت الخلايا المبرمج المرتفع في كل من هذه الطفرات كما هو موضح في تلطيخ DPI ، وتظهر هذه الصورة مثالا على خلية موت الخلايا المبرمج المشار إليها بالسهم. لقد أوضحنا لك للتو كيفية عزل الخلايا الجذعية للعضلات والهيكل العظمي من البالغين وتخطيط الجنين المجهري. عند القيام بهذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن تتوخى الحذر مع حجم النباتات الخارجية الدقيقة.

إذا كانت كبيرة جدا ، فسوف تصرخ وتموت الخلايا. إذا كانت صغيرة جدا ، فلن تدعم ذلك. نتيجة جيدة للمبيعات.

شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.