5-ميثيل سيتوزين نقطة لطخة لتحديد مدى مثيلة الحمض النووي

مثيلة الحمض النووي هي تعديل جيني يتضمن إضافة مجموعة ميثيل إلى قاعدة السيتوزين للحمض النووي لتشكيل 5-ميثيل سيتوزين. هذا التعديل يغير التعبير الجيني.

لتحديد مثيلة الحمض النووي عبر اللطخة النقطية ، خذ عينات من الحمض النووي الجيني المشتقة من الخلايا الغضروفية البشرية في مراحل مختلفة من إزالة التمايز التي تظهر مستويات مختلفة من السيتوزين الميثيلي.

عالج عينات الحمض النووي بهيدروكسيد الصوديوم — وهو قلوي قوي — وقم بتسخينها. يكسر هذا العلاج الروابط الهيدروجينية بين خيوط الحمض النووي ، مما يؤدي إلى تمسخ الحمض النووي. أضف أسيتات الأمونيوم لتحييد القلويات ، ومنع التدهور المفرط للحمض النووي.

خذ غشاء من النايلون وحدد عينات الحمض النووي المشوهة كنقاط. يرتبط الحمض النووي سالب الشحنة بغشاء النايلون موجب الشحنة عبر التفاعلات الكهروستاتيكية ، مما يؤدي إلى نشافه على الدعم الصلب.

عالج الغشاء النشاف بمخزن مانع لمنع الارتباط غير المحدد. بعد ذلك ، أضف الأجسام المضادة ل 5-methylcytosine إلى الغشاء ، واحتضنها. ترتبط هذه الأجسام المضادة حصريا بالسيتوزين الميثيلي على الحمض النووي.

اغسل لإزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة ، وأضف الأجسام المضادة الثانوية المترافقة بالإنزيم الكيميائي والتي ترتبط على وجه التحديد بالأجسام المضادة الأولية.

أضف ركيزة كيميائية على الغشاء. يتفاعل الإنزيم الموجود على الجسم المضاد مع الركيزة لإنتاج تلألؤ كيميائي - مما ينتج عنه نقاط ذات شدة مختلفة.

قم بتصوير الغشاء وقياس شدة النقاط التي تتوافق مع مدى مثيلة الحمض النووي في كل عينة.

ابدأ هذا الإجراء عن طريق تغيير طبيعة الحمض النووي المعزول في هيدروكسيد الصوديوم 0.1 مولار لمدة 10 دقائق عند 95 درجة مئوية. قم بتحييد الحمض النووي باستخدام 1 أسيتات الأمونيوم المولية على الجليد ، ثم قم بتخفيف الطفين بالماء المقطر المزدوج.

الأكثر أهمية في اللطخة النقطية هي اكتشاف العينات على الغشاء ، والقيام بذلك ببطء وبعناية. حاول تقليل قطر كل منطقة مرقطة إلى 3 إلى 4 ملليمترات.

باستخدام طرف ماصة ضيق الفم، ضع بعناية 2 ميكرولتر من الحمض النووي الجيني المخفف المتسلسل على غشاء نايلون موجب الشحنة في وسط الشبكة. امسح الغشاء عند 80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، قم بسد مواقع ربط الأجسام المضادة غير المحددة عن طريق نقع الغشاء في 5٪ BSA في TBST في طبق بتري بطول 10 سم لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع رج لطيف.

بعد ساعة واحدة ، اغسل الغشاء ثلاث مرات في TBST لمدة 5 دقائق في كل مرة. احتضان الغشاء بجسم مضاد أحادي النسيلة مضاد للفأر المضاد ل 5-methylcytosine في TBST عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، اغسل الغشاء ثلاث مرات في TBST لمدة 5 دقائق في كل مرة.

بعد ذلك، احتضن بجسم مضاد ثانوي — الغلوبولين المناعي G المترافق مع بيروكسيداز الفجل الحار في TBST لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد غسل الغشاء في TBST كما كان من قبل ، أضف ركيزة الإنزيم إلى الغشاء ، واحتضن لمدة 5 إلى 10 دقائق. أخيرا ، تصور إشارة الجسم المضاد الثانوي باستخدام مجموعة تلألؤ كيميائي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.