DiOLISTIC وصفها من الخلايا العصبية من القوارض والإنسان غير شرائح الدماغ الرئيسيات

اسمي جيل سيبل وأنا زميل ما بعد الدكتوراه في مختبر الدكتورة فيرونيكا ألفاريز في المعهد الوطني لتعاطي الكحول وإدمان الكحول. تم تنفيذ هذا العمل بالتعاون مع الدكتورة كاثلين جرانت وأندرو واو في مركز أوريغون للرئيسيات والدكتور جيمس دين في جامعة ويك فورست ، الذين قدموا أنسجة الرئيسيات غير البشرية المستخدمة في هذه الدراسة. الهدف من الإصلاح من هذا الإجراء هو إدخال الأصباغ الفلورية في الخلايا العصبية وتسمية أقسام الدماغ من أنواع مختلفة مثل القوارض والرئيسيات في أي عمر.

لغرض دراسة مورفولوجيا التشعبات والعمود الفقري المتغصن ، يتم تحقيق ذلك عن طريق طلاء Ts والخرز أولا بصبغة محبة للدهون مثل العين D. تتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في ربط الأنابيب بخرز مغلف بالعين D وتقطيعها إلى قطع صغيرة تعمل كرصاص لنظام مسدس الجينات Helios. الخطوة الثالثة من الإجراء هي إطلاق النار على الخرز المطلي بالعين D في شرائح الدماغ باستخدام مسدس الجينات.

الخطوة الأخيرة من الإجراء اختيارية حيث يمكن الجمع بين الأساليب والتلوين المناعي لتوطين العلامات الأخرى في نفس الوقت. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر علامات فلورية متناثرة للخلايا العصبية المناسبة للتصوير عالي الدقة ، مثل الفحص المجهري متحد البؤر أو الفوتون ، ودراسة التفرع الشجيري ومورفولوجيا العمود الفقري المتغصن. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على أساليبنا الحالية هي أنه يمكن تطبيق الأساليب على أقسام الدماغ من من جميع الأنواع والأعمار والأنماط الجينية.

يمكن استخدامه مع التلوين المناعي وينتج ملصقات فلورية متناثرة مناسبة للفحص المجهري عالي الدقة قبل صنع الرصاص. قم بتغطية حبات التنغستن بصبغة محبة للدهون في غطاء دخان كيميائي عند 450 ملليلتر من كلوريد الميثيلين إلى 13.5 ملليغرام من صبغة صبغة محبة للدهون للتركيز النهائي 30 ملليغرام لكل مليلتر. خذ أنبوبا واحدا قبل Eloqua يحتوي على 300 ملليغرام من حبات التنغستن وأضف 300 ميكرولتر من أنبوب كلوريد الميثيلين بقوة لإعادة تعليق الخرز وعمل محلول متجانس.

يتم استخدام 100 ملليغرام فقط من حبات التنغستن لكل مجموعة رصاصة ماصة لأعلى ولأسفل للحفاظ على تعليق الخرزات ، وإضافة 100 مل من الخرز وعين القالب المذاب على شريحة زجاجية وخلطها معا جيدا. باستخدام طرف ماصة ، اتركه يجف في الهواء تماما حتى يتحول لون الخرز إلى اللون الرمادي الفاتح. ضع قطعة نظيفة من الورق الأبيض المشمع أسفل الشريحة باستخدام شفرة متسابق نظيفة لكل لون من الرصاص ، اكشط الخرز من الزجاج ، وحركها وقم بتقطيعها إلى مسحوق ناعم.

اكشط الخرزات المطلية على ورق مصل اللبن وقم بتحويلها إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل. أضف ثلاثة ملليلتر من الماء وصوتنة في الحمام المائي لمدة 10 إلى 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتعطيل أي كتل تماما. قم بقص 0.7 متر من الأنابيب البط البري بزاوية على أحد طرفيها وقم بتوصيل الطرف الآخر بحقنة سعة 12 مليلتر باستخدام محول الأنابيب ، ضع الطرف الحر في أنبوب يحتوي على 10 ملليلتر من محلول البولي فينيل بيرون أو PVP 10 ملليغرام لكل مليلتر ، وارسم المحلول بالكامل من خلال الأنبوب وفي المحقنة.

دوامة محلول الخرزة أثناء الضخ مع المحقنة لعمل خليط متجانس يعمل بسرعة لتجنب ترسيب الخرز ، اسحب المحلول بالكامل في الأنبوب. تجنب إدخال أي فقاعات هواء ، والتي ستمنع الخرزات من الالتصاق بالأنبوب في تلك البقعة مع إمساك الأنبوب مشدودا من كلا الطرفين. قم بإمالته من جانب إلى آخر إلى بالتساوي.

توزيع الخرز. قم بتغذية الأنبوب في محطة الإعداد واترك الخرزات تستقر لمدة 30 إلى 60 ثانية. استخدم المحقنة ببطء ولكن بسلاسة.

قم بإزالة الماء تاركا الخرز وراءه. افصل المحقنة على الفور وابدأ في تدوير الأنبوب. اضبط تدفق النيتروجين في محطة التحضير على أربعة إلى خمسة لتر في الدقيقة جافة لمدة 10 إلى 20 دقيقة حتى تختفي قطرات الماء مرئية.

قم بإزالة الأنبوب من محطة الإعداد ، وقم بتقطيع الرصاص إلى أطوال 13 ملم مع ملاحظة قاطع الأنابيب ، وعلى الرصاص الجيد سيكون له ضباب رمادي باهت يغطي الداخل بشكل موحد. ضع الرصاصات في قوارير تلألؤ ملفوفة بورق الألمنيوم تحتوي على عامل تجفيف مثل كبريتات الكالسيوم اللامائية. قم بتخزينه في درجة حرارة الغرفة حتى يصبح جاهزا للتصوير.

يمكن استخدام Diic Labeling لتلطيخ الخلايا العصبية في أنسجة المخ من أنواع وأعمار متنوعة والحفاظ عليها باستخدام طرق مختلفة. ضع شرائح الدماغ التي تم إصلاحها إما قبل أو بعد تقطيعها في آبار 24. لوحة حسنا.

اغسل الشرائح في XPB S3 مرة واحدة لمدة خمس إلى 10 دقائق لكل غسلة. تستخدم الماصة من PBS فرشاة رسم لتوسيط الشريحة في البئر. ضع قطعة من مرشح 3.0 ميكرومتر بين شاشتي الانتشار المعدني في نهاية بطانة برميل مسدس الجينات.

أمسك مسدس الجينات بحيث تكون نهاية بطانة البرميل على بعد 1.5 سم من العينة. أطلق الخرزات في الشريحة بضغط غاز الهيليوم من 120 إلى 180 رطل لكل بوصة مربعة. اشطف الشرائح بسرعة ثلاث مرات باستخدام XPBS واحد لإزالة الصبغة الزائدة.

تأكد من إبقاء سطح اللقطة للشريحة متجها لأعلى أثناء جميع خطوات التعامل مع السائل. قم بتخزين الشرائح في PBS لمدة ثلاث إلى ست ساعات للسماح ل DAI بالانتشار على طول غطاء التشعبات بورق الألمنيوم. نظرا لأن داي حساس للضوء ، يمكن تركيب الشرائح في هذه المرحلة أو تعريضها لمزيد من التلوين بالأجسام المضادة كما هو مفصل في القسم التالي للمضي قدما في التلوين عند 300 إلى 500 ميكرولتر من محلول النفاذية الذي يحتوي على 0.01٪ TRITTON X 100 في XPBS واحد لكل شريحة ، احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة بالضبط.

قم بإزالة محلول النفاذية من الآبار ، وقم بحظر الشرائح في محلول يحتوي على 10٪ مصل الماعز و 0.01٪ تريتان × 100 في واحد XPBS يحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. أضف 300 إلى 500 ميكرولتر من الجسم المضاد الأولي المخفف في محلول مانع لكل منها. احتضن جيدا في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة إلى ساعتين أو طوال الليل ، اعتمادا على شرائح غسل الأجسام المضادة ثلاث مرات باستخدام XPBS لمدة خمس إلى 15 دقيقة لكل غسلة ، قم بإزالة المحلول من البئر.

أضف 300 إلى 500 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي المخفف في محلول مانع لكل منها. اغسل جيدا أربع مرات باستخدام XPBS لمدة خمس إلى 15 دقيقة لكل غسلة كما كان من قبل ، وقم بتركيب الشرائح على شريحة زجاجية مع وسيط تثبيت الفلورسنت وقم بتغطيتها ب 18 × 18 ملم. غطاء الغطاء يترك ليجف لمدة ست إلى 12 ساعة في درجة حرارة الغرفة قبل إغلاق الحواف بطلاء أظافر شفاف مخزن في الظلام أو مغطى عند أربع درجات مئوية.

عرض صور نموذجية لأقسام الدماغ المسماة هنا. هناك خاصيتان مهمتان يجب البحث عنهما هما نمط وضع العلامات المتناثر عند التكبير المنخفض والقدرة على تحديد المكونات الخلوية الفردية. يمكن أن يؤدي التحضير غير الصحيح للرصاص أو التثبيت المفرط للأنسجة إلى وضع العلامات السيئة كما هو موضح هنا.

يتم توفير نصائح استكشاف الأخطاء وإصلاحها في النص هنا. هناك صورة متحدة البؤر لخلية عصبية متوسطة TAL تدور من دماغ الفأر ونمطها المعقد من التفرع الشجيري. يسمح التقسيم البصري الذي تم تحقيقه عند استخدام الفحص المجهري متحد البؤر بعزل الخلايا المفردة في قسم الأنسجة.

تظهر صور التكبير العالية أجزاء من التغصنات من دماغ القوارض ودماغ الرئيسيات غير البشرية. لاحظ أن الكثافة العالية للتلطيخ الفلوري التي تم تحقيقها بهذه التقنية تؤدي إلى أشقاق شجيرية محددة جيدا عند الجمع بين ICS والتلوين المناعي. توضح هذه الصورة مثالا على تحديد موقع ملصقات العين D باللون الأحمر مع تلطيخ مناعي لتعبير GFP باللون الأخضر.

تتوافق هذه الصورة مع شريحة sal من فأر معدل وراثيا تعبر عن البروتين الفلوري GFP تحت محفز مستقبلات الدوبامين D واحد. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير الرصاص واستخدام مسدس Jing للخلايا العصبية ذات الصبغات الفلورية ذات الخطر المنخفض. تسمح هذه التقنية بالتصور الواضح لمورفولوجيا الخلايا العصبية ودراسة التفرع والعمود الفقري.