عزل خلايا RPE و IPE من عين البقر: إجراء لحصاد واستزراع الخلايا الظهارية الصبغية الأولية للبقر

في عين الفقاريات ، الخلايا الظهارية المصطبغة ، PECs ، هي خلايا متوازية المستطيلات تحتوي على حبيبات الميلانين - صبغة واقية من الضوء. تصطف على جانبها المصفوفة خارج الخلية وترتبط ببعضها البعض بواسطة تقاطعات ضيقة. الطبقة الأحادية PEC المجاورة لشبكية العين هي ظهارية صبغة الشبكية ، RPE ، الخلايا. تسمى طبقة PEC من القزحية اسم القزحية الظهارية ، IPE ، الخلايا.

لعزل خلايا IPE و RPE البقرية ، ابدأ بعين البقر. اغمر العين في مطهر مناسب للتخلص من أي تلوث ميكروبي من سطحها. شق محيط القزحية بعناية لفصل الجزء الأمامي عن الجزء الخلفي.

من الجزء الأمامي ، قم بإزالة العدسة للكشف عن القزحية. علاوة على ذلك ، افصل الجسم الهدبي عن القزحية. وفي الوقت نفسه ، قم باستئصال الخلط الزجاجي وشبكية العين من بصلة العين الخلفية. عالج القزحية وبصلة العين بالتربسين.

يحلل التربسين مكونات كل من التقاطعات الضيقة بين الخلايا الظهارية المصطبغة والمصفوفة خارج الخلية ، مما يؤدي إلى تفكك الخلية. الآن ، استبدل التربسين من القزحية وبصلة العين بوسائط مناسبة. اكشط الأنسجة برفق لتحرير خلايا IPE و RPE المنفصلة في الوسائط.

انقل معلقات الخلية إلى أنابيب وأجهزة طرد مركزي. أعد تعليق كريات الخلية في الوسائط والبذور في ألواح متعددة الآبار. احتضان ، مما يسمح لخلايا IPE و RPE بالالتصاق والتكاثر.

بعد التنظيف ، افتح العين واقطع حول القزحية لإزالة الجزء الأمامي ، ثم ضعه في طبق بتري. اترك البصلة مع الجسم الزجاجي حتى يتم عزل خلايا RPE.

لعزل خلايا IPE ، إذا كانت العدسة تأتي مع الجزء الأمامي ، فقم بإزالة العدسة ، واستخدم ملقطا دقيقا لسحب القزحية التي تحتوي على خلايا IPE بدقة. ضع القزحية في طبق بتري واغسلها باستخدام PBS معقم. قطع الجسم الهدبي بمشرط # 10. بعد تحضير القزحية ، احتضنها ب 2 مل من 0.25٪ تربسين عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.

قم بإزالة التربسين وأضف 2 مل من الوسط الكامل. بعد ذلك ، قم بعزل الخلايا عن طريق الخدش بماصة باستور مصقولة بالنار. انقل معلق الخلية إلى أنبوب سعة 2 مل ، وقم بالطرد المركزي للخلايا لمدة 10 دقائق عند 120 × جم.

تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا في 2 مل من الوسط الكامل. بذرة 0.32 مليون خلية لكل بئر في صفيحة من 6 آبار في 3 مل من الوسط الكامل. ضع الطبق في حاضنة ، وقم بزراعته عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

لعزل خلايا RPE ، قم بإزالة الخلط الزجاجي وشبكية العين من الجزء الخلفي باستخدام الملقط. تجنب إتلاف ظهارة صبغة الشبكية. اغسل المصباح باستخدام PBS. بعد تحضير كلتا العينين ، املأ البصلة بحوالي ثلاثة أرباع التربسين ، واحتضنها لمدة 25 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، مع غطاء طبق بتري أعلى عين المصباح.

قم بإزالة التربسين وأضف 1 مل من الوسط الكامل. باستخدام ماصة باستور منحنية مصقولة بالحريق، قم بإزالة خلايا RPE. اجمع تعليق الخلية داخل المصباح ، وانقله إلى أنبوب سعة 1.5 مل لإعادة التعليق.

قم بالطرد المركزي للخلايا لمدة 10 دقائق عند 120 × جم. قم بزرع 0.32 مليون خلية لكل بئر في صفيحة من 6 آبار في 3 مل من الوسط الكامل. ضع الطبق في حاضنة ، وقم بزراعته عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.