عزل وثقافة الخلايا العصبية الحبيبية المخيخية الأولية للفأر

خذ دماغ جرو فأر تم حصاده حديثا.

افصل المخيخ وقم بإزالة طبقته الغشائية.

من الجانب البطني ، قم بإزالة شبكة الأوعية الدموية.

يقطع المخيخ إلى شظايا وينقل إلى أنبوب يحتوي على عازلة.

جهاز طرد مركزي وتخلص من المادة الطافية التي تحتوي على الحطام.

أضف التربسين ، وهو إنزيم محلل للبروتين ، لهضم المصفوفة خارج الخلية للأنسجة وفك الخلايا.

أضف مخزن مؤقت يحتوي على مثبط التربسين و DNase.

يوقف المثبط نشاط التربسين بينما يحلل DNase أي حمض نووي ملوث.

قم بفصل الأنسجة ميكانيكيا لتشكيل تعليق خلوي ، بما في ذلك الخلايا العصبية الحبيبية المخيخية والخلايا غير العصبية أو الدبقية.

نقل تعليق الخلية إلى أنبوب.

إضافة مخزن مؤقت. جهاز الطرد المركزي وإزالة المادة الطافية. إعادة تعليق الخلايا في الوسائط ووضعها على لوحات الثقافة المغلفة ب poly-D-lysine.

تلتصق الخلايا بالأسطح المطلية.

أضف مضادا للمستقلبات للقضاء على الخلايا الدبقية المتكاثرة وتوليد ثقافة نقية من الخلايا العصبية الحبيبية المخيخية.

لعزل المخيخ ، ضع الدماغ في محلول التشريح المكمل بكبريتات المغنيسيوم ، واحتفظ بالمحلول والدماغ على الجليد.

تحت مجهر التشريح ، قم بإزالة السحايا باستخدام ملقط دقيق. بعد ذلك ، قم بتشريح المخيخ من الدماغ في محلول تشريح مكمل بكبريتات المغنيسيوم. يساعد ذلك في تقشير السحايا المتبقية ويسمح للمرء بالدخول بين الطبقات لتنظيف طيات المخيخ.

وجود السحايا في الثقافة العصبية إلى خلايا غير صحية وموت الخلايا في نهاية المطاف. على هذا النحو ، من المهم ضمان الإزالة الكاملة للسحايا قبل الشروع في الاستزراع.

بعد ذلك ، قم بتحويل المخيخ إلى جانبه البطني وتأكد من إزالة الضفيرة المشيمية. بعد ذلك ، قم بتجميع المخيخ في طبق 35 ملم يحتوي على 1 مليلتر من محلول التشريح المكممل بكبريتات المغنيسيوم. قم بتقطيع الأنسجة إلى قطع صغيرة ، وانقلها إلى أنبوب سعة 50 مليلتر يحتوي على 30 مل من محلول التشريح المخزن بكبريتات المغنيسيوم.

في هذه الخطوة ، قم بالطرد المركزي لأنبوب سعة 50 مليلتر الذي يحتوي على الأنسجة الدماغية المفرومة لمدة خمس دقائق عند 644 مرة جم و 4 درجات مئوية. بعد ذلك ، قم بإزالة المادة الطافية ، وأضف 10 ملليلتر من محلول تشريح التربسين. ثم هز الطاولة بسرعة عالية لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية.

أضف 10 مل من محلول مثبط التربسين الأول إلى الأنبوب وقم بالصخور برفق لمدة دقيقتين. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للأنبوب لمدة خمس دقائق عند 644 مرة جم و 4 درجات مئوية. بعد خمس دقائق ، قم بإزالة المادة المطفية ، وأضف 2 مل من محلول مثبط التربسين الثاني قبل نقله إلى أنبوب سعة 15 ملليلترا.

بعد ذلك ، قم بتقطيع الأنسجة في أنبوب سعة 15 ملليلتر حتى يصبح المحلول غامضا. دعها تستقر لمدة خمس دقائق. ثم قم بإزالة المادة الطافية الصافية وانقله إلى أنبوب جديد يحتوي على 1 مليلتر من محلول التشريح المكمل بكلوريد الكالسيوم.

أضف 2 مل أخرى من محلول مثبط التربسين II إلى قاع الأنبوب الذي يحتوي على الحبيبات. ثلاثي الأبعاد مرة أخرى واتركها تستقر لمدة خمس دقائق. قم بإزالة المادة الطافية وأضفها إلى الأنبوب الذي يحتوي على مادة طافية من الخطوة السابقة. كرر هذه العملية حتى يتم فصل معظم الأنسجة ميكانيكيا.

أضف 0.3 مل من محلول التشريح المكمل بكلوريد الكالسيوم إلى مجموعة المواد الطافية لكل مليلتر من المادة الطافية. امزج محتويات الأنبوب ثم جهاز الطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند 644 مرة جم في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بإزالة المادة الطافية. أضف 10 مل من الوسائط الطازجة إلى الحبيبات واخلطها.

بعد ذلك ، عد الخلايا الحية وقم بتخفيفها إلى تركيز 1.5 × 10⁶ خلايا لكل مليلتر. ضع الخلايا على ألواح poly-D-lysine المعدة مسبقا. بالنسبة للألواح المكونة من أربعة آبار ، ضع 0.5 مل من العينة ، مع إعطاء 7.5 × 10⁵ خلايا لكل بئر. بالنسبة للأطباق مقاس 35 ملم ، قم بإضافة 4 ملليلتر من العينة ، مع إعطاء 6 × 10⁶ خلايا لكل لوحة. بالنسبة للأغطية ، طبق 0.5 مل ، يعطي 7.5 × 10⁵ خلايا لكل بئر.

بعد 24 ساعة ، أضف AraC اثنين من الألواح لتقليل التلوث الدبقي. إذا كان سيتم الحفاظ على الخلايا لمدة سبعة إلى ثمانية أيام ، كرر هذا العلاج في اليوم 3 ، وحافظ على المزارع في حاضنة ثاني أكسيد الكربون_{بنسبة 5}٪ عند 37 درجة مئوية.