تصوير الكالسيوم في الجسم الحي للمجموعات العصبية في العقد الجذرية الظهرية السليمة للفأر

خذ فأرا معدلا وراثيا مخدرا مع عقدة جذر ظهرية مكشوفة ، أو DRG ، وهي مجموعة من أجسام الخلايا العصبية الحسية التي تتلقى مدخلات من الأطراف الخلفية.

تعبر الخلايا العصبية في DRG عن مؤشر الكالسيوم السيتوبلازمي.

باستخدام المجهر متحد البؤر ، تصور DRG لتصوير النشاط الجماعي لعدد كبير من الخلايا العصبية.

بدون تحفيز خارجي ، يحافظ مستوى الكالسيوم المنخفض داخل الخلايا على المؤشرات في شكلها الأصلي ، مما يؤدي إلى تألق أساسي باهت.

ضع حافزا ميكانيكيا أو حراريا على مخلب خلفي ، مما يولد جهد فعل في الخلايا العصبية الحسية.

تنتشر الإشارة إلى DRG ، حيث تفتح قنوات الكالسيوم ذات الجهد الكهربائي في الخلايا العصبية ، مما يسمح بتدفق الكالسيوم.

ترتبط أيونات الكالسيوم الإضافية بالمؤشرات ، مما يؤدي إلى تغيير توافقي يزيد من شدة التألق.

لاحظ تألق ساطعا في DRG ، مع الشدة المقابلة لعدد الخلايا العصبية المحفزة التي تظهر تدفق الكالسيوم.

ضع الماوس على وسادة ساخنة للحفاظ على درجة حرارة الجسم عند 37 درجة مئوية. حدد موقع تضخم أسفل الظهر عن طريق تحسس عظم الحوض للفأر. ثم احلق الجزء الخلفي من الماوس فوق منطقة تضخم أسفل الظهر. باستخدام المقص ، قم بعمل شق مستطيل ثلاثي الجوانب فوق تضخم أسفل الظهر ، وقم بطي الجلد بعيدا بالملقط.

استخدم مقص تشريح زنبركي مقاس 13 ملم لعمل شقوق من 3 إلى 4 ملليمترات على الجانب الأيمن من العمود الفقري. استخدم المقص لقص الجلد والعضلات على الجانبين لكشف العمود الفقري. بعد ذلك ، باستخدام مقص 8 ملم ، قم بقطع العضلات والأنسجة الضامة لتنظيف العملية العرضية للجانب الأيمن L5 DRG.

حاول تقليل النزيف باستخدام رغوة القطن أو الجل لامتصاص الدم. اقطع العملية المستعرضة L5 على الجانب الأيمن باستخدام Friedman-Pearson rongeurs أو ملقط رفيع قوي ، مع الحرص على عدم لمس DRG. بعد ذلك ، حرك الماوس ولوحة التسخين إلى المرحلة المخصصة. استخدم شريط المسرح لتأمين ووسادة التدفئة في مكانها.

ضع أنف في مخروط الأنف لتخدير الأيزوفلوران المستمر. قم بتأمين المخلب الخلفي الأيمن البارز في وضع خارج المسرح لسهولة تطبيق المحفزات. قم بتثبيت العمود الفقري في مكانه باستخدام مشابك المرحلة فوق الجلد على الفقرات أو عظم الحوض ، فقط المنقارية والذيلية إلى L5 DRG. اضبط المشابك والمرحلة لجعل سطح DRG مستويا قدر الإمكان.

بعد ذلك ، ضع المرحلة أسفل المجهر بحيث يكون الهدف مباشرة 8 ملليمترات فوق DRG عند خفضه. أدخل مقياس حرارة المستقيم. قم بتوصيل خطوط الكهرباء بوسادة التدفئة في مقياس حرارة المستقيم. قم بتوصيل مخروط الأنف بخطوط غاز الأيزوفلوران.

استخدم مجهر متحد البؤر عمودي مع هدف 10x / 0.4 DIC والبرنامج المرتبط به للتصوير. استخدم إعدادات مرشح FITC الخضراء للإثارة عند 495 نانومتر ، والانبعاث عند 519 نانومتر ، والطول الموجي للكشف بين 500 إلى 580 نانومتر. تحت المجهر ، ابحث عن سطح DRG. اضبط المشابك على المسرح بحيث يكون سطح DRG مستويا قدر الإمكان ويتم تصور مساحة السطح القصوى في المستوى البؤري.

راقب طوال العملية للحفاظ على تخدير الأيزوفلوران دون تناول جرعات زائدة. لتحميل بروتوكول المسح السريع للمجهر ، استخدم الإعدادات النموذجية لحجم فوكسل 2.496 × 2.496 × 16 ميكرون ، 512 × 512 بكسل ، 10 شرائح بصرية z-stack ، 1 وحدة جيدة التهوية ل 32 ميكرومتر ، 1٪ طاقة ليزر 488 نانومتر و 5 مللي واط ، وقت البكسل - 1.52 ميكروثانية ، وقت الخط - 0.91 مللي ثانية ، وقت الإطار - 465 مللي ثانية ، سرعة مسح LSM 8 ، المسح ثنائي الاتجاه ، كسب كاشف PMD - 650 فولت ، والكسب الرقمي 1.

قم بإجراء مسح قصير من ثماني دورات ل DRG بالنقر فوق بدء التجربة ضمن علامة التبويب Acquisition. قم بإنشاء فيلم عن طريق إجراء عرض متعامد لعمليات المسح الضوئي بمسح ضوئي واحد لكل إطار بمرور الوقت. تحقق يدويا من وضوح الصورة وعناصر التصوير مثل موجات السطوع التي تعبر DRG. اضبط موضع المشبك وسمك المقطع البصري، وكرر هذه الخطوة حتى يتم الحصول على فيلم واضح وعالي الجودة.

ثم قم بتحميل بروتوكول المسح الضوئي عالي الدقة بالمجهر باستخدام الإعدادات النموذجية لحجم فوكسل 1.248 × 1.248 × 14 ميكرون ، 1024 × 1024 بكسل ، ست شرائح بصرية z-stack ، 1.2 وحدة جيدة التهوية أو 39 ميكرومتر ، طاقة ليزر 5٪ 488 نانومتر و 25 مللي واط ، وقت بكسل - 2.06 ميكروثانية ، وقت الخط - 4.95 مللي ثانية ، وقت الإطار 5.06 ثانية ، سرعة مسح LSM 6 ، المسح ثنائي الاتجاه ، كسب كاشف PMT عند 650 فولت ، والكسب الرقمي 1.

انقر فوق الزر "بدء التجربة" ضمن علامة التبويب "اكتساب" لإنشاء صورة عالية الدقة ل DRG. قم بتحميل بروتوكول المسح السريع للمجهر ، وسجل النشاط التلقائي في DRG لمدة 80 دورة. قم بإنشاء فيلم إسقاط متعامد ، وتحقق من أن الصورة ذات جودة كافية للتحليل. لتطبيق المحفزات ، اضبط المجهر لإجراء 15 إلى 20 عملية فحص. انتظر حتى تكتمل عمليات الفحص من 1 إلى 5 لإنتاج خط الأساس. تطبيق الحافز أثناء عمليات المسح من 6 إلى 10. انتظر خمس دقائق على الأقل بعد كل حافز قبل تطبيق الحافز التالي لمنع إزالة التحسس.

للضغط الميكانيكي ، أمسك قرصة مقياس التمجيد بالمخلب بين المجاذيف دون لمس المخلب. اضغط على المخلب بدءا مباشرة بعد نهاية الفحص 5 وتوقف مباشرة بعد المسح الضوئي 10. راقب قوة الضغط باستخدام مقياس اللومتر وتأكد من أنها لا تتجاوز 10 جم فوق القوة المطلوبة.

بالنسبة للمنبهات الحرارية ، قم بتسخين كوب من الماء إلى أعلى بقليل من درجة الحرارة المطلوبة. عندما يكون الماء في درجة الحرارة الصحيحة ، قم بتطبيق الحافز مباشرة بعد المسح 5 عن طريق غمر البركة في الماء. اسحب الدورق بعيدا مباشرة بعد المسح الضوئي 10.