Microinjection الجنين بعوض ألف الحصول على البعوض المعدلة وراثيا

أنا أنت. أنا أعمل في Anton James'lab. سأوضح لكم اليوم كيفية القيام بالحقن المجهري في أجنة ADIs Egypt بغرض الحصول على البعوض المعدل وراثيا.

للحصول على الأجنة للحقن الدقيقة ، نحتاج إلى تغذية الإناث بالدم. من المفترض أن يتم إطعام الإناث يوم الخميس. إذا كنت ترغب في القيام بالحقن المجهري من الاثنين إلى الجمعة ، فهذا أيضا حقير.

آخذ القطن وأضع الماء وأسكبه. من المفترض أن يكون القطن مبللا ويأخذ دائرة بيضاء بطول ثلاثة ملم ، ويوضع في الأعلى ويدفع لأسفل. وأحتاج إلى صب الماء وتنظيف السقف والمناديل وإغلاقه بالقطن.

هذا جاهز الآن سأجمع ست إناث 10 إناث وأنقل الإناث إلى الانسحاب لفترة قصيرة وسأضعهن في ظروف مظلمة وأضعهن في الغرفة التي تحتوي على 27 درجة مئوية لمدة ساعة و 15 دقيقة. أنا أصنع إبر للحقن الدقيق باستخدام الإبر الزجاجية ونستخدم شركة أدوات المكوك القطبية والنموذج P 87. أضع إبرة زجاجية في الحلقة وأصلح من كلا الجانبين.

أغلق الغطاء وادفع إبرة السحب حمراء. الآن سأوضح لك كيفية القيام بذلك وصلة الإبر. يتم إغلاق الإبر بعد السحب ونحتاج إلى إعادة فتح الإبر.

هناك طريقتان للقيام بذلك. إحدى الطرق هي أن تكون رابطا وطريقة أخرى فقط لمس الجنين قبل الحقن. حسنا ، هذه هي طريقة لين.

لدي الإبرة وأصلح هذه الإبرة هنا. هنا un فوق الحافة التي لا يمكننا استخدامها للحقن الدقيق. هذه النصيحة للحقن الدقيق ، نحتاج إلى طرف مفتوح.

هذه هي العجلة. أحاول لمس سطح العجلة بالإبرة ويجب أن تلمس أطراف الإبرة سطح العجلة. عندما يلمس الطرف السطح ، عليك أن تضع العجلة.

هنا يمكنك أن ترى أن الإبرة جاهزة للحقن المجهري. طرف الإبرة هو ويمكنك أن ترى أن الطرف لامع. هذا يعني أن الإبرة مفتوحة وجاهزة للحقن المجهري.

تذكر أنه يجب كسر نهاية الأنبوب فقط. إذا قمت بعمل ثقب كبير ، فإن الإبرة ليست جيدة. يجب أن تكون الحفرة صغيرة جدا.

مرت ساعة و 15 دقيقة ويجب أن تكون الأجنة جاهزة للحقن الدقيق الذي آخذه من الغرفة. خذ بعض الوقت ويمكنك رؤية الأجنة ، جرعة سوداء على الورق والآن أقوم بنقل الإناث إلى القفص. فقط دعهم يطيرون.

الآن سأريكم الأدوات التي سأستخدمها لمحاذاة أجنة. هذه القوى التي أستخدمها لأخذ ورق X من البرية. هذه القوى التي أستخدمها للقيام بخط الجنين.

قيصر ، نحتاج إلى قطع شريط لاصق مزدوج وهذه القوى التي أستخدمها لإخراج البيض بعد الحقن الدقيق. هذه هي زلة الغطاء. إلى هذه الغطاء قسيمة.

أرفق شريطا مزدوجا لالتقاط الأجنة من ورق واتمان. الآن سأقوم بمحاذاة الأجنة. أول ما أقوم بأخذ ورقة X من الوقت.

عليك أن تتذكر أن الورق طوال الوقت يجب أن يكون مبللا. سأقوم بربط الأجنة من الرمادي إلى الرمادي الداكن. هذه مرحلة جيدة للحقن.

لا تأخذ الأجنة البيضاء والسوداء ، يجب أن تكون جميع الأجنة في نفس الاتجاه. لدينا قطبان ، أونتاريو والملصق الذي سنقوم بحقنه في Posterial.End. جانب أونتاريو واسع قليلا من الجانب الخلفي.

هذه هي زلة الغطاء. سأقوم بإعداد زلة غطاء جاهزة لالتقاط الأجنة. لهذا ، أحتاج إلى شريط لاصق مزدوج متصل بالغطاء.

الانزلاق والقطع والأعمار وانزلاق الغطاء جاهز. في الوقت الحالي أحتاج إلى تجفيف ورق X جيدا لأنه إذا كانت الأجنة مبللة ، فإنها لا تلتصق أبدا بالشريط. لهذا ، أنا أستخدم MV المجانية الجافة ، والآن أقوم بأخذ زلة الغطاء وشريط شريحة لحم مزدوج وأضغط على الأجنة قليلا جدا.

ولدي أجنة على قسيمة الغلاف. والآن هي هذه الخطوة المنفصلة. يجب أن تنتظر خطوة التقطيع هذه في الغالب في هذا الموقف حوالي دقيقة واحدة ربما.

لكن عليك أن تنظر بالمجهر ويمكنك أن ترى البيض يبدأ في الانكماش. هذه الأجنة مجففة. يمكنك رؤية الدمامل وعندما ترى هذه الدمامل عليك وضع الزيت على الفور والتوقف عن الجفاف.

عندما تجف الأجنة ، عليك وضع الزيت على الفور. الجنين جاهز للحقن المجهري وسأضع أجنة الخط على المسرح وسأملأ الإبر والحمض النووي لهذا الغرض. أنا أستخدم أنبوب الإلحاق وإبرة التحميل أيضا من الملحق من هنا.

وأنا آخذ الحمض النووي الخاص بي مع أخذ 1.5 ميكرولتر. حسنا ، وقم بالتحميل والإبرة وأنا بتثبيت الإبرة على الحامل. والهول متصل بالحاقن الصغير.

نحن نستخدم حاقن einor الصغير ، والذي يطلق على Femto jet. الآن أنا مستعد لحقن الأجنة. بالنسبة لهذه الأوراق ، نستخدم ضغط الحقن 600 الضغط الخلفي 250 والوقت يدوي.

في الوقت الحالي أرى أجنة مثالية جدا في المجهر. وبعد ذلك أقوم بتحريك الإبرة وأيضا يجب أن أرى بشكل مثالي للغاية وأركز الإبرة في المجهر. بعد ذلك ، أعدت الأجنة ويمكنني رؤية الأجنة والإبرة في نفس المجال.

والآن نعلق إبرة بالقرب من الطرف الخلفي للأجنة. وأنا أقوم بالحقن في الطرف الخلفي من الأجنة. وأولا ما أفعله، أولا يجب أن أرى أجنة واضحة جدا في المجهر.

أتحرك مرحلة المجهر وأرى دائما أين لا تتحرك الإبرة. حقن جيد. الحقن المثالي.

عندما ترى الطرف الخلفي وتصل إلى إبرة ، المس الجزء الخلفي وتخترقه ولا يمكنك رؤية أي تقلص في X ، أي تقلص من هذا القبيل. إذا كنت تفعل ذلك ، فهذا ليس جيدا جدا. ولكن إذا كان x لا يزال في وضع مثل هذا واخترقت الإبرة ، فهذا يعني أن إبرتك جيدة جدا والحقن جيد جدا.

بعد الحقن المجهري ، أحتاج إلى نقل EMREs في الظروف الرطبة. لهذا ، أستخدم غرفة بلاستيكية مع قطن مبلل في الأسفل وورق مبلل. أضع هذا على القطن وتأكد من أن هذه الورقة مبللة.

هذا جاهز. أنا آخذ قوتي. أنا أقوم بتعليم الأجنة تحت الزيت وأضعها على الحائط على الورق.

من فضلك لا تضع القاع لأن الزيت يجب أن ينزل من الجنين وأنا ، سآخذ 2 ، 3 ، 5 أجنة في وقت واحد أو واحد ، لا بأس أيضا. الآن سأقوم بإعداد الأجنة لتكون جاهزة للحشرات. لهذا أنا آخذ مسحة الأقارب ، وتغطية الأجنة وإصلاحها بالمطاط.

وهذا جاهز للحشرات لمدة خمسة أيام. بعد ذلك ، نبقى في التفتيش لمدة خمسة أيام وبعد ذلك سنفقس بالجنين ، إيه ، ونحصل على الجينات المعدلة وراثيا. أنا الآن في العلاج بالصدمات الكهربائية وسأوضح لك كيفية تفقيس الأجنة.

وأول مرة سأسكب الماء في الغرفة البلاستيكية وأضيف الطعام. قطرات زوجين ، خذ الأجنة ، التي تبقى في طعام داخل القطاع خمسة أيام. خذ ورق البيض ، وقم بعمل ثقب صغير وضع الأجنة لأسفل.

هذا هو. تبدأ الأجنة في الفقس بعد الأول في الأسبوع الأول. وأيضا تبدأ بعض الأجنة في الفقس بعد أربعة أسابيع.

ولدينا دائما في الرملية ، مراحل مختلفة من اليرقة و pu ، لدي فقط أوضح لك كيفية القيام بالحقن المجهري في أجنة dete. وأريد أن أقول إن ثلاث خطوات مهمة جدا في هذا الإجراء. عليك أن تصنع إبر جيدة جدا.

عليك التقاط الأجنة في المرحلة الصحيحة. يجب أن يتم التخلي أيضا بدقة شديدة ، وليس كثيرا. في غضون أربعة أسابيع تقريبا سيكون لدينا بعوض معدل وراثيا.