Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.
ابدأ بلوحة أجار تحتوي على Caenorhabditis elegans المعدلة وراثيا التي تعبر عن بروتينات الفلورسنت الخضراء أو GFPs في الخلايا العصبية الخاصة بها.
أضف الماء المعقم إلى الطبق ، ولفه لرفع الديدان ، وانقلها إلى أنبوب.
اترك الديدان تستقر ، ثم قم بإزالة الماء الزائد وأعد تعليقها.
انقل الديدان المعلقة إلى طبق مغطى بمبيدات حشرية ولوحة تحكم بدون مبيدات حشرية ، ثم احتضنها.
بناء على أفعالهم ، يضر المبيد على وجه التحديد ببعض الخلايا العصبية ويسبب تورما في الخلايا العصبية ، مما يقلل من تعبير GFP.
انقل الديدان إلى وسادة الاغاروز التي تحتوي على عامل مخدر ، ثم ضع غطاء غطاء.
قم بتركيب الشريحة على مجهر الفلورسنت. أولا ، تصور الديدان باستخدام وضع تباين الطور ، ثم قم بالتبديل إلى وضع التألق.
في الديدان المعالجة بالمبيدات الحشرية ، تظهر الخلايا العصبية انخفاضا في التألق ، وتورم السوما ، وفجوات في العمليات العصبية ، مما يشير إلى التأثيرات التنكسية العصبية.
أثناء السيطرة ، تظهر الخلايا العصبية السليمة سوما سليما مع تألق لامع.
باستخدام مكان ماصة دقيقة، 1 مليلتر من الماء المعقم على صفيحة الديدان الخيطية. بعد ذلك ، قم بتحريك الماء لرفع الديدان الخيطية. ثم قم بإزالة السائل مع الديدان الخيطية إلى أنبوب ميكروفوج سعة 1.5 ملليلتر. بعد 10 دقائق ، عندما تستقر الديدان الخيطية بالجاذبية ، قم بإزالة ما لا يقل عن 500 ميكرولتر من الماء بعناية وتخلص منها.
بعد ذلك ، أعد تعليق الديدان الخيطية ، وباستخدام طرف ماصة صفراء مقطوعة ، قم بإزالة 50 إلى 100 ميكرولتر من الديدان العالقة إلى كل لوحة معالجة ، مع التأكد من أن كل لوحة تحتوي على 10 ديدان بالغة على الأقل. قم بإعداد شريحتين عن طريق وضع قطعة من شريط الملصق على جانب واحد فقط من الشريحة لتشكيل وسادة بسماكة موحدة.
بعد ذلك ، ضع شريحة نظيفة غير مستخدمة بينهما على سطح المنضدة. ضع قطرة سعة 10 ميكرولتر من الاغاروز المذاب في وسط الشريحة باستخدام ماصة دقيقة. بعد ذلك ، قم بتسطيح القطرة عن طريق وضع شريحة نظيفة أخرى في الأعلى بشكل عمودي على الشريحة مع القطرة والضغط حتى تشكل قطرة الاغاروز سمك شريط الوسم.
بعد ذلك ، قم بالضغط بثبات لفصل الشريحتين. بعد ذلك ، ضع الشريحة مع وضع جانب الأجار لأعلى على سطح الطاولة ، واتركها تجف لمدة دقيقة إلى دقيقتين قبل الاستخدام. لإضافة الديدان الخيطية إلى الشريحة المحضرة باستخدام وسادة الاغاروز ، أضف قطرة ماء سعة 5 ميكرولتر تحتوي على 1 مول من أزيد الصوديوم إلى وسادة أجار ، والتي ستعمل على تخدير الديدان وتعبئتها.
بعد ذلك ، انقل ما لا يقل عن 10 ديدان خيطية لكل شريحة معالجة إلى القطرة باستخدام عودة دودة ، والتي يجب تعقيمها قبل وبعد نقل الديدان الخيطية. بعد ذلك ، أضف غطاء باستخدام ملقط عن طريق وضعه بزاوية وخفضه ببطء.
بعد ذلك ، ضع الحامل الرطب المحضر على مجهر الفلورسنت لمراقبة الديدان ، أولا تحت تكبير 10x وتباين الطور ، ثم تحت تكبير 40x مع تباين الطور وإضاءة الفلورسنت.
ضع حاملا مبللا معدا في كل مرة على مرحلة المجهر وثبته في مكانه باستخدام مشابك مرحلة المجهر. بعد ذلك ، ابدأ في عرض الحوامل الرطبة بأقل هدف تكبير ، والذي يكون عادة 10x. واستخدم مجالا ساطعا أو تباينا في الطور لتصور الديدان الخيطية والتركيز عليها.
بمجرد وضع الديدان الخيطية في مجال الرؤية ، ركز عليها باستخدام مقبض التركيز الدقيق على المجهر. بعد ذلك ، قم بتبديل الإضاءة إلى التألق عن طريق تدوير القرص وتوجيه الضوء إلى الكاميرا لالتقاط الصور الرقمية.
بعد ذلك ، اضبط الإضاءة باستخدام برنامج التصوير بحيث تكون الخلايا العصبية مضاءة بشكل ساطع ، ولكن ليست مشبعة. في مرحلة ما ، احصل على صورة منفصلة لمسطرة بنفس التكبير مثل صور الخلية لتوفير مقياس تكبير لشكلها.
