توليد نثرة العقدة الجذرية الظهرية وزراعة الخلايا المنفصلة

ابدأ بالعقدة الجذرية الظهرية أو أنسجة DRG في وسط خال من المصل. يحتوي نسيج DRG على خلايا عصبية حسية وخلايا دبقية ساتلية مدمجة في المصفوفة خارج الخلية ، ECM.

ضعيها في طبق مزرعة مغطى بخليط بروتين هلامي لتعزيز التصاق الأنسجة.

بمرور الوقت ، تطلق الخلايا الدبقية عوامل نمو التغذية العصبية التي تسمح بامتدادات الخلايا العصبية ، مما يؤدي إلى إنشاء ثقافة نبتة DRG.

لتطوير مزرعة خلوية منفصلة ، خذ هذه التحويلات DRG في أنبوب. عالجهم بالكولاجيناز لتحلل ECM ثم باستخدام التربسين ، الذي يعطل اتصالات الخلايا ، ويطلق الخلايا العصبية والخلايا الدبقية.

أضف وسيطا غني بالمصل لوقف التفاعل الأنزيمي.

قم بضرب المحتويات بشكل متكرر لإنشاء تعليق أحادي الخلية وتصفيته لإزالة الحطام.

الطرد المركزي هذا المعلق الخلوي وإزالة المادة الطافية المحتوية على الإنزيم.

أعد تعليق الخلايا في وسط عصبي القاعدي وانقلها إلى صفيحة مطلية بالصفيحة.

تلتصق الخلايا الدبقية الساتلية والخلايا العصبية الحسية بالصفيحة المغلفة باللون اللامينين ، مما يؤسس ثقافة خلوية منفصلة.

انقل كل DRG إلى طبق بتري زجاجي جاف. تحت المجهر الجراحي ، قم بتنظيف وتقليم الألياف الزائدة والأنسجة الضامة التي لا تزال متصلة ب DRG باستخدام شفرة. يمكن التعرف على DRG بسهولة على أنه هيكل منتفخ وشفاف على طول العصب الشوكي الأبيض وغالبا ما توجد الأوعية الدموية المحيطة ب DRG.

بعد ذلك ، ضع المنظف في DRG في طبق بتري جديد يحتوي على وسائط باردة وخالية من المصل. خفف خليط البروتين الجيلاتيني في وسائط باردة وخالية من المصل بنسبة 1 إلى 1. بعد ذلك ، قم بوضع DRG ex vivo في ألواح مكونة من 12 بئرا ، مطلية مسبقا ب 10 أو 20 ميكرولترا من خليط البروتين الجيلاتيني ، واحتفظ بها عند 37 درجة مئوية لمدة 30 إلى 60 دقيقة.

الآن ، أضف برفق 1.5 إلى 2 مل من الوسائط الخالية من المصل إلى نظام الاستزراع لتغطية المصنع بالكامل والحفاظ على النباتات في ظروف الزراعة. قم بتغيير وسط نمو DRG كل 72 ساعة. ودع DRG ينمو طالما دعت الحاجة.

هذه خطوة حاسمة لأن DRG مثبت على اللوحة الزجاجية باستخدام مزيج البروتين الجيلاتيني. لذلك، يعد وقت البلمرة ومهارات سحب العينات أمرا بالغ الأهمية لتجنب الطفو.

في هذا الإجراء ، ضع كل DRG التي تم جمعها في أنبوب معقم سعة 1.5 مليلتر مع وسائط F12 تحتوي على الكولاجيناز IV ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة. بعد ذلك ، استبدل الوسائط الجديدة التي تحتوي على الكولاجيناز IV ، واحتضن العينة لمدة 45 دقيقة أخرى. بعد ذلك ، عالج النباتات ب 2 مل من وسائط F12 التي تحتوي على 0.025٪ تريبسين عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

مباشرة بعد علاج الكولاجيناز الوريدي ، احتضنها ب 2 مل من وسائط F12 التي تحتوي على مصل بقري للجنين عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، اغسل النباتات ثلاث مرات باستخدام 2 مل من وسائط F12 ، واستمر في فصلها ميكانيكيا بماصة زجاجية ، حتى تصبح الوسائط غائمة.

بعد ذلك ، قم بتصفية ثقافة الخلايا المنفصلة من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر لإزالة أي شوائب ونسيج ضام زائد. ثم ، قم بالطرد المركزي لمحلول الخلية المفلترة لمدة دقيقتين. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق حبيبات الخلية في 500 ميكرولتر من الوسائط القاعدية العصبية. ضع الخلايا المنفصلة على شرائح مغطاة بطبقة من اللامينين بكثافة خلوية مفضلة.