DiOLISTIC وصفها من الخلايا العصبية من القوارض والإنسان غير شرائح الدماغ الرئيسيات

اسمي غيل سيبيل، وأنا زميلة ما بعد الدكتوراه في مختبر الدكتورة فيرونيكا ألفاريز في المعهد الوطني لإساءة استخدام الكحول والإدمان. أُجري هذا العمل بالتعاون مع الدكتورة كاثلين غرانت وأندرو واو في مركز أوريغون للرئيسيات، والدكتور جيمس دين في جامعة ويك فورست، الذين وفروا أنسجة الرئيسيات غير البشرية المستخدمة في هذه الدراسة. الهدف العام من هذا الإجراء هو إدخال الأصباغ الفلورية في الخلايا العصبية ووسم مقاطع الدماغ من أنواع مختلفة مثل القوارض والرئيسيات من أي عمر.

من أجل دراسة مورفولوجيا التغصنات والأشواك التغصنية، يتم ذلك أولاً بطلاء Ts والخرز بصبغة محبة للدهون مثل D eye. وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في تبطين الأنابيب بالخرز المطلي بصبغة D eye ثم قطعها إلى قطع صغيرة تعمل كقذائف لنظام مسدس الجينات Helios. أما الخطوة الثالثة من الإجراء فهي إطلاق الخرز المطلي بصبغة D eye في شرائح الدماغ باستخدام مسدس الجينات.

تعتبر الخطوة النهائية من الإجراء اختيارية، حيث يمكن دمج تقنية stylistics مع التلوين المناعي لتحديد مواقع مؤشرات أخرى في آن واحد. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تظهر وسمًا فلوريًا متباعدًا للخلايا العصبية، وهو ما يكون مناسبًا للتصوير عالي الدقة، مثل المجهر البؤري أو مجهر الفوتونين، ودراسة تفرع الشجيرات العصبية ومورفولوجيا الأشواك الشجيرية. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بطرقنا الحالية في إمكانية تطبيق stylistics على مقاطع دماغية من حيوانات من جميع الأنواع والأعمار والأنماط الجينية.

يمكن استخدام هذه التقنية بالتزامن مع الصبغ المناعي، وهي تنتج وسمات فلورية متباعدة تكون مناسبة للمجهر عالي الدقة. قبل تحضير الكريات، تُطلى حبيبات التنجستن بالصبغة المحبة للدهون داخل خزانة استخلاص كيميائية، وذلك بإضافة 450 milliliters من كلوريد الميثيلين إلى 13.5 milligrams من الصبغة المحبة للدهون للوصول إلى تركيز نهائي قدره 30 milligrams per milliliter. يتم أخذ أنبوب Eloqua مجهز يحتوي على 300 milligrams من حبيبات التنجستن وإضافة 300 microliters من كلوريد الميثيلين، ثم تُنقل المادة بقوة لإعادة تعليق الحبيبات وتكوين محلول متجانس.

يتم استخدام 100 milligrams فقط من حبيبات التنجستن لكل مجموعة من الرصاصات؛ يتم سحب الحبيبات ووضعها عدة مرات (pipetting up and down) للحفاظ على تعليقها، ثم تُضاف 100 milliliters من الحبيبات والصبغة المذابة على شريحة زجاجية وتُمزج معاً جيداً. وباستخدام طرف ماصة، تُترك الشريحة لتجف تماماً في الهواء حتى يتحول لون الحبيبات إلى الرمادي الفاتح. توضع قطعة نظيفة من الورق الأبيض المشمع تحت الشريحة، وباستخدام شفرة حلاقة نظيفة، يتم كشط الحبيبات من الشريحة الزجاجية وسحقها لتحويلها إلى مسحوق ناعم لكل لون من ألوان الرصاصات.

قم بكشط الخرزات المطلية على ورقة مصل (whey paper) وانقلها عبر قمع إلى أنبوب مخروطي سعة 15 milliliter. أضف ثلاثة milliliter من الماء وعالجها بالسونيكاتور في حمام مائي لمدة تتراوح من 10 إلى 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتفكيك أي تكتلات تماماً. اقطع 0.7 meter من الأنابيب ذات اللون السماوي مع جعل أحد الطرفين بزاوية مائلة، ثم وصل الطرف الآخر بمحقنة سعة 12 milliliter باستخدام محول أنابيب، وضع الطرف الحر في أنبوب يحتوي على 10 milliliter من محلول polyvinyl perone أو PVP بتركيز 10 milligram per milliliter، ثم اسحب المحلول بالكامل عبر الأنبوب وصولاً إلى المحقنة.

قم برج محلول الخرز باستخدام جهاز المرج (Vortex) مع الضخ بواسطة السرنجة للحصول على خليط متجانس، واعمل بسرعة لتجنب ترسب الخرز، ثم اسحب المحلول بالكامل إلى داخل الأنبوب. تجنب إدخال أي فقاعات هواء، لأنها ستمنع الخرز من الالتصاق بالأنبوب في تلك النقطة، مع الحفاظ على الأنبوب مشدوداً من الطرفين. قم بإمالته من جانب إلى آخر لضمان التوزيع المتساوي.

قم بتوزيع الخرزات. أدخل الأنبوب في محطة التحضير واترك الخرزات تستقر لمدة تتراوح من 30 إلى 60 ثانية. استخدم المحقنة ببطء وسلاسة.

قم بإزالة الماء مع الإبقاء على الخرزات. افصل المحقنة فوراً وابدأ في تدوير الأنبوب. اضبط تدفق النيتروجين في محطة التحضير على 4 to 5 LPM جاف لمدة 10 to 20 دقيقة حتى لا تعود قطرات الماء مرئية.

قم بإزالة الأنابيب من محطة التحضير، وقطع الرصاصات إلى أطوال تبلغ 13 millimeter باستخدام قاطع الأنابيب الملاحظ، وستكون الرصاصات الجيدة مغطاة بطبقة ضبابية رمادية خفيفة بشكل منتظم من الداخل. ضع الرصاصات في عبوات وميضية ملفوفة بورق القصدير تحتوي على عامل تجفيف مثل كبريتات الكالسيوم اللامائية. تُحفظ في درجة حرارة الغرفة حتى يحين وقت الإطلاق.

يمكن استخدام وسم Diic لصبغ الخلايا العصبية في أنسجة الدماغ من أنواع وأعمار مختلفة والمحفوظة باستخدام طرق متنوعة. ضع شرائح الدماغ التي تم تثبيتها إما قبل أو بعد التقطيع في آبار طبق يحتوي على 24 بئراً.

اغسل الشرائح في محلول PBS مرة واحدة لثلاث مرات لمدة تتراوح بين 5 إلى 10 دقائق لكل غسلة. اسحب محلول PBS باستخدام الماصة، واستخدم فرشاة رسم لتوسيط الشريحة في البئر. ضع قطعة من مرشح بقطر 3.0 micrometer بين شاشتي الانتشار المعدنيتين عند نهاية بطانة ماسورة مسدس الجينات.

أمسك مسدس الجينات بحيث تكون نهاية بطانة الفوهة على بعد 1.5 سنتيمتر من العينة. اطلق الحبيبات داخل الشريحة باستخدام ضغط غاز هيليوم يتراوح بين 120 و180 PSI. اشطف الشرائح بسرعة ثلاث مرات باستخدام 1X PBS لإزالة الصبغة الزائدة.

تأكد من إبقاء سطح القطاع الذي تم إطلاق الأشعة عليه مواجهاً للأعلى خلال جميع خطوات التعامل مع السوائل. تُحفظ القطاعات في PBS لمدة تتراوح من ثلاث إلى ست ساعات للسماح لـ DAI بالانتشار على طول الزوائد الشجرية مع التغطية برقائق الألومنيوم. وبما أن DAI حساس للضوء، يمكن تثبيت القطاعات في هذه المرحلة أو إخضاعها لمزيد من الصبغ بالأجسام المضادة كما هو مفصل في القسم التالي؛ للمتابعة في عملية الصبغ، يُضاف من 300 إلى 500 µL من محلول النفاذية الذي يحتوي على 0.01% TRITTON X 100 في 1x PBS إلى كل قطاع، وتُحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة بالضبط.

قم بإزالة محلول النفاذية من الآبار، ثم قم بحجب الشرائح في محلول يحتوي على 10% goat serum و 0.01% tritan X 100 في 1x PBS، واتركها لتحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. أضف من 300 إلى 500 µL من الأجسام المضادة الأولية المخففة في محلول الحجب إلى كل بئر، واتركها لتحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة تتراوح من ساعة إلى ساعتين أو طوال الليل، وذلك حسب نوع الجسم المضاد. اغسل الشرائح ثلاث مرات باستخدام 1x PBS لمدة تتراوح من 5 إلى 15 دقيقة لكل غسلة، ثم قم بإزالة المحلول من البئر.

أضف من 300 إلى 500 µL من الجسم المضاد الثانوي المخفف في محلول الحجب إلى كل بئر. اغسل أربع مرات باستخدام XPBS لمدة تتراوح من 5 إلى 15 دقيقة لكل غسلة كما سبق، ثم ثبّت الشرائح على شريحة زجاجية باستخدام وسط تثبيت فلوري وغطّها بغطاء شريحة مقاس 18 × 18 mm. اتركها لتجف لمدة تتراوح من 6 إلى 12 ساعة في درجة حرارة الغرفة قبل سد الحواف بطلاء أظافر شفاف، ثم تُحفظ في الظلام أو مغطاة عند درجة حرارة 4 °C.

تظهر هنا صور نموذجية لمقاطع دماغية موسومة. ومن الخصائص الهامة التي يجب البحث عنها وجود نمط توسيم متباعد عند التكبير المنخفض، والقدرة على تحديد المكونات الخلوية الفردية. يمكن أن يؤدي التحضير غير الصحيح للـ bullets أو التثبيت المفرط للأنسجة إلى توسيم رديء كما هو موضح هنا.

يتم توفير نصائح لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها في النص هنا. توجد صورة مجهرية بؤرية لعصبون شوكي في وسط TAL من دماغ فأر ونمط معقد من التفرعات الشجيرية الخاصة به. إن التقسيم البصري الذي يتم تحقيقه عند استخدام المجهر البؤري يسمح بعزل الخلايا المحددة المنفردة في المقطع النسيجي.

تظهر صور ذات تكبير عالٍ قطعاً من التغصنات من دماغ قارض ودماغ رئيسيات غير بشرية. لاحظ الكثافة العالية للتلوين الفلوري التي تم تحقيقها باستخدام هذه التقنية، مما أدى إلى ظهور أشواك تغصنية محددة جيداً عند دمج تقنية ICS مع التلوين المناعي. تظهر هذه الصورة مثالاً على التموضع المشترك لوسم D eye باللون الأحمر مع التلوين المناعي للتعبير عن GFP باللون الأخضر.

تتوافق هذه الصورة مع شريحة من منطقة SAL لفأر معدل وراثياً يعبر عن البروتين الفلوري GFP تحت محفز مستقبل الدوبامين D1. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير الحبيبات واستخدام مسدس جينج (Jing gun) لوسم الخلايا العصبية بشكل متفرق باستخدام الأصباغ الفلورية. تتيح هذه التقنية التصوير الواضح لمورفولوجيا الخلايا العصبية ودراسة تفرعات الشجيرات والنتوءات الشوكية.