الثقافة السابقين فيفو من خلايا الإنسان الأولية قناة فالوب طلائي

قناة فالوب (FT) آخذة في الظهور كموقع بديل المنشأ لسرطان المبيض المصلي (SOC). هذا البروتوكول يصف طريقة جديدة لعزل و

لا يزال سرطان المبيض مرضا ممتا للغاية مع عروض سريرية متفاوتة ، وأنواع فرعية نسيجية متعددة ، ومجموعة واسعة من الانحرافات الجينية. سرطان المبيض المصلي هو النوع الفرعي الأكثر شيوعا وعدوانية ، وتشير الدراسات الحديثة إلى أن عددا كبيرا من هذه الأورام تنشأ من قناة فالوب بدلا من المبيض. الهدف من هذا الإجراء هو إنشاء مزارع خارج الجسم الحي لخلايا قناة فالوب البشرية حيث يمكن زراعة الخلايا الإفرازية والمهدبة بشكل مشترك بطريقة تحافظ على مورفولوجيتها الطبيعية وقطبيتها وعلم وظائف الأعضاء.

يتم تحقيق ذلك عن طريق جمع عينات من أنسجة قناة فالوب البشرية الطازجة وتشريحها إلى قطع أصغر. ثم يتم فصل الخلايا الظهارية عن سترومر أنسجة قناة فالوب. بعد ذلك ، يتم عزل الخلايا الظهارية لقناة فالوب وإزالة أنواع الخلايا الأخرى من المزرعة.

الخطوة الأخيرة هي بذر الخلايا الظهارية لقناة فالوب على مرشحات مغلفة بالكولاجين والنمو في الزراعة المشتركة. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر وجود كل من الخلايا الإفرازية لقناة فالوب والخلايا المهدبة في الثقافة من خلال الفحص المجهري المناعي أو الكيمياء المناعية. تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل استخدام خطوط خلايا سرطان المبيض في أنه يمكن دراسة كلا النوعين من الخلايا الظهارية لقناة فالوب معا في ثقافة exvivo المشتركة التي تحافظ على بنية مورفولوجيا وقطبية ظهارة قناة فالوب البشرية الطبيعية.

قبل أن يمكن زراعة الخلايا الظهارية لقناة فالوب البشرية. من الضروري تحضير مرشحات ترانسويل مطلية بالكولاجين لتكون بمثابة ركيزة لزراعة الخلايا الظهارية. أولا ، انقل 30 ملليغرام من الكولاجين المشيمي البشري إلى BCO يحتوي على 50 مل من الماء المقطر وقضيب التحريك المغناطيسي.

ثم ماصة 100 ميكرولتر من حمض الخليك الجليدي مباشرة على الكولاجين. ضع الدورق على طبق ساخن مع التحريك وقم بتسخين المحلول إلى 37 درجة مئوية مع التقليب مع الحرارة وحرك المحلول لمدة 20 إلى 30 دقيقة. تأكد من إذابة الكولاجين تماما وعدم وجود خيوط كولاجين.

بعد ذوبان الكولاجين ، أضف 450 مل من الماء المقطر ثم أثناء العمل في مرشح غطاء مزرعة الأنسجة المعقم من خلال غشاء 0.2 ميكرون. انقل المحلول إلى أنبوب سعة 50 مل. قم بإعداد أغشية مرشح الكولاجين المطلية بالكولاجين باستخدام الملقط أولا لوضع المرشحات في آبار صفيحة 24 بئرا ، ثم قم بتقطيع 50 إلى 100 ميكرولتر من محلول الكولاجين في الجزء العلوي من مرشح transwell واحتضانها طوال الليل في درجة حرارة الغرفة.

يمكن تخزين محلول الكولاجين المتبقي عند أربع درجات مئوية بعد جمع أنبوب فالوب الطازج ، يتم ترسيب فيمبريا في PBS معقم في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مليلتر ويوضع على الفور على الجليد في ماصة غطاء المحرك لزراعة الأنسجة 20 ملليلترا من PBS المبرد في الأنبوب. لغسل الأنسجة ، قم بشفط PBS بعناية دون إزعاج الأنسجة وكرر الغسالة مرتين. إذا كانت الأنسجة ملوثة بالدم ، فاستخدم ملقطا معقما لنقل الأنسجة إلى طبق زراعة أنسجة معقم بطول 10 سم.

ثم أمسك بأنبوب فالوب الليفي بملقط معقم واستخدم مشرطا بشفرة معقمة لقطع الألياف بالطول لزيادة تعرض الخلايا الظهارية. افتح الألياف بالملقط حتى تصبح صفيحة مسطحة تقريبا. ثم قطع الورقة إلى قطع صغيرة يبلغ قطرها حوالي ثلاثة ملليمترات.

استخدم ملقطا لنقل القطع إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مليلتر يحتوي على 45 مل من وسائط التفكك المبردة. ضع الأنبوب على منصة اهتزاز وقم بالصخور برفق عند أربع درجات مئوية لمدة 24 إلى 72 ساعة. راجع البروتوكول المكتوب للإجراء للتحقق من التفكك الأمثل.

تحقق من كمية التكتل وصلاحية الأنسجة التي يمثلها ضرب الخلايا المهدبة. يجب أن تكون كل من الخلايا المفردة وبعض الكتل الصغيرة مرئية بعد تحقيق التفكك الأمثل. قم بتعطيل البروناز بإضافة خمسة ملليلتر من FBS.

ثم اقلب الأنبوب مرتين أو ثلاث مرات لتفكيك كتل الخلايا إلى مجاميع أصغر. اسمح للأنبوب بالجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة إلى دقيقتين حتى تغرق كتل أكبر من الأنسجة اللحمية في قاع الأنبوب. ثم دون إزعاج القطع الكبيرة من الأنسجة، استخدم ماصة مصلية لشفط الوسائط التي تحتوي على الخلايا الظهارية ونقلها إلى ماصة أنبوبية نظيفة سعة 50 مل.

50 مل من MEM البارد بدون FBS في أنبوب 50 مليلتر يحتوي على بقايا الأنسجة. اقلب الأنبوب لجمع أي خلايا ظهارية متبقية ثم اترك الكتل الكبيرة تستقر. مرة أخرى ، قم بجمع الوسائط دون إزعاج الكتل الكبيرة من الأنسجة ونقلها إلى جهاز طرد مركزي أنبوبي جديد سعة 50 مليلتر ، وكلاهما أنبوب 50 مليلتر من الخلية الظهارية ، وتعليق 1000 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق بعد الطرد المركزي ، قم بشفط الوسائط والتخلص منها.

بعد ذلك ، قم بتعليق كل من كريات الخلية في خمسة ملليلتر من وسائط التسخين 37 درجة مئوية ، USG عن طريق سحب العينات برفق لأعلى ولأسفل. ثم انقل معلق الخلية إلى طبق ثقافة منبوذ واحتضانه في حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة إلى ثلاث ساعات لإزالة الخلايا الليفية وخلايا الدم الحمراء من تعليق الخلايا الظهارية. أثناء غسل الحضانة ، يتم ترشيح الكولاجين المطلي ب 100 ميكرولتر من PBS لإزالة الكولاجين الزائد.

من الضروري تجنب لمس الغشاء لأن أي ضرر قد يؤثر على جودة مزارع قناة فالوب خارج الجسم الحي. بعد انقضاء وقت الحضانة ، انقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلترا. ثم اشطف اللوحة بخمسة ملليلتر من وسائط USG وأضف هذا المحلول إلى أنبوب الطرد المركزي سعة 15 مل.

ثم الطرد المركزي لتعليق الخلية من 1000 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق بعد الطرد المركزي. استنشق الوسط دون إزعاج خلية الحبيبات ريوس. قم بتعليق الحبيبات في واحد إلى ثلاثة ملليلتر من وسائط USG حسب حجم الحبيبات.

باستخدام مقياس الخلوي الدموي ، احسب عدد الخلايا الظهارية والخلايا المهدبة في 10 ميكرولتر من تعليق الخلية. تظهر الخلايا الظهارية غير القولون ولها غشاء خلوي داكن واضح وسيتم رؤية الخلايا المهدبة الحية تتحرك. استبعاد خلايا الدم الحمراء من عدد الخلايا بعد تعداد الخلايا.

أضف وسائط كافية لتخفيف الخلايا الظهارية إلى 1.65 في 10 إلى الخلايا الخمس لكل 100 لتر. لطلاء الخلايا أولا ، قم بوضع 500 ميكرولتر من وسائط USG في آبار صفيحة 24 بئر. بعد ذلك ، ضع مرشح عابر بالبئر المطلي بالكولاجين في كل بئر ، وستقوم ماصة 100 ميكرولتر من تعليق الخلية أعلى الاتجاهات المطلية بالكولاجين ENC بإدخال اللوحة التي تحتوي على الخلايا في حاضنة زراعة الأنسجة لمدة 48 ساعة.

بعد هذا الوقت ، اشطف الجانب القمي من الملحق بعناية باستخدام وسائط USG والماصة من 50 إلى 100 ميكرولتر من الوسائط أعلى الغشاء. بعد ذلك ، استنشق الوسائط من الجانب القاعدي للفلتر. أدخل واستبدل بوسائط USG جديدة.

ثم أعد اللوحة إلى حاضنة زراعة الأنسجة. قم بتغيير الوسائط القاعدية كل يومين خلال فترة الثقافة. عندما تصل الثقافات إلى الطلاقة المشتركة المطلوبة لتطبيق معين.

استنشق الوسائط القاعدية من الآبار واغسل الثقافات بعناية باستخدام 200 ميكرولتر من PBS. كرر الغسيل مرتين. ترك الحجم النهائي من PBS في الآبار.

تتم معالجة الأغشية واحدة تلو الأخرى. أولا ، استنشق PBS من واحد. حسنا ، استخدم الملقط لإزالة غشاء البئر وقلب الملحق رأسا على عقب.

بعد ذلك ، استخدم مشرطا معقما لعمل جروح مستقيمة حول حافة الغشاء. ثم استخدم الملقط لإزالة الغشاء من الملحق في قطعة واحدة. يمكن بعد ذلك معالجة المرشح وفقا للإجراءات القياسية للتطبيق المطلوب.

تظهر صورة المجال الساطع هذه التي تم التقاطها بتكبير 10 مرات سطح غشاء الثقب بعد الطلاء بالكولاجين هنا ، تظهر صورة أخرى تم التقاطها بتكبير 10 مرات الخلايا الظهارية لقناة فالوب مستزرعة إدخالات مغلفة بالكولاجين حيث تشكل طبقة ظهارية. يشير السهم إلى وجود حطام خلوي قد يلتصق بالخلايا المهدبة. توضح هذه الصورة الميدانية التي تم التقاطها بتكبير 20 مرة وجود طبقة صحية من الخلايا الظهارية لقناة فالوب في المزرعة.

تظهر صورة المجهر الفلوري هذه تلطيخا مناعيا فلورية للمزارع الظهارية لقناة فالوب مع مضاد PAX ثمانية ، علامة على الخلايا الإفرازية باللون الأحمر ونقطة في البوصة. علامة نووية موضحة باللون الأزرق هنا ، ينظر إلى كل من PAX eight و DPI على أنهما متداخلان في هذه الصورة المدمجة. توضح هذه الصورة تلطيخ الفلورسنت المناعي للمزارع الظهارية لقناة فالوب مع الخلايا المضادة.

اثنان ، علامة على الخلايا المهدبة باللون الأحمر ونقطة في البوصة ، وهي علامة نووية تظهر باللون الأزرق. ينظر إلى كل من الخلية الثانية و DPI على أنهما متداخلان في هذه الصورة المدمجة بعد هذا التطور. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال سرطان المبيض لاستكشاف دور قناة فالوب كموقع جديد لأصل سرطان المبيض المصلي.