Name: عزل الخلايا الجذعية من شبكية العين بالعين ماوس (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-11T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: تعلم عزل الخلايا الجذعية الشبكية من الظهارة الهدبية لعين الفأر واستنباتها لتشكيل كرات شبكية استنساخية. تُظهر هذه الخلايا خصائص جذعية مثل التجديد الذاتي والتعدد القدرة.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نشكر لورا كلارك لتقديم المساعدة لها لا تقدر بثمن. ويدعم هذا العمل NCE : الجذعية شبكة الخليوي ، والمعاهد الوطنية للصحة CIHR.

1. إعداد حلول تشريح وحلول أنزيم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل السائل الشوكي الدماغي الاصطناعي (ACSF) وسائل الاعلام المصل خالية في وقت سابق والثلاجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزن خارج حمض Kynurenic (0.2 ملغ / مل) ، وتذوب في 10 مل من ACSF هيلو في بالحمام المائي 37 درجة مئوية في وقت مبكر لأنها لا تذوب بسهولة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزن خارج التربسين (1.33 ملغ / مل) وهيالورونيداز (0.67 ملغ / مل) ووضعه في أنبوب واحد 15 مليلتر وابقائه في -20 درجة مئوية لحين الحاجة إليها. إضافة محلول حمض Kynurenic لهذا الأنبوب والتصفية باستخدام حقنة 22 ميكرون فلتر فقط قبل استخدامه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزن خارج التربسين المانع (Ovamucoid : 1 ملغ / مل) ، وتذوب في وسائل الإعلام المصل خالية من الدفء والتصفية باستخدام محقنة 22μm التصفية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل وسائل الإعلام الطلاء : مصل خالية تحتوي على وسائل الإعلام FGF2 (10 نانوغرام / مل) والهيبارين (2 ميكروغرام / مل). </li></ol> 2. عزل الخلايا الجذعية من شبكية العين بالعين ماوس <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تنفيذ عزل الخلايا الجذعية الشبكية في غرفة معقمة محددة مكرسة لثقافة التجارب الأولية. قبل البدء في هذا الإجراء ، وإعداد مجهر تشريح ومصدر ضوء الباردة ، ومن ثم وضع الأدوات المعقمة تشريح. كل غطاء لديه معقم الساخنة حبة لتعقيم الأدوات بين الخطوات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سنقوم عزل الخلايا الجذعية من أعين الشبكية التي تم وضعها على الفور في طبق بتري معقمة تحتوي على السائل الشوكي الدماغي الاصطناعي (ACSF) بعد إزالتها من الفئران التضحية الحيوانية وافق وفقا لأخلاقيات البروتوكولات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح تحت المجهر ، وتنظيف العين مع ملقط : تخلص من الشعر والنسيج الضام الذي تعلق على القرنية / الحدود الصلبة. ثم نقل العين إلى صحن جديد مع ACSF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بينما يمسك بلطف على العين ثابت مع ملقط مسنن ، واستخدام الزاوية الصغيرة تشريح المقص لإزالة عضلات العين. إزالة العصب البصري وكذلك إذا كان لا تزال تعلق على العين. ليس محاولة لإسحق العين أثناء هذه العملية. نقل عينيه على طبق جديد مع ACSF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام المقبل منحني الدقيقة تشريح مقص لقطع في نصف العين : تبدأ في العصب البصري وقطع طريق وسط القرنية ، الاجتماع مرة أخرى في العصب البصري حيث بدأ الخفض. وهو مثالي إذا قطعتين من العين هي ما يعادل تقريبا في الحجم لأن ذلك سوف يجعل الخطوة التالية أسهل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عقد القرنيات باستخدام اثنين من الملقط ، بلطف قشر العين نصفين منفصلين. إزالة والتخلص من العدسة ، والأحشاء ، والعصبية للشبكية العين من القذائف. نقل القذائف على طبق جديد مع ACSF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الآن نحن على استعداد لعزل ظهارة الهدبية. لتبدأ ، توجيه قذيفة العين بحيث القرنية على يمينك والشبكية الصباغي الطلائية (RPE) هو على اليسار. دبوس برفق قذيفة أسفل العين مع ملقط على التوالي على الجانب RPE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المقبل ، واستخدام مشرط لقطع القرنية والقزحية بعيدا عن ظهارة الهدبية للعين عن طريق دفع برفق لأسفل على مشرط بدلا من استخدام الاقتراحات النشر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد ذلك ، قص ظهارة الهدبية بعيدا عن RPE. عدم استخدام ملقط مسنن لنقل شريط من ظهارة الهدبية إلى صحن 35 ملم جديدة تحتوي على ACSF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في نفس الطريق ، وعزل ظهارة الهدبية من قذيفة العين الأخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة جمعت كل من شرائط الهدبية الظهارية ، ونقل الشرائط الى صحن 35 ملم تحتوي على 2 مل من Dispase. مكان الطبق مع شرائح في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 10 دقيقة ، ونقل شرائح من Dispase في صحن يحتوي على 2 مل من التربسين تصفيتها ، هيالورونيداز وحمض Kynurenic. ضع طبق في 37 لمدة 10 دقائق درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الآن نعود إلى مجهر تشريح. في حين عقد الصلبة إلى أسفل مع ملقط على التوالي ، واستخدام الجزء السفلي من ملقط مسنن غير منحنية لكشط البشرة بلطف الهدبية بعيدا عن الصلبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الصلبة من الطبق. كل ذلك ينبغي أن يترك في الطبق الآن هي الخلايا من الاهتمام والحل الانزيم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة القطن توصيل النار مصقول ، ونقل هذا الحل في أنبوب 14 مل. متمزج هذا الحل 30 مرات لتحطيم الخلايا الظهارية من خلال إجبار برفق في حل والخروج من ماصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنبوب الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 1500 دورة في الدقيقة. عندما يتم الطرد المركزي ، وإزالة أنبوب من أجهزة الطرد المركزي منذ بعناية الخلايا المعرضة للنزوله أسفل الأنبوب في هذه المرحلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح بلطف غالبية طاف به ماصة مصقول النار ، ثم إضافة 1 مل من مثبط التربسين في المصل خالية من وسائل الإعلام إلى الخلايا. استخدام القطن بئر صغيرة ماصة لتوصيل متمزج العينة ما يقرب من 50 مرات حتى يتم تعليق وحيد الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنبوب الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 5 دقائق عند 1500 دورة في الدقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف واستبدالها مع 1 مل من المتوسط ​​الطلاء الخاص. متمزج بلطف باستخدام ماصة الزجاج المصقول إلى النار resuspend الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد العدجي الخلايا ، لوحة لهم في الكثافة المطلوبة في صفيحة ال 24 أيضا. نحن لوحة عادة 10 خلية / ميكرولتر من خلال تعبئة كل أول بئر مع المتوسط ​​ثم إضافة تعليق خلية للحصول على الحجم النهائي من 500 ميكرولتر من وسائل الإعلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لوحة في الحاضنة 37 2 درجة مئوية ثاني حيث أنه لن يتم نقل حتى كنت تعول المجالات التي تنشأ بعد 7 أيام. </li></ol> 3. نتائج عزل الخلايا الجذعية الشبكية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما يتم تنفيذ هذا الإجراء بنجاح ، يجب أن تشريح الخلايا الظهارية الهدبية تبدو هذه بعد فصلها ومطلي في كثافة منخفضة (الشكل 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 7 أيام في الثقافة ، ويتم الاعتماد على الخلايا الجذعية الشبكية المجالات التي تنشأ. وينبغي أن يكون المجال أكثر من 75 ميكرومتر في القطر والتعويم الحر لتحسب بوصفها مجال الخلايا الجذعية المشتقة. (الشكل 2). ومع ذلك ، فإن بعض الخلايا محدودة الانتشار وشكل الأجسام الشبه الكروية التي لا تستوفي معيار حجم وسوف لا تكون محسوبة على مجالات الخلايا الجذعية المشتقة ؛ يظهر مثال كروي من هذا القبيل هنا (الشكل 2). </li></ol> 4. ممثل النتائج <img src="/files/ftp_upload/2209/2209fig1.jpg" alt="الشكل 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 1"> الشكل 1. <img src="/files/ftp_upload/2209/2209fig2.jpg" alt="الشكل 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 2"> الشكل 2.

<ol><li>Tropepe, V., Coles, B. L., Chiasson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+stem+cells+in+the+adult+mammalian+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Retinal stem cells in the adult mammalian eye.</a> Science. 287, 2032-2036 (2000).</li>
<li>Ahmad, I., Tang, L., Pham, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+neural+progenitors+in+the+adult+mammalian+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Identification of neural progenitors in the adult mammalian eye.</a> Biochem Biophys Res Commun. 270, 517-521 (2000).</li>
<li>Coles, B. L., Angenieux, B., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facile+isolation+and+the+characterization+of+human+retinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Facile isolation and the characterization of human retinal stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 15772-15777 (2004).</li>
<li>Cicero, S. A., Johnson, D., Reyntjens, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+previously+identified+as+retinal+stem+cells+are+pigmented+ciliary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cells previously identified as retinal stem cells are pigmented ciliary epithelial cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 6685-6690 (2009).</li>
<li>Lamba, D., Karl, M., Reh, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+regeneration+and+cell+replacement%3A+a+view+from+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Neural regeneration and cell replacement: a view from the eye.</a> Cell Stem Cell. 2 (6), 538-549 (2008).</li>
<li>Coles, B. L., Horsford, D. J., McInnes, R. R., van der Kooy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+retinal+progenitor+cells+leads+to+an+increase+in+the+retinal+stem+cell+population+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Loss of retinal progenitor cells leads to an increase in the retinal stem cell population in vivo.</a> Eur J Neurosci. 23, 75-82 (2006).</li>
<li>Angénieux, B., Schorderet, F. D., Arsenijevic, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+is+a+neuronal+differentiation+factor+for+retinal+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor is a neuronal differentiation factor for retinal stem cells in vitro.</a> Stem Cells. 24 (3), 696-706 (2006).</li>
<li>Xu, S., Sunderland, M. E., Coles, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proliferation+and+expansion+of+retinal+stem+cells+require+functional+Pax6%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The proliferation and expansion of retinal stem cells require functional Pax6.</a> Dev Biol. 304, 713-721 (2007).</li>
<li>Canola, K., Angénieux, B., Tekaya, M., Quiambao, A., Naash, M. I., Munier, F. L., Schorderet, D. F., Arsenijevic, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+stem+cells+transplanted+into+models+of+late+stages+of+retinitis+pigmentosa+preferentially+adopt+a+glial+or+a+retinal+ganglion+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Retinal stem cells transplanted into models of late stages of retinitis pigmentosa preferentially adopt a glial or a retinal ganglion cell fate.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (1), 446-4454 (2007).</li>
<li>Canola, K., Arsenijevic, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+cells+committed+towards+the+photoreceptor+fate+for+retinal+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Generation of cells committed towards the photoreceptor fate for retinal transplantation.</a> Neuroreport. 18 (9), 851-855 (2007).</li>
<li>Djojosubroto, M. W., Arsenijevic, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+stem+cells%3A+promising+candidates+for+retina+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Retinal stem cells: promising candidates for retina transplantation.</a> Cell Tissue Res. 331 (1), 347-357 (2008).</li>
<li>Inoue, T., Coles, B. L., Dorval, K., Bremner, R., Bessho, Y., Kageyama, R., Hino, S., Matsuoka, M., Craft, C. M., McInnes, R. R., Tremblay, F., Prusky, G. T., van der Kooy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximizing+functional+photoreceptor+differentiation+from+adult+human+retinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Maximizing functional photoreceptor differentiation from adult human retinal stem cells.</a> Stem Cells. 28 (3), 489-500 (2010).</li>
<li>Tropepe, V., Sibilia, M., Ciruna, B. G., Rossant, J., Wagner, E. F., Kooy, D. vander <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+neural+stem+cells+proliferate+in+response+to+EGF+and+FGF+in+the+developing+mouse+telencephalon.+Dev+Biol%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Distinct neural stem cells proliferate in response to EGF and FGF in the developing mouse telencephalon. Dev Biol.</a> , 208-201 (1999).</li>
<li>Coles-Takabe, B. L., Brain, I., Purpura, K. A., Karpowicz, P., Zandstra, P. W., Morshead, C. M., van der Kooy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Don%27t+look%3A+growing+clonal+versus+nonclonal+neural+stem+cell+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Don't look: growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies.</a> Stem Cells. 26 (11), 2938-2944 (2008).</li>
</ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

هذا البروتوكول توضح كيفية عزل الخلايا الجذعية من الظهارة الشبكية الهدبية من الفأرة 1-3 العين. يمكن للمنهجية لعزل شرائط من ظهارة الهدبية تختلف ، ومع ذلك فقد تم تحسين الانزيمات ومنهجية لتحقيق تعليق وحيد الخلية في هذا البروتوكول. من المهم أيضا أن يجرد من ظهارة الهدبية التي تم عزلها لا تحتوي على كميات كبيرة من RPE أو القرنية منذ هذه تظهر أن يكون لها أثر سلبي على إجمالي عدد من المجالات التي يمكن أن تكون معزولة عن كل عين. بالإضافة إلى ذلك ، وسائل الاعلام المصل الحرة التي نتخذها التي صيغت في الأصل لneurospheres الدماغ 13 ، مثالية لزراعة الخلايا الجذعية الشبكية المجالات. ينبغي للمرء أيضا التأكد من أن ليست منزعجة من الخلايا بعد أن تم مطلي انهم وضعت في الحاضنة بحيث مجالات النمو لا التجميعية معا 14. مرة واحدة في الخلايا الجذعية في شبكية العين قد شكلت نسيلي المجالات ، ويمكن عدهم على الحصول على عدد من الخلايا الجذعية المحتملين في العين. المجالات ومن ثم يمكن بعد ذلك فصل واحد والى خلايا passaged لقدرات ذاتية التحقق تجديد أو متمايزة الى أنواع مختلفة من الخلايا العصبية للشبكية وRPE باستخدام تركيبات مختلفة من عوامل النمو و / أو البروتينات.

<table><tbody><tr><td>مجهر Stemi 2000</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>مصدر ضوء بارد</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>KL1500</td><td>ضوء بصري ثنائي الذراع</td></tr><tr><td>مقصات Vannas صغيرة منحنية</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-10</td><td></td></tr><tr><td>مقصات Vannas مائلة</td><td>Fine Science Tools</td><td>15005-08</td><td></td></tr><tr><td>ملقط Dumont رقم 7</td><td>Fine Science Tools</td><td>11272-30</td><td>غير مسنن</td></tr><tr><td>ملقط Dumont رقم 5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td>مستقيم</td></tr><tr><td>ملقط دقيق</td><td>Fine Science Tools</td><td>11051-10</td><td>منحني مسنن</td></tr><tr><td>مقبض مشرط رقم 3</td><td>Almedic</td><td>2586-M36-10</td><td></td></tr><tr><td>شفرات مشرط رقم 10</td><td>Almedic</td><td>2580-M90-10</td><td></td></tr><tr><td>جهاز تعقيم بالخرز الساخن</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-45</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>VWR international</td><td>CACB354235</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1005</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6254</td><td></td></tr><tr><td>حمض الكينورينيك</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K3375</td><td>1000 IU</td></tr><tr><td>مثبط التريبسين</td><td>Roche Group</td><td>10109878001</td><td></td></tr><tr><td>أطباق 35 mm</td><td>VWR international</td><td>CA354235</td><td></td></tr><tr><td>صفيحة 24 بئر</td><td>VWR international</td><td>CA73521-004</td><td></td></tr><tr><td>ماصات مسدودة بسدادات قطنية</td><td>VWR international</td><td>14672-400</td><td>مصقولة بالنار</td></tr><tr><td>أنابيب 14 mL</td><td>Falcon BD</td><td>352057</td><td>بولي ستيرين</td></tr><tr><td>وسط خالٍ من المصل</td><td></td><td></td><td>المرجع رقم 13 للتركيبة</td></tr><tr><td>FGF2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0291</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149</td><td>100 IU</td></tr></tbody></table>

عزل الخلايا الجذعية من شبكية العين بالعين ماوس

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

الكبار الخلايا الجذعية الشبكية (RSC) هي الخلية النادرة هادئة وجدت داخل ظهارة الهدبية (م) من العين الثدييات 1،2،3. وأدلى م حتى من غير ذوي البشرة الداخلية وطبقات الخلايا الصباغية الخارجي ، ومصنوعة المستعمرات نسيلي RSC التي تنشأ من خلية واحدة من المصطبغة CE يصل كل من الخلايا الصباغية وغير الصباغية ، والتي يمكن أن تكون متمايزة لتشكيل جميع أنواع الخلايا العصبية للشبكية وRPE لل. هناك بعض الجدل حول ما اذا كانت جميع الخلايا ضمن مجالات تحتوي على كل ما لا يقل عن بعض الصباغ 4 ، ولكن الخلايا لا تزال قادرة على تشكيل أنواع مختلفة من الخلايا الموجودة داخل الشبكية العصبية 1-3. في بعض الأنواع ، مثل البرمائيات والأسماك ، وعيونهم قادرة على التجدد بعد إصابة 5 ، ولكن ؛ العين الثدييات لا تظهر هذه الخصائص على التجدد. نحن نسعى للتعرف على الخلايا الجذعية في الجسم الحي وفهم الآليات التي تبقي الخلايا الجذعية الثديية هادئة شبكية العين 6-8 ، وحتى بعد الاصابة فضلا عن استخدامها كمصدر محتمل للخلايا للمساعدة في إصلاح نماذج الجسدية أو الوراثية للإصابة العين من خلال زرع 12/09. نحن هنا تصف كيفية عزل الخلايا الظهارية الهدبية من العين الفأر وتنمو بها في الثقافة من أجل تشكيل الخلايا الجذعية نسيلي الشبكية المجالات. حيث لا توجد علامات معروفة من الخلايا الجذعية في الجسم الحي ، وهذه المجالات هي الطريقة الوحيدة المعروفة لتحديد مستقبلي السكان الخلايا الجذعية داخل ظهارة الهدبي للعين.

في هذا الفيديو ، سوف نقوم شرح كيفية عزل الخلايا الجذعية من الظهارة الشبكية الهدبية للعين الماوس وتنمو لهم في مجالات الثقافة لتشكيل نسيلي الشبكية. المجالات التي يتم عزل تمتلك خصائص أساسية للخلايا الجذعية : الذات وتجديد multipotentiality.

تعد الخلية الجذعية الشبكية (RSC) في الفأر البالغ خلية ساكنة نادرة توجد ضمن الظهارة الهدبية (CE) في عين الثدييات1,2,3. وتتكون الظهارة الهدبية من ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل الخلايا الجذعية الشبكية من الظهارة الهدبية للعين. يتم تحقيق ذلك أولاً بتنظيف العين وقطعها إلى نصفين، بدءاً من العصب البصري، والقطع عبر القرنية والعودة مرة أخرى إلى العصب البصري، ثم إزالة الشبكية العصبية والعدسة. وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في استئصال الظهارة الهدبية عن طريق قطع القرنية والقزحية والظهارة الشبكية الصباغية.تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في معالجة الظهارة الهدبية إنزيميًا، وإزالة الصلبة، وتفكيك الظهارة ميكانيكيًا إلى خلايا مفردة. أما الخطوة النهائية من الإجراء فهي إعادة تعليق الخلايا في وسط خالٍ من المصل وزرعها في أطباق زراعة الأنسجة التي تحتوي على وسط خالٍ من المصل مع عوامل النمو. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تُظهر استشرافيًا عدد الخلايا الجذعية الموجودة في الظهارة الهدبية للعين من خلال تكوين الكرات النسيلية في المختبر.مرحباً، اسمي بريندا كولز. ابتكر مختبرنا هذه الطريقة لأول مرة عندما كنا نبحث في أوراق بحثية حول القدرات التجديدية للعيون لدى البرمائيات والأسماك، وافترضنا أنه ربما توجد خلية في عين الثدييات تمتلك القدرات ذاتها. يتم إجراء عزل الخلايا الجذعية الشبكية في غرفة معقمة مخصصة لتجارب المزارع الأولية.قبل البدء في هذا الإجراء، قم بتجهيز مجهر التشريح ومصدر الضوء البارد، ثم رتّب أدوات التشريح المعقمة. تحتوي كل خزانة سلامة بيولوجية على جهاز تعقيم حراري لتعقيم الأدوات بين الخطوات. سنقوم بعزل الخلايا الجذعية الشبكية من العيون التي وُضعت فوراً في طبق بتري معقم يحتوي على سائل دماغي شوكي اصطناعي بعد إزالتها من الفئران التي تم التضحية بها وفقاً لبروتوكولات أخلاقيات التعامل مع الحيوانات المعتمدة. إن الجانب الأكثر صعوبة في هذا الإجراء هو تشريح جسم مستدير تحت المجهر.يجب توخي الحذر الشديد لتجنب إتلاف النسيج المستهدف. تحت مجهر التشريح، قم بتنظيف العين باستخدام الملاقط، مع إزالة الشعر والأنسجة الضامة الملتصقة بالحد القرنية الصلبية. بعد ذلك، انقل العين إلى طبق جديد يحتوي على A CSF مع تثبيت العين باستخدام ملاقط مسننة.استخدم مقصات التشريح الدقيق المائلة لإزالة العضلات العينية. قم بإزالة العصب البصري أيضاً إذا كان لا يزال متصلاً بالعين، وحاول تجنب الضغط على العين أثناء هذه العملية. انقل العيون إلى طبق جديد يحتوي على CSF.استُخدمت بعد ذلك مقصات تشريح دقيقة منحنية لقص العين إلى نصفين. ابدأ من العصب البصري وقص عبر منتصف القرنية وصولاً إلى العصب البصري حيث بدأت عملية القص. ومن المثالي أن يكون قطعا العين متساويين في الحجم تقريباً لأن ذلك سيسهل الخطوة التالية.أمسك القرنيات باستخدام ملقطين، ثم افصل نصفي العين برفق. قم بإزالة وتخلص من العدسات والأحشاء والشبكية العصبية من غلافي العين. انقل الغلافين إلى طبق جديد يحتوي على A CSF.نحن الآن مستعدون لعزل الظهارة الهدبية. للبدء، قم بتوجيه غلاف العين بحيث تكون القرنية على يمينك والظهارة الصبغية للشبكية على يسارك. قم بتثبيت غلاف العين برفق باستخدام ملقط مستقيم على جانب الـ RPE.بعد ذلك، استخدم المشرط لقطع القرنية والقزحية بعيداً عن الظهارة الهدبية للعين، وذلك من خلال الضغط للأسفل برفق على المشرط بدلاً من استخدام حركات النشر. بعد ذلك، اقطع الظهارة الهدبية بعيداً عن RPE. استخدم ملاقط غير مسننة لنقل شريحة الظهارة الهدبية إلى طبق جديد بقطر 35 millimeter يحتوي على A CSF.وبالطريقة نفسها، اعزل الظهارة الهدبية من صدفة العين الأخرى. وبمجرد جمع شرائح الظهارة الهدبية، انقل هذه الشرائح إلى طبق قطرُه 35 مليمتر يحتوي على 2 مل من dis space. ضع الطبق الذي يحتوي على الشرائح في حاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.بعد مرور 10 دقائق، انقل الشرائط من مساحة التقطيع إلى طبق يحتوي على 2 mL من القطرات المرشحة في محلول Halle ur haase وkind reic acid. ضع الطبق عند درجة حرارة 37 °C لمدة 10 دقائق. الآن عد إلى مجهر التشريح مع تثبيت الصلبة لأسفل باستخدام ملقط مستقيم.استخدم الطرف السفلي من الملقط غير المسنن ذو النهاية المنحنية لكشط الظهارة الهدبية بلطف بعيداً عن الصلبة. قم بإزالة الصلبة من الطبق، بحيث لا يتبقى في الطبق سوى الظهارة الهدبية.الآن، تتوفر الخلايا المستهدفة ومحلول الإنزيم. باستخدام ماصة ذات سدادة قطنية مصقولة بالنار، انقل المحلول إلى أنبوب سعة 14 لتر. قم بتفتيت هذا المحلول 30 مرة لتفكيك الخلايا الطلائية عن طريق دفع المحلول بلطف داخل وخارج الماصة، ثم قم بطرد الأنبوب مركزياً لمدة خمس دقائق بسرعة 1500 RPM.عند الانتهاء من عملية الطرد المركزي، أخرج الأنبوب من جهاز الطرد المركزي بعناية، وذلك لأن الخلايا تكون عرضة للانفصال عن قاع الأنبوب. في هذه المرحلة، قم بشفط معظم سائل SuperNet برفق باستخدام ماصة مصقولة باللهب، ثم أضف 1 mL من مثبط التريبسين في وسط خالٍ من المصل إلى الخلايا.استخدم ماصة صغيرة ذات سدادة قطنية لترitiv العينة حوالي 50 مرة حتى تصبح معلقاً من الخلايا المفردة. قم بطرد مركزي للأنبوب مرة أخرى لمدة خمس دقائق بسرعة 1500 RPM، ثم تخلص من السائل الطافي واستبدله بـ 1 milliliter من وسط الزرع الخاص بك.يُبرد الوسط برفق باستخدام ماصة زجاجية مصقولة باللهب لإعادة تعليق الخلايا. بعد عد الخلايا، يتم توزيعها بالكثافة المطلوبة. في طبق بـ 24 بئراً، نقوم عادةً بتوزيع 10 خلايا لكل µL عن طريق ملء كل بئر بالوسط أولاً، ثم إضافة معلق الخلايا للوصول إلى حجم نهائي قدره 500 µL من الوسط.ضع الطبق في حاضنة ثاني أكسيد الكربون عند درجة حرارة 37 °C، حيث يترك دون تحريك حتى يتم عد الكريات التي تتكون بعد سبعة أيام عند تنفيذ هذا الإجراء بنجاح. يجب أن تبدو الخلايا الظهارية الهدبية المفصولة بهذا الشكل بعد تفكيكها وزرعها بكثافة منخفضة. وبعد مرور سبعة أيام في المزرعة، يتم عد كريات الخلايا الجذعية الشبكية المتكونة.يجب أن يتجاوز قطر الكرة 75 microns وأن تكون طافية بحرية لكي يتم احتسابها ككرة مشتقة من الخلايا الجذعية. ومع ذلك، ستظهر بعض الخلايا تكاثراً محدوداً وتكون PHE لا تستوفي معيار الحجم، ولن يتم احتسابها ككرات مشتقة من الخلايا الجذعية. يظهر هنا مثال على مثل هذا الكويكب بعد تطوره.مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علوم الرؤية لاستكشاف إمكانية استخدام الخلايا الجذعية الشبكية في علاج أمراض الشبكية.

isolation-of-retinal-stem-cells-from-the-mouse-eye

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

يصف هذا الفيديو بروتوكولا لعزل كوب الشبكية بدون طبقات التغطية الخارجية من مقلة عين الفأر. يمكن أن يساعد نسيج الشبكية المستخرج في دراسة المسارات الأيضية المختلفة التي تحدث في خلايا الشبكية.

استخراج كأس الشبكية من الفأر: إجراء جراحي للحصول على كوب شبكية سليم من عين الفأر

يوضح هذا الفيديو إجراء عزل خلايا العقدة الشبكية الأولية للفئران (RGCs) باستخدام قياس التدفق الخلوي. تسمح هذه الطريقة بالدراسة المستقبلية ل RGCs ، بهدف فهم أفضل للانخفاض الرئيسي في حدة البصر الناتج عن فقدان RGCs الوظيفية في الأمراض التنكسية العصبية.

عزل الخلايا العقدية الشبكية الفئرانية باستخدام فرز الخلايا المنشط بالفلورة

يعاني الملايين من الناس من أمراض تنكسية في شبكية العين تؤدي إلى عمى لا رجعة فيه. وهناك عنصر شائع في العديد من هذه الأمراض هو فقدان خلايا العقدة الشبكية (رغس). يصف هذا البروتوكول تفصيلا عزل رغس الفئران الأولية عن طريق اختيار الإيجابية والسلبية مع التدفق الخلوي.

عزل الخلايا العقدة الشبكية الفئران الأولية (رغس) عن طريق التدفق الخلوي

ظهارة صباغ الشبكية (RPE) ظهارة متعدد الوظائف للعين. نقدم هنا بروتوكولا لإنشاء الثقافات الخلية الأولية المستمدة من RPE مورين.

الثقافات الخلية الأولية من ظهارة صباغ الشبكية الماوس

يقدم هذا البروتوكول تقنيتين لعزل المقصورات تحت الخلوية للمستقبلات الضوئية لقضيب الفئران لتحليل البروتين. تستخدم الطريقة الأولى الشبكية الحية وورق ترشيح السليلوز لفصل الأجزاء الخارجية للقضيب ، بينما تستخدم الطريقة الثانية شبكية العين المجففة بالتجميد والشريط اللاصق لتقشير طبقات القضبان الداخلية والخارجية.

طريقتان للتقشير لعزل مقصورات خلايا المستقبلات الضوئية في شبكية العين للفأر لتحليل البروتين

يصف هذا البروتوكول طريقة لعزل الخلايا البطانية الشبكية بعد الولادة للفئران المحسنة لإنتاجية الخلايا ونقاوتها وقابليتها للحياة. هذه الخلايا مناسبة لنهج تسلسل الجيل التالي.

عزل الخلايا البطانية الشبكية للجيل التالي

تصف هذه المخطوطة بروتوكولا مبسطا لعزل خلايا الظهارة المصطبغة في الشبكية (RPE) عن عيون الفئران بطريقة تدريجية. يتضمن البروتوكول استئصال وتشريح عيون الفئران ، يليه عزل خلايا RPE وبذرها وزراعتها.

عزل الخلايا الظهارية المصطبغة بالشبكية الأولية للفأر

تمثل مزارع مولر الدبقية الأولية التي تم الحصول عليها من شبكية العين الفأرية أداة قوية وموثوقة للغاية لدراسة التحويل الدبقي إلى خلايا سلف شبكية العين بعد علاج الحمض النووي الريبي الميكروي. يمكن اختبار جزيئات أو تركيبات مفردة قبل تطبيقها اللاحق للنهج في الجسم الحي .

مزارع الخلايا الأولية لدراسة إمكانات تجديد مورين مولر غليا بعد علاج الحمض النووي الريبي الميكروي

وصفنا طريقة بسيطة وفعالة لعزل خلايا ظهارة الشبكية الصبغية (RPE) عن عيون خنازير غينيا المصطبغة الصغيرة. يسمح هذا الإجراء بمتابعة دراسات البيولوجيا الجزيئية على RPE المعزول ، بما في ذلك تحليلات التعبير الجيني.

عزل الخلايا الظهارية الصبغية الشبكية من عيون خنزير غينيا

تصف هذه المخطوطة بروتوكولا مفصلا لعزل خلايا مولر الدبقية في شبكية العين عن عيون الفئران. يبدأ البروتوكول باستئصال وتشريح عيون الفأر ، يليه عزل خلايا مولر وبذرها وزراعتها.

عزل خلايا مولر الدبقية الدبقية لشبكية الفأر الأولية

تعمل ظهارة الشبكية الصبغية (RPE) كحاجز حاسم بين المشيمية والشبكية ، مما يعزز صحة ووظيفة أنواع خلايا الشبكية ، مثل المستقبلات الضوئية. هنا ، نصف بروتوكولا بسيطا وفعالا لعزل وزراعة الفئران البالغة RPE.

طريقة مبسطة لعزل وزراعة الخلايا الظهارية الصبغية للشبكية من الفئران البالغة

تعلم عزل الخلايا الجذعية الشبكية من الظهارة الهدبية لعين الفأر واستنباتها لتشكيل كرات شبكية استنساخية. تُظهر هذه الخلايا خصائص جذعية مثل التجديد الذاتي والتعدد القدرة.

عزل الخلايا الجذعية من شبكية العين بالعين ماوس

استكشف المزيد من الفيديوهات