عزل الخلايا الجذعية من شبكية العين بالعين ماوس

في هذا الفيديو ، سوف نقوم شرح كيفية عزل الخلايا الجذعية من الظهارة الشبكية الهدبية للعين الماوس وتنمو لهم في مجالات الثقافة لتشكيل نسيلي الشبكية. المجالات التي يتم عزل تمتلك خصائص أساسية للخلايا الجذعية : الذات وتجديد multipotentiality.

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل الخلايا الجذعية للشبكية من الظهارة الهدبية للعين. يتم تحقيق ذلك عن طريق تنظيف العين أولا وقطعها إلى نصفين ، بدءا من العصب البصري ، وقطع القرنية والالتقاء بالعصب البصري ، ثم إزالة شبكية العين العصبية والعدسة. الخطوة الثانية من الإجراء هي قطع الظهارة الهدبية عن طريق قطع قزحية القرنية والظهارة المصطبغة في الشبكية.

تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في معالجة الظهارة الهدبية إنزيميا ، وإزالة الصلبة وفصل الظهارة ميكانيكيا إلى خلايا مفردة. تتمثل الخطوة الأخيرة من الإجراء في إعادة تعليق الخلايا في وسائط خالية من المصل ووضعها في ألواح زراعة الأنسجة التي تحتوي على وسائط خالية من المصل مع عوامل النمو. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر بشكل مستقبلي عدد الخلايا الجذعية الموجودة في الظهارة الهدبية للعين من خلال الكرة النسيلة ، والتكوين في المختبر.

مرحبا ، اسمي بريندا كولز. توصل مختبرنا إلى هذه الطريقة لأول مرة عندما كنا نبحث عن أوراق حول القدرات التجددية للبرمائيات والأسماك في عيونهم ، وافترضنا أنه ربما كانت هناك خلية في عين الثدييات بنفس القدرات. يتم عزل الخلايا الجذعية للشبكية في غرفة معقمة محددة مخصصة لتجارب الثقافة الأولية.

قبل البدء في هذا الإجراء ، قم بإعداد مجهر التشريح ومصدر الضوء البارد ثم ضع أدوات التشريح المعقمة. يحتوي كل غطاء على معقم سريع لتعقيم الأدوات بين الخطوات. سنقوم بعزل الخلايا الجذعية للشبكية من العيون التي تم وضعها على الفور في طبق بتري معقم يحتوي على سائل دماغي صناعي بعد الإزالة من الفئران التي تم التضحية بها وفقا لبروتوكولات أخلاقيات المعتمدة ، فإن أصعب جانب في هذا الإجراء هو تشريح جسم دائري تحت المجهر.

يجب توخي الحذر الشديد حتى لا تدمر الأنسجة ذات الأهمية تحت المجهر التشريح ، قم بتنظيف العين بالملقط. تخلص من الشعر والأنسجة المتصلة المرتبطة بحدود صلبة القرنية. ثم انقل العين إلى طبق جديد به السائل الدماغي النخاعي مع إبقاء العين ثابتة باستخدام ملقط مسنن.

استخدم مقص تشريح دقيق بزاوية لإزالة عضلات العين. قم بإزالة العصب البصري أيضا إذا كان لا يزال متصلا بالعين ، فحاول ألا تسحق العين أثناء هذه العملية. انقل العينين إلى طبق جديد مع CSF.

بعد ذلك ، استخدم مقص تشريح دقيق منحني لقطع العين إلى نصفين. ابدأ من العصب البصري واقطع منتصف القرنية مرة أخرى في العصب البصري حيث بدأ القطع. إنه مثالي إذا كانت قطعتا العين متساويتين تقريبا في الحجم لأن هذا سيجعل الخطوة التالية أسهل.

أمسك القرنية باستخدام ملقطين ، وقم بتقشير نصفي العين برفق. قم بإزالة العدسات والأحشاء والشبكية العصبية والتخلص منها من أصداف العين. انقل القشرة إلى طبق جديد مع CSF.

الآن نحن مستعدون لعزل الظهارة الهدبية. للبدء ، قم بتوجيه قشرة العين بحيث تكون القرنية على يمينك وظهارة الشبكية المصطبغة على يسارك. قم بتثبيت قشرة العين برفق باستخدام ملقط مستقيم على جانب RPE.

بعد ذلك ، استخدم المشرط لقطع القرنية والقزحية بعيدا عن الظهارة الهدبية للعين عن طريق الضغط برفق على المشرط بدلا من استخدام حركات النشر. بعد ذلك ، قم بقطع الظهارة الهدبية بعيدا عن RPE. استخدم ملقطا غير مسنن لنقل شريط الظهارة الهدبية إلى طبق جديد مقاس 35 ملم يحتوي على السائل الدماغي النخاعي.

بنفس الطريقة ، اعزل ظهارة الهدبية عن قشرة العين الأخرى. بمجرد جمع شرائط الظهارة الهدبية ، انقل الشرائط إلى طبق 35 ملم يحتوي على ملليلترين من الفراغ. ضع الطبق مع الشرائح في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.

بعد 10 دقائق ، انقل الشرائط من مساحة الفصل إلى طبق يحتوي على ملليلترين من القطرات المفلترة في Halle الخاص بك وحمض الريك اللطيف. ضع الطبق على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. عد الآن إلى مجهر التشريح مع إمساك الصلبة لأسفل باستخدام ملقط مستقيم.

استخدم الجزء السفلي من الملقط غير المقنن لكشط الظهارة الهدبية برفق بعيدا عن الصلبة. أخرج الصلبة من الطبق. كل ما يجب تركه في الطبق.

الآن هي الخلايا ذات الأهمية ومحلول الإنزيم. باستخدام ماصة قطنية مصقولة بالحريق ، انقل المحلول إلى أنبوب سعة 14 لترا. قم بتقطيع هذا المحلول 30 مرة لتفكيك الخلايا الظهارية عن طريق إجبار المحلول برفق على الدخول والخروج من الماصة ، وقم بالطرد المركزي للأنبوب لمدة خمس دقائق عند 1500 دورة في الدقيقة.

عند الانتهاء من الطرد المركزي ، قم بإزالة الأنبوب من جهاز الطرد المركزي بعناية. لأن الخلايا عرضة للخروج من قاع الأنبوب. في هذه المرحلة ، قم بشفط غالبية SuperNet برفق باستخدام ماصة مصقولة بالنار ثم أضف ملليلترا واحدا من مثبط التربسين في الوسائط الخالية من المصل إلى الخلايا.

استخدم ماصة صغيرة من القطن بئر لمعالجة العينة حوالي 50 مرة حتى تصبح معلقة أحادية الخلية. الطرد المركزي الأنبوب مرة أخرى لمدة خمس دقائق. عند 1500 دورة في الدقيقة ، قم بإزالة المادة الطافية واستبدلها بمليلتر واحد من الطلاء.

في الثلاجة المتوسطة برفق باستخدام ماصة زجاجية مصقولة للحريق لإعادة تعليق الخلايا. بعد عد الخلايا ، قم بصفيحتها بالكثافة المطلوبة. في صفيحة 24 بئرا ، عادة ما نقوم بوضع 10 خلايا لكل ميكرولتر عن طريق ملء كل بئر أولا بوسط ، ثم إضافة تعليق الخلية للحصول على حجم نهائي يبلغ 500 ميكرولتر من الوسائط.

ضع اللوحة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بدرجة حرارة 37 درجة مئوية حيث لن يتم تحريكها حتى تحسب الكرات التي تنشأ بعد سبعة أيام عندما يتم تنفيذ هذا الإجراء بنجاح. يجب أن تبدو الخلايا الظهارية الهدبية التي تم تشريحها هكذا بعد تفكيكها وطلاءها بكثافة منخفضة. بعد سبعة أيام في المزرعة ، يتم حساب كرات الخلايا الجذعية للشبكية التي تنشأ.

يجب أن يزيد قطر الكرة عن 75 ميكرون وأن تطفو بحرية ليتم احتسابها ككرة مشتقة من الخلايا الجذعية. ومع ذلك ، سيكون لبعض الخلايا تكاثر محدود وتشكل PHE لا تفي بمعيار الحجم ولن يتم احتسابها على أنها مجالات مشتقة من الخلايا الجذعية. يظهر هنا مثال على هذا الكويكب بعد تطوره.

مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علوم الرؤية لاستكشاف إمكانية استخدام الخلايا الجذعية للشبكية في علاج أمراض الشبكية.