قياسات تدفق الأكسجين لتقييم تنفس الميتوكوندريا في الخلايا الحية والمنفذة

قم بتحميل معلق خلية الثدييات في غرف مقياس التنفس التي تحتوي على وسائط وأغلقها بسدادات لإنشاء نظام مغلق لقياس الأكسجين.

يقيس المستشعر داخل كل غرفة تدفق الأكسجين في الوقت الفعلي ، ومعدل استهلاك الأكسجين الخلوي.

حقن digitonin من خلال السدادات لاختراق أغشية الخلايا, السماح لمكونات العصارة الخلوية للانتشار.

هذا يقلل من توافر الركيزة لسلسلة نقل الإلكترون في الميتوكوندريا ، مما يقلل من تدفق الأكسجين.

أدخل البيروفات والمالات ، اللذين يدخلان الميتوكوندريا ويولدان ناقلات إلكترون.

تتبرع هذه الناقلات بالإلكترونات إلى المجمعين الأول والثاني من ETC ، مما يؤدي إلى بدء نقل الإلكترون وزيادة تدفق الأكسجين.

حقن ADP لبدء تخليق ATP ، مما يزيد من تدفق الأكسجين.

بعد ذلك ، قم بمعايرة آلة فك التوصيل بخطوة لتعطيل تدرج البروتون ، مما يزيد من تدفق الأكسجين.

أخيرا ، قم بحقن مضاد الميسين A لتثبيط المركب الثالث ، ووقف نقل الإلكترون وتقليل تدفق الأكسجين.

يكشف ملف تعريف التدفق هذا عن تنفس الميتوكوندريا في الخلايا المنفذة.

للبدء ، أضف وسط تنفس الميتوكوندريا MiR05 إلى غرفة Oroboros النظيفة. أدخل السدادة لإغلاق الغرفة وسحب الوسط الزائد من وعاء السدادة باستخدام نظام الشفط.

قبل إضافة خلايا HEK 293T ، احسب حجم تعليق مخزون الخلايا اللازم لتحقيق تركيز تجريبي قدره 1 مليون خلية لكل مليلتر.

ثم قم بإزالة السدادة من الغرفة وضعها على الرف. باستخدام ماصة ، قم بإزالة حجم MiR05 Vout من الغرفة المقابلة للحجم المحسوب لتعليق مخزون الخلية.

بعد إعادة تعليق تعليق مخزون الخلية تماما باستخدام ماصة ، أضف الحجم المحسوب إلى الغرفة.

لإغلاق الحجرة ، أدخل السدادة ، مع التأكد من عدم احتجاز أي فقاعات بالداخل. اسحب أي سائل زائد من وعاء السدادة باستخدام نظام الشفط.

انتظر حتى يستقر تدفق الأكسجين ، والذي يستغرق عادة حوالي 15 دقيقة.

يتم عرض آثار تدفق الأكسجين في اللوحة العلوية لكلتا الغرفتين ، بينما يتم عرض تركيز الأكسجين في اللوحة السفلية.

لتحضير المحاقن الدقيقة ، حدد المحاقن المناسبة ونظفها بناء على نوع المادة الكيميائية والحجم المراد معايرتها. ضع المحقنة الدقيقة على رف المحقنة.

الآن ، قم بتحميل المحقنة بالمادة الكيميائية وفقا للمعايرة بالتحليل الحجمي بالتحليل الحجمي للركيزة التنفسية أو بروتوكول SUIT ، وتجنب فقاعات الغاز. املأ المحقنة ب 1 ميكرولتر على الأقل أكثر من الحجم المطلوب.

اضغط على المكبس حتى يتم الوصول إلى العلامة المطلوبة على البرميل الزجاجي ، مما يضمن ظهور قطرة صغيرة عند طرف الإبرة. امسح القطرة الموجودة على جدار القارورة الكيميائية قبل الشروع في المعايرة بالتحليل الحجمي.

عند إجراء المعايرة بالتحليل الحجمي ، يجب إدخال الإبرة بالكامل من خلال الشعيرات الدموية السدادة حتى يتلامس إنهاء البرميل الزجاجي مع السدادة ، ويجب حقن المادة الكيميائية بسرعة في الغرفة.

لبدء بروتوكول SUIT هذا ، أضف الديجيتونين إلى تركيز تجريبي قدره 5 ميكروغرام لكل مليلتر في كلتا الغرفتين. ثم انقر فوق موافق في نافذة الحدث لتعيين الحدث المقابل لكلا المجلسين.

امتصاص السوائل الزائدة من وعاء السدادة. انتظر حتى يستقر تدفق الأكسجين وسجل لمدة 2 دقيقة على الأقل.

قم بمعايرة البيروفات في كلتا الغرفتين متبوعا بمالات للوصول إلى التركيزات التجريبية المعنية. انقر فوق موافق في نافذة الحدث.

الآن ، قم بسحب السائل الزائد من وعاء السدادة ، وانتظر استقرار التدفق ، وسجل لمدة دقيقتين تقريبا.

بعد ذلك ، أضف ADP إلى تركيز تجريبي يبلغ 2.5 ملليمولار وانقر فوق موافق في نافذة الحدث.

بعد إزالة السائل الزائد ، انتظر تثبيت التدفق. قد يستغرق التدفق ما يصل إلى 20 دقيقة حتى يستقر.

بعد ذلك ، كرر العملية مع CCCP بزيادات 0.5 ميكرومولار للوصول إلى الحد الأقصى للتدفق.

أضف مضاد الميسين أ للوصول إلى تركيز تجريبي يبلغ 2.5 ميكرومولار.

بعد الوصول إلى تثبيت التدفق ، انقر فوق الزر المسمى إيقاف القياس.

لتحليل البيانات ، قم بتبديل التخطيط من التراكب إلى غرف منفصلة. ضع علامات على الأقسام المستقرة والتمثيلية لمخطط التدفق ، وتجنب القطع الأثرية للمعايرة.

حدد العلامات من القائمة العلوية، ثم اختر وضع علامة على الإحصائيات. حدد الوسيط من القائمة المنسدلة "وضع الإحصائيات" وانقر فوق نسخ إلى الحافظة لنقل البيانات لمزيد من التحليل.