قياس حركية النسخ مرنا في الخلايا الحية واحدة

الهدف العام من التجربة التالية هو قياس بوليميراز الحمض النووي الريبي اثنين من ديناميكيات النسخ في الخلايا الحية أثناء نسخها من جين معين في الوقت الفعلي. من أجل متابعة النسخ على تسلسل جيني معين ، يتم دمج بنية الجينات بثبات في خط خلية بشرية. يدخل هذا الجين في عدة نسخ في موقع عشوائي واحد في الجينوم ويشكل جرادا جينيا يحتوي على مجموعة ترادفية من هذا الجين المحدد.

عندما يتم تنشيط التعبير الجيني ، يتم تجنيد بوليميراز الحمض النووي الريبي الثاني في الجين ويتحرك في اتجاه مجرى النهر على طول خيط الحمض النووي ، مما يولد جزيء الرنا المرسال من أجل وضع علامة على mRNA المنسوخة واكتشافها. تم دمج سلسلة من التسلسلات الفريدة أو MS ، وتكراران يعملان كمواقع ربط لبروتين الفلورسنت YFP MS ، في التسلسل الجيني. يتوافق معدل تكوين حلقتي MS STEM مع معدل النسخ ، أو الاسترداد الفلوري ، بعد التبييض الضوئي أو FP ، ثم يتم استخدامه للكشف بصريا عن النسخ المستمر.

يتم توجيه شعاع ليزر قوي إلى موقع النسخ النشط لتبييض جزيئين من YFP MS ، ويتبع استعادة التألق. يعكس معدل استرداد إشارة التألق معدل نسخ بوليميراز الحمض النووي الريبي الثاني. يتم الحصول على منحنى استرداد يوضح قياس الزيادة في YFP MS شدتين في موقع النسخ.

بمرور الوقت ، يمكن بعد ذلك استخراج حركية النسخ من هذه البيانات. تظهر النتائج التي تم الحصول عليها أنه يمكن قياس معدلي استطالة بوليميراز الحمض النووي الريبي في الجسم الحي وأن هذه القياسات أسرع بكثير من القياسات السابقة في المختبر. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الأساليب الحالية مثل الأساليب الكيميائية الحيوية ، هي أنه يمكننا هنا قياس الحركية داخل خلية حية واحدة على جين معين.

يمكن أن توفر هذه الطرق نظرة ثاقبة لعملية نسخ الرنا المرسال الأساسية التي تحدث في كل خلية من خلايا الجسم. يعد العرض المرئي لهذه الأساليب أمرا مهما حيث توجد عدة خطوات تتضمن أولا. نحن نجرب الخلايا تحت المجهر ، ويجب أن يتبعها تحليل البيانات باستخدام برامج الكمبيوتر من أجل تحليل حركية استطالة بوليميراز الحمض النووي الريبي على جين معين في الخلايا الحية.

يستخدم هذا البروتوكول خط خلية U2 OS البشري ، حيث جين بيتا أكتين متكامل بثبات هو منتج mRNA ، ويمكن تصنيف منتج البروتين النهائي بالفلورسنت. يظهر هنا تمثيل تخطيطي لبناء جين CFP beta actin الذي تم دمجه في خلايا U2 OS. يتم تحقيق الحث النسخي من الحد الأدنى من محفز CMV عن طريق ربط منشط النسخ العكسي للتتراسيكلين بالعناصر المستجيبة أو tres في وجود الدوكسيسيكلين ، يحتوي mRNA المنسوخ على تسلسل الطلاء ل CFP Beta Acton و 24 MS تكرارين مرتبطين ببروتين اندماج YFP MS.

سيظهر موقع النسخ النشط باللون الأصفر بسبب ارتباط بروتينين YFP MS. سيظهر الهيكل الخلوي أكتون باللون الأزرق بسبب CFP الموسومة Acton قبل 48 ساعة من التعافي الفلوري بعد التبييض الضوئي أو تجربة F frappe ، قم بإعداد خلايا U2 OS لبذور التعداء مرتين تقريبا 10 إلى الخلايا الخامسة على أطباق زراعة الأنسجة ذات القاع الزجاجي ، وإضافة ملليلترين من الوسط إلى الخلايا من أجل الوصول إلى 50 إلى 80٪ التقاء احتضان الخلايا بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية بعد 24 ساعة ، قبل 24 ساعة من تجربة الفراك ، قم بنقل الخلايا بشكل عابر باستخدام YFP MS 2 الذي يعبر عن علامة الفلورسنت لوضع علامات على mRNA. يحتوي بناء YFP MS two على تسلسل توطين نووي أو NLS يوفر دخولا نوويا لبروتين YFP MS الثاني.

احتضان الخلايا لمدة 12 ساعة على الأقل عند 37 درجة مئوية للحصول على تعبير جيد عن البروتينات العابرة المنقولة. قبل ست إلى 12 ساعة من التجربة ، أضف الدوكسيسيكلين إلى الخلايا لتنشيط جين الأكتين المحفز CFP المحفز TED ، ويعيد الخلايا إلى حاضنة 37 درجة مئوية. نظرا لأن تجربتنا طويلة نسبيا ونحن نتبع موضع صغير واحد داخل النواة ، فمن المهم أن نكون قادرين على الحفاظ على موقع نسخ موضع الجينات في بؤرة التركيز طوال التجربة بأكملها.

تطلب ذلك تصويرا سريعا ثلاثي الأبعاد بمرور الوقت. لذلك ، نستخدم نظام 3D FRA بدلا من مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر. قبل نصف ساعة من تجربة الخلية الحية ، قم بتشغيل جهاز التسخين والمجهر والليزر.

المعدات المستخدمة في هذا العرض التوضيحي هي نظام frap ثلاثي الأبعاد مبني على مجال واسع ، مجهر أوليمبوس التاسع 81 ، ومجهز ب EM CCD يمكنه الحصول على صور بسرعة عالية تصل إلى 30 صورة في الثانية. تم تجهيز المجهر بأربعة مصادر ضوء Lambda DG ومرحلة x و y و Z تسمح بالتصوير السريع والدقيق. في المحور Z ، يتم دمج جميع المعدات والتحكم فيها بواسطة برنامج التحويل.

يتم إجراء التجربة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 باستخدام نظام غرفة الخلية الحية. لتجنب تغيرات التركيز خلال أوقات الاستحواذ الطويلة ، يجب أن تظل درجة الحرارة ثابتة أثناء التجربة. بعد مزامنة الليزر والكاميرا ، يجب اختيار خلية مرشحة جيدة للتجربة.

يجب أن تكون الخلية الجيدة معروضة موقع نسخ YFP MS واضح فوق خلفية YFP MS المنتشرة ، و B ، تحتوي على ما يكفي من بروتين YFP MS الحر في الخلية حتى تتمكن من التعافي تماما بعد تبييض الصورة. بعد ذلك ، اختر شروط القياس المناسبة. يتطلب إجراء الأخوة الحصول على العديد من الصور.

لذلك ، من المهم الموازنة بين أوقات التعرض المعقولة واستخدام أقل إضاءة منخفضة قدر الإمكان. لتقليل خلايا التبييض الضوئي في قناة YFP ، يجب تصويرها بأوقات تعرض تبلغ 150 مللي ثانية لكل عملية اكتساب. سيتم أخذ سبع شرائح Z كل 350 نانومتر.

سيتم تبييض موقع النسخ النشط باستخدام ليزر 491 نانومتر. سيتم الحصول على صور ما بعد التبييض في سلسلة من ثلاثة ترددات زمنية ، و 15 صورة كل ثلاث ثوان ، و 15 صورة كل ست ثوان ، و 26 صورة كل 30 ثانية. بعد اختيار خلية مناسبة وظروف قياس مناسبة ، قم بإجراء التجربة الكاملة ولكن بدون تبييض للتحقق من أن فعل موقع النسخ وظيفي ومستقر في حالة مستقرة.

يختبر هذا ظروف التصوير عن طريق قياس إجمالي التبييض الضوئي الناجم عن سلسلة التصوير الكاملة. بعد ذلك ، قم بإجراء تجربة frab. أولا ، احصل على ست صور مسبقة.

ثم استخدم الليزر 491 نانومتر لتبييض إشارة YFP MS الثانية في موقع النسخ النشط والحصول على صور ما بعد التبييض في سلسلة من ثلاثة ترددات زمنية. 15 صورة كل ثلاث ثوان ، و 15 صورة كل ست ثوان ، و 26 صورة كل 30 ثانية. يتم تحليل بيانات D frap الأربعة باستخدام برنامج تحليل الصور المجاني. صورة.

يتم عرض مكدسات JZ بأقصى قدر في كل نقطة زمنية مما يؤدي إلى فيلم ثنائي الأبعاد بمرور الوقت. لمزيد من التحليل ، يتم تتبع موقع النسخ في كل إطار ويتم قياس متوسط الشدة. باستخدام أداة تعقب البقعة ، يتم حفظ البيانات في ورقة Excel لمزيد من التحليل باستخدام محلل السلاسل الزمنية ، أو المكون الإضافي للصورة J. قم بقياس متوسط الشدة في مناطق الاهتمام الأخرى أو عائد الاستثمار لكل نقطة زمنية على النحو التالي ، وقياس الخلفية من عائد الاستثمار خارج الخلية B قياس عائد الاستثمار في النيوكليوبلازم الذي يبعد قدر الإمكان عن موقع التبييض و C ، قم بقياس موقع النسخ بعد تصحيح التبييض الضوئي أثناء التصوير ، وتطبيع البيانات لما لا يقل عن 10 تجارب من أجل استرداد المعلمات الحركية من هذا النوع من مجموعة البيانات.

أبسط نموذج موصوف يمكن أن يناسب هذا النوع من البيانات الموضح هنا هو مخطط النموذج الذي يصف حركية الدخول والخروج من mRNAs المميزة بجزيئين YFP MS في موقع النسخ. يحتوي هذا النموذج على المعادلات التالية التي تصف المخطط. بوجود معلمات النموذج ، من الممكن حساب معدل الاستطالة باستخدام هذه المعادلة.

يظهر هنا مثال على خلية تم فيها تبييض موقع النسخ النشط بالصور ، وتم تتبع استعادة التألق بمرور الوقت. تم قياس شدة التألق لكل من مواقع النسخ النشطة المبيضة وغير المبيضة. يوضح هذا الرسم البياني القياسات التجريبية التي تم إجراؤها على CFP ACT ومواقع نسخ الجينات.

منحنيات الاسترداد لقياسي YFP MS اثنين من FP باللون الأزرق لإشارة YFP MS الثانية في موقع النسخ. بمرور الوقت في خلية غير مبيضة من نفس التجربة ، أعطت إشارة ثابتة تشير إليها النقاط الحمراء ، مما يعني أن هذا الجين حاليا في حالة مستقرة نسبيا. تم تحليل منحنى الاسترداد لقياس YFP MS two frap باستخدام Berkeley Madonna لإنشاء هذه المحاكاة المناسبة.

يتم عرض المخلفات المحسوبة للملاءمة في الأسفل. أخيرا ، يتم عرض نتائج النموذج في جدول المعلمات هذا. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال النسخ ، مثل معدلات النسخ أو في الجسم الحي وأي عمليات نسخ COP تؤثر على الحركية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية متابعة عملية النسخ في الوقت الفعلي. يمكن توسيع هذه التقنية لتتبع حركية عوامل النسخ الأخرى أو عوامل معالجة MNA بنشاط على نسخ الجينات بنشاط.