تشكيل بيوفيلم في المختبر في غرفة الشرائح 8 جيد

الهدف العام من هذا الإجراء هو زراعة الأغشية الحيوية البكتيرية في آبار شريحة الغرفة. يتم تلقيح كل بئر أولا بالبكتيريا في وسط النمو ، ثم يتم زراعته عند 37 درجة مئوية. بمجرد تكوين الأغشية الحيوية ، يتم استخدام صبغة حيوية لتلطيخ الخلايا.

ثم يتم غسل الأغشية الحيوية وتثبيتها ، ويتم إغلاق الآبار باستخدام زلة غطاء. أخيرا ، يمكن ملاحظة الخلايا عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر ومورفولوجيا الأغشية الحيوية المختلفة المميزة. تتمثل إحدى مزايا هذه التقنية على الطرق الحالية مثل خلايا التدفق في أن الأحجام أصغر بكثير وبالتالي تقلل من كمية أي مركب تجريبي سيتم استخدامه.

أيضا ، يمكن مقارنة المزيد من المتغيرات في وقت واحد في شريحة غرفة من ثمانية آبار مقارنة بخلية تدفق ثلاثية الغرف. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على العديد من الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأحياء الدقيقة ، مثل حركية تكوين الأغشية الحيوية. يمكن أن توفر هذه الطريقة أيضا نظرة ثاقبة لأمراض متعددة تشمل مكون الأغشية الحيوية مثل التهاب الأذن الوسطى المزمن والتليف الكيسي والتهابات المثانة المزمنة على سبيل المثال لا الحصر.

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد الجدد في هذه الطريقة لأن هناك العديد من الخطوات التي يمكن فيها تعطيل الأغشية الحيوية الحالية بشكل مصطنع. لذلك ، فإن العرض المرئي لهذه الطريقة أمر بالغ الأهمية حيث يصعب تعلم إزالة خطوات السوائل وإضافتها ، وتكون فرصة تعطيل الأغشية الحيوية بسبب القوى الهائلة أكبر في هذه النقاط من البروتوكول الذي يوضح الإجراء اليوم ستكون ليز ، طالبة دراسات عليا من المختبر ، تلقيح البكتيريا في وسط الثقافة السائلة ، واحتضان الثقافة حتى تصل إلى منتصف مرحلة السجل. قم بتخفيف تعليق الطور اللوغاريتمي المتوسط عند واحد إلى 2،500 في وسط التدفئة النزلية غير القابل للكتابة ، والذي يتم استخدامه في هذا المثال.

سيوفر هذا 40،000 وحدة تشكيل مستعمرة لكل مليلتر كتركيز أولي. انقل 200 ميكرولتر من الثقافة المخففة بشكل معقم إلى كل بئر من شريحة غرفة الآبار المعقمة المكونة من ثمانية آبار. احتضان الشريحة عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ للسماح للبكتيريا بالبدء في تكوين الأغشية الحيوية بعد 16 إلى 18 ساعة.

قم بإزالة الشريحة من الحاضنة واستنشق الوسط من زاوية كل حجرة. ثم استبدلها ب 200 ميكرولتر من وسط التدفئة الطازجة. تأكد من الاستغناء عن الوسيط الجديد على طول جدار الغرف لتجنب تعطيل الأغشية الحيوية.

أعد الشريحة إلى الحاضنة واترك الثقافات تنمو إلى الكثافة المطلوبة. استبدال الوسط كل ثماني إلى 16 ساعة للحفاظ على صلاحية البكتيريا. لتصور الأغشية الحيوية ، أولا ، قم بإزالة المواد الطافية المزروعة كما هو موضح سابقا وغسل الأغشية الحيوية برفق مرتين باستخدام 200 ميكرولتر من المحلول الملحي المعقم.

بمجرد غسل الأغشية الحيوية ، أضف 200 ميكرولتر من البقعة الميتة الحية للإضاءة الخلفية إلى كل بئر لشريحة واحدة من ثمانية غرف بئر. تشكل ما مجموعه ملليلترين من محلول البقع. احتضن الشريحة في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.

من هذه الخطوة إلى الأمام ، تأكد من حماية الشريحة من الضوء. احتضن الشريحة في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. بمجرد تلطيخ الخلايا ، قم بإزالة البقعة الميتة الحية وغسل كل بئر مرتين بالمحلول الملحي.

كما هو موضح سابقا ، أضف 200 ميكرولتر من الفورمين المحايد إلى كل بئر واحتضان الشريحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل لإصلاح العينة. بعد هذه الحضانة ، قم بإزالة المثبت والتخلص منه وغسل الأغشية الحيوية مرتين باستخدام المحلول الملحي ، قم بإزالة الآبار البلاستيكية من الشريحة وأضف ما يقرب من 150 ميكرولتر من المحلول الملحي لكل منها. قم بتغطية الآبار جيدا عن طريق وضع زلة غطاء على الحشية ، مع التأكد من عدم وجود فقاعات وإغلاق حواف زلة الغطاء بوسط تثبيت.

بدلا من ذلك ، يمكن استخدام طلاء الأظافر لإغلاق زلة الغطاء. في هذا المثال ، نستخدم طلاء الأظافر لتصور أفضل للإجراء ، اترك المادة المانعة للتسرب تجف في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة على الأقل قبل فحص الأغشية الحيوية تحت المجهر. هذه الصورة عبارة عن إعادة بناء ثلاثية الأبعاد لصور زاك لغشاء حيوي من الإنفلونزا الحية الميتة الميتة التي تم جمعها باستخدام مجهر متحد البؤر.

الأغشية الحيوية الموضحة هنا هي مثال على غشاء حيوي شكله NTHI بعد 24 ساعة من النمو في شريحة الغرفة. باستخدام هذه التقنية ، كانت البكتيريا قابلة للحياة في وقت التثبيت كما يتضح من التألق الأخضر وغياب التألق الأحمر. يمكن رؤية بنية الأغشية الحيوية بوضوح تام مع وجود العديد من الأبراج داخل هيكل الأغشية الحيوية والعديد من قنوات المياه الموجودة.

المنظر الجانبي في اللوحة B الارتفاع النسبي للأغشية الحيوية التي تشكلت في هذه المرحلة الزمنية. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر إضافة السوائل وإزالتها من البئر ببطء لتقليل توليد القوى الهائلة التي قد تعطل الأغشية الحيوية الموجودة في البئر. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل وضع العلامات المناعية لبروتينات معينة ذات أهمية أو وضع العلامات على الليكتين من أجل الإجابة على أسئلة إضافية تتعلق بالمكونات الكيميائية الحيوية الموجودة داخل المصفوفة التي تشكلها البكتيريا في الأغشية الحيوية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام شريحة من ثماني غرف بئر لدراسة تكوين الأغشية الحيوية البكتيرية.