شارك في نماذج من الثقافة الزائفة الزنجارية الأغشية الحيوية نمت على خلايا حية إيرواي الإنسان

هذه الورقة توضح أساليب مختلفة من النمو

الهدف العام من هذا الإجراء هو زراعة الأغشية الحيوية الهوائية الكاذبة على السطح القمي للخلايا الظهارية لمجرى الهواء البشري الحي. يتم تحقيق ذلك عن طريق إنشاء طبقة أحادية التقاء من الخلايا الظهارية لمجرى الهواء على سطح بلاستيكي أو زلة غطاء زجاجي. الخطوة الثانية من الإجراء هي زراعة ثقافة بكتيريا p الهوائية بشكل أساسي ، معبرة عن بروتين الفلورسنت الأخضر.

الخطوة التالية هي وضع البكتيريا وخلايا مجرى الهواء على اتصال ببعضها البعض إما في بيئة ثابتة أو في غرفة تدفق. تتمثل الخطوة الأخيرة من الإجراء في السماح للأغشية الحيوية البكتيرية بالتطور بمرور الوقت أثناء تقييم صلاحية خلايا مجرى الهواء. يمكن الحصول على نتائج تظهر تكوين الأغشية الحيوية على خلايا مجرى الهواء الحية من خلال الفحص المجهري الفلوري.

يمتد تأثير هذه التقنية إلى علاج مرضى التليف الكيسي لأنه يمكن استخدام نماذج الزراعة المشتركة هذه لتطوير والتحقق من صحة أنظمة المضادات الحيوية الجديدة ، القادرة على القضاء على الأغشية الحيوية المسؤولة عن الاستعمار المزمن للممرات الهوائية. في مرضى التليف الكيسي ، يستخدم نموذج الأغشية الحيوية للزراعة المشتركة الثابتة خلايا CFBE ، وهي مجرى هوائي بشري خالد. تطورت الخلايا الظهارية في الأصل من فرد مصاب بالتليف الكيسي قبل سبعة إلى 10 أيام من تلقيح البكتيريا بذرة خلايا CFBE في صفيحة زراعة أنسجة 24 جيدا.

نقوم بزرع الخلايا بتركيز مرتين في 10 إلى الخلايا الخامسة لكل بئر في 0.5 مل من الحد الأدنى من الوسط الأساسي أو MEM المكمل بنسبة 10٪ مصل الأبقار الجنيني اثنين من المليمولار L-glutamine و 50 وحدة لكل مليلتر والبنسلين و 50 ميكروغرام لكل مليلتر. ينمو الستربتومايسين الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. 95٪ هواء لمدة سبعة إلى 10 أيام يغير الوسيط كل يومين إلى ثلاثة أيام.

ستؤدي هذه الظروف إلى تكوين تقاطعات ملتقية وأحادية الطبقة وضيقة قبل يوم واحد من التجربة. تلقيح ثقافة LB سعة خمسة ملليلتر باستخدام بييرو جين من مخزون مجمد وتنمو لمدة 18 ساعة عند 37 درجة مئوية على دوار. عند 200 دورة في الدقيقة ، نستخدم p aerogen الذي يحمل بلازميد PSMC 21 للتعبير التأسيسي عن GFP في يوم التلقيح البكتيري.

قم بإزالة الوسط من خلايا CFPE وأضف حجما متساويا من وسط الفحص المجهري ، وهو MEM بدون فينول أحمر ، مكملا باثنين من مللي مولار L-glutamine تلقيح التقاء ، طبقات أحادية CFBE مع posa في تعدد العدوى حوالي 30 إلى واحد بالنسبة لعدد خلايا CFBE التي تم زرعها في الأصل للوحة 24 بئر. هذا يعادل 1.2 في 10 من CFU السابع لكل مليلتر في 0.5 ملليلتر من MEM لكل احتضان اللوحة جيدا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون ، 95٪ هواء لمدة ساعة واحدة.

بعد الحضانة لمدة ساعة واحدة ، قم بإزالة snat واستبدلها بفحص مجهري جديد. متوسط مكمل بنسبة 0.4٪ أرجينين. تؤدي إضافة الأرجينين إلى تأخير تدمير الطبقة الأحادية لفترة كافية لتشكل الأغشية الحيوية على خلايا CFPE.

احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون ، 95٪ هواء لنقاط زمنية مختلفة تصل إلى ثماني ساعات تقريبا كل ساعتين. تحليل سلامة الطبقة الأحادية CFBE ونمو الأغشية الحيوية باستخدام الفحص المجهري. يتطلب نموذج الأغشية الحيوية للزراعة المشتركة لخلية التدفق تكوين طبقة أحادية متجمعة من خلايا CFBE على زلة غطاء زجاجي قطرها 40 ملم.

لتحقيق ذلك ، ضع غطاء معقم في طبق بلاستيكي معقم بقطر 60 ملم. ثم أضف ثلاثة ملليلتر من نمو الخلايا الدافئة ، والضغط المتوسط على زلة الغطاء بطرف الماصة لإزالة أي فقاعات محاصرة تحتها ، وإجبار الغطاء على الانزلاق إلى قاع بذرة الطبق البلاستيكي ، مرتين 10 إلى خلايا CFBE السادسة لكل طبق. رج الطبق برفق ذهابا وإيابا ، لكن تجنب الدوران لمنع الطرد المركزي للخلايا على جوانب الطبق.

ضع الطبق في حاضنة هواء بنسبة 5٪ من ثاني أكسيد الكربون و 95٪ عند 37 درجة مئوية لمدة ثمانية إلى 10 أيام. قم بتغذية الخلايا كل يومين بثلاثة ملليلتر من وسط النمو الطازج. في ظل هذه الظروف ، ستشكل الخلايا طبقة أحادية متجمعة على زلة الغطاء الزجاجي.

الخطوة التالية هي تحضير السلالة البكتيرية الهوائية P قبل يوم واحد من التجربة. تنمو p aerogen في خمسة ملليلتر من LB لمدة 18 ساعة عند 37 درجة مئوية على المدور. عند 200 دورة في الدقيقة ، نستخدم سلالة هوائية P ، PO one ، تحمل بلازميد PSM C 21 للتعبير التأسيسي عن GFP في يوم التجربة.

عند مليلتر واحد من الثقافة البكتيرية في أنبوب طرد مركزي دقيق معقم وجهاز طرد مركزي عند 6 ، 000 دورة في الدقيقة لمدة ثلاث دقائق. اغسل الحبيبات البكتيرية مرتين في ملليلتر واحد من الفحص المجهري. متوسط مخفف 0.5 ملليلتر من البكتيريا المغسولة والمعلقة إلى 4.5 ملليلتر من وسط الفحص المجهري لتحقيق تركيز حوالي خمسة أضعاف 10 من الثامن CFUs لكل مليلتر.

نحن الآن على استعداد لمراقبة خلايا CFPE في الوقت الفعلي ، الأمر الذي يتطلب غرفة تصوير مقترنة بمضخة تمعجية لضمان تدفق العناصر الغذائية لفترات طويلة من الزمن. وجهاز تحكم في درجة الحرارة ، نستخدم جهاز خلية تدفق الأغشية الحيوية القياسي. تم تعديل غرفتين للتكنولوجيا الحيوية FCS لاستيعاب خلايا CFPE.

واحدة من أهم الخطوات في نموذج الأغشية الحيوية للزراعة المشتركة لخلية التدفق هي تجميع الغرفة دون الإضرار بشاشة الخلية لتجميع الغرفة. أمسك النصف العلوي من الغرفة رأسا على عقب بحيث تكون أنابيب التروية مرئية وقم بمحاذاة فتحات الخلوص لحشية مطاطية بسمك 0.75 ملم على أنابيب التروية. قم بتكديس شريحة القناة الصغيرة المرفقة بالغرفة أعلى الحشية المطاطية ، مع التأكد من أن الجانب المحزز لأعلى.

ثم ضع حشية مطاطية أخرى أعلى الشريحة. سيحدد سمك هذه الحشية الثانية وهندستها الداخلية حجم الغرفة. بعد ذلك ، أضف ملليلترا واحدا من وسط الفحص المجهري الدافئ في وسط الشريحة.

ضع غرفة التصوير على سطح معقم أثناء استرداد خلايا CFPE من حاضنة زراعة الخلايا. قم بإزالة الوسط المستهلك من الطبق واغسل خلايا CFPE مرة واحدة بثلاثة ملليلتر من وسط الفحص المجهري الدافئ. باستخدام ملقط مغسول بالإيثانول.

استرجع زلة الغطاء من الطبق وخفضها رأسا على عقب على حبة وسط الفحص المجهري الموضوعة على الغرفة. ترتكز زلة الغطاء الآن على الحشية المطاطية الثانية والطبقة الأحادية لخلايا مجرى الهواء متجهة لأسفل. أمسك المكونات المجمعة بيد واحدة ، ضع قاعدة الغرفة أعلى المكدس واقلب الغرفة بسرعة بحيث يكون كل شيء على الجانب الأيمن لأعلى.

قفل القاعدة في مكانها عن طريق تدوير الحلقة. قم بتوصيل أنبوب المدخل بمضخة التروية الدقيقة منخفضة التدفق. قطعة ثانية من الأنابيب ، تربط المضخة بطبقة من وسط الفحص المجهري الموضوعة في حمام مائي 37 درجة مئوية.

تقع بجوار المجهر مباشرة. ابدأ التدفق بمعدل 20 مل في الساعة. معدل التدفق هذا ضمن قدرة سرعة السباحة للبوسا.

قم بتوصيل أنبوب CFL المعقم 16 بأنابيب التروية الداخلية والمخرج للغرفة ، ثم قم بتوصيل جهاز التحكم في درجة الحرارة. ضع الغرفة المجمعة على مرحلة المجهر في المجهر الفلوري المقلوب. باستخدام حقنة واحدة مليلتر يمكن التخلص منها.

بحقن المعلق البكتيري المعد مسبقا في الغرفة باستخدام صمام ثنائي الاتجاه يوضع في خط بين المضخة والغرفة للسماح للبكتيريا بالالتصاق بخلايا مجرى الهواء. أوقف المضخة لمدة ساعتين. بعد ساعتين ، يمكن إعادة تشغيل التدفق والحفاظ عليه بسرعة 20 مل في الساعة.

بالنسبة لبقية التجربة ، راقب سلامة خلايا مجرى الهواء عن طريق التداخل التفاضلي. الفحص المجهري المتباين طوال التجربة للتحقق من علامات تلف الطبقة الأحادية. في نفس الوقت ، تابع تطوير الأغشية الحيوية الهوائية p المسماة GFP على السطح القمي لخلايا مجرى الهواء.

من خلال الحصول على صور باستخدام مجهر مضان متحد البؤر أو واسع المجال مقلوب في كل من فحوصات الخلية الثابتة والخلية المتدفقة ، وجد أن الطبقة الأحادية CFPE يمكن أن تتحمل وجود p aerogen لمدة تصل إلى ثماني ساعات بعد التلقيح دون أي علامة على التغيير. يمكن تقييم سلامة الطبقة أحادية الظهارة عن طريق الفحص المجهري لتباين الطور باستخدام مقلوب كما هو موضح في هذا المثال لطبقة أحادية التقاء من خلايا CFPE المزروعة على ألواح زراعة الأنسجة. بمرور الوقت ، سوف ينتج p aerogen السموم وعوامل الفوعة التي يمكن أن تلحق الضرر بطبقة أحادية الخلية الظهارية بالكامل أو في أقسام.

في هذا المثال من طبقة أحادية CFPE مخترقة ، تظهر بكتيريا الهواء P الموضحة باللون الأخضر وهي تنتشر بين التقاطعات الضيقة للخلايا الظهارية والوصول إلى الأغشية القاعدية الجانبية. عادة لا يتحقق تكوين الأغشية الحيوية في ظل هذه الظروف بسبب تدهور الطبقة الأحادية. تظهر هذه الصورة غشاء حيوي متضخم من p aerogen لوحظ بعد 24 ساعة من التلقيح بعد دعم تكوين الأغشية الحيوية بنجاح.

تضررت الطبقة الأحادية CFPE بشكل لا يمكن إصلاحه وهي الآن غائبة تقريبا. يظهر الأغشية الحيوية المتبقية التي تنمو كطبقة مسطحة من البكتيريا متصلة بزلة الغطاء الزجاجي. عندما لا يتم المساس بسلامة الطبقة الأحادية لمجرى الهواء.

يمكن أن تتشكل الأغشية الحيوية الهوائية P وتتطور بنجاح على السطح القمي لخلايا مجرى الهواء في كلا نموذجي الزراعة المشتركة. تظهر هنا صورة تمثيلية ل GFP تعبر عن الأغشية الحيوية الهوائية p المزروعة على طبقة أحادية التقاء من خلايا CFPE باستخدام نموذج الأغشية الحيوية للزراعة المشتركة الثابتة التي تم تقييمها بواسطة الفحص المجهري الفلوري epi. الصورة عبارة عن تراكب لقناة تباين الوجه وقناة التألق.

تظهر هذه الصورة التالية GFP المسمى p aerogen. نمت الأغشية الحيوية لمدة ست ساعات على طبقة أحادية ملتصقة من خلايا CFBE باستخدام نموذج الأغشية الحيوية للزراعة المشتركة لخلية التدفق لتسهيل تصور مجرى الهواء. تم تلطيخ النوى أحادية الطبقة ب HEXT 3 33 42 قبل التلقيح بالبوسا وتظهر باللون الأزرق.

تنتشر الأفلام التي تظهر على شكل كتل خضراء متصلة بالسطح القمي لخلايا CFPE عبر خلايا مجرى الهواء. يتم عرض الهياكل النموذجية الشبيهة بالفطر للأغشية الحيوية الهوائية التي تتشكل على طبقة أحادية لخلية A-C-F-P-E بعد إعادة البناء ثلاثية الأبعاد هنا. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية نمو الأغشية الحيوية البكتيرية بنجاح وتصورها على طبقة أحادية من خلايا مجرى الهواء باستخدام نماذج الزراعة المشتركة الموضحة هنا ، إلى جانب الطرق الميكروبيولوجية القياسية والفحص المجهري الفلوري.