في الجسم الحي من Electroporation Morpholinos في شبكية العين اسماك الزرد الكبار

الهدف العام من هذا الإجراء هو تثبيط أو تقليل تعبير بروتين معين في شبكية عين سمكة الزيبرا البالغة. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق إزالة القرنية الخارجية لعين السمكة، ثم يتم إحداث ثقب صغير في القرنية الداخلية للعين.

بعد ذلك، يتم حقن المورفو (morpho) الخاص بالجين في الجسم الزجاجي. وفي النهاية، يتم إدخال المورفو إلى خلايا الشبكية عن طريق التثقيب الكهربائي. وفي الختام، يمكن الحصول على نتائج تظهر انخفاضاً في تعبير البروتين المستهدف، وذلك إما عن طريق مجهر التألق المناعي لقطاعات أنسجة الشبكية، أو عن طريق اللطخة المناعية.

تمتد تداعيات هذه التقنية نحو علاج أمراض التنكس الشبكي مثل التهاب الشبكية الصباغي. وبفضل القدرة على توضيح الآليات الكامنة وراء تكاثر خلايا مولر الدبقية في الشبكية المتضررة، قد نجد طرقاً لتحفيز استجابة مماثلة عند تعرض الشبكية البشرية للتلف. ورغم أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤية حول تجدد الشبكية في شبكية سمكة الزيبرا البالغة، إلا أنه يمكن تعديلها قليلاً لتوفير معلومات حول عمليات أخرى في الشبكية، مثل دور بروتينات محددة في تحويل الضوء أو المعالجة البصرية.

توضيح الإجراء الذي طوره الدكتور Ryan Tummel أثناء عمله كباحث ما بعد الدكتوراه. سيتواجد في مختبري الدكتور Travis Bailey، وهو باحث ما بعد الدكتوراه حالياً في مختبري. قبل العمل مع الأسماك، قم بتحضير morphos موسومة بـ lissamine ذات شحنة موجبة والتي يمكن إدخالها في الخلايا عن طريق التثقيب الكهربائي، وذلك بتخفيف 300 NMO من Morpho في 100 µL من الماء الخالي من النوكلياز للوصول إلى محلول بتركيز 3 mM.

لإزالة الطبقة القرنية الخارجية، يتم تخدير أسماك الزبرا المترددة في عمر يتراوح من ستة إلى 12 شهراً باستخدام 1 mg/mL من tricaine أو ethanol بتركيز 2% في مياه حوض أسماك الزبرا. تُلف سمكة الزبرا في قطعة مبللة من المناديل الورقية بحيث تغطي الخياشيم مع ترك العين مكشوفة. توضع السمكة الملفوفة تحت مجهر ستيريو ويتم زيادة التكبير حتى يشغل قطر العين حوالي ثلث المجال البصري. بعد ذلك، وباستخدام ملاقط Dumont رقم 5، يتم الإمساك بالقرنية الخارجية بالقرب من الشق البصري عند موقع بروز أو شفة طفيفة لمنع خلع العين.

عند إزالة القرنية، قم بتثبيتها باستخدام مجموعة أخرى من الملاقط. ثم اسحب بزاوية منخفضة عبر العين لإزالة القرنية. مباشرة بعد إزالة القرنية الخارجية، استخدم مشرطًا بشفرة من الياقوت لإحداث شق صغير في القرنية عند نقطة التقاء الحدقة بالقزحية.

اسحب 0.5 µL من محلول morpho باستخدام سرنجة Hamilton مزودة بإبرة غير مدببة قابلة للإزالة بمقياس 33. قم بدفع السائل للأمام والخلف لإزالة أي فقاعات هواء من الخط. أدخل الإبرة بعناية في الجسم الزجاجي عبر الشق الجراحي.

لا تُدخل الإبرة بعمق زائد لتجنب ثقب الشبكية أو إزاحة العدسة. احقن محلول morpho ببطء في الحيز الزجاجي. سيتسرب الجسم الزجاجي عديم اللون من مكان الشق بينما يحل محله محلول morpho.

احقن حتى يتسرب مقدار صغير من المورفو من مكان الشق. يجب أن يكون المورينو الموسوم بصبغة الليسامين مرئيًا بوضوح داخل العين. بعد الحقن، أعد السمكة إلى الحوض للتعافي مع استخدام العين الأخرى كعينة ضابطة غير محقونة، واضبط معلمات التثقيب الكهربائي على نبضتين متتاليتين مدة كل منهما 50 millisecond عند 75 volts.

مع ترك فاصل زمني مدته ثانية واحدة بين النبضات بعد حقن حوالي 10 أسماك. أعد تخدير السمكة المحقونة ولفها في قطعة ورق مبللة. اجعل المنشفة تغطي الخياشيم فقط، مع ترك العين مكشوفة.

انقل الأسماك إلى طبق بتري مملوء بمادة التخدير. وباستخدام يدين ترتديان قفازات، ثبّت السمكة برفق في قاع الطبق المملوء بمادة التخدير، مع الحرص على غمر العين بالكامل. لاستهداف الشبكية الظهرية، اضغط برفق بالقطب الموجب لأسفل على النصف البطني للعين، مما يؤدي إلى تدوير العين وكشف الجزء الظهري من مقلة العين؛ وأثناء الاستمرار في الضغط على الجانب البطني، ضع القطب السالب على مسافة تتراوح من 0.5 إلى 1 مليمتر بعيداً عن النصف الظهري المكشوف للعين.

تجنب وضع القطب السالب مباشرة على العين لأن ذلك سيؤدي إلى تلف الشبكية الظهرية. بعد تحديد المسافة المناسبة بين الأقطاب الكهربائية، قم بضبط المسمار الموجود على مقبض الأقطاب للحفاظ على تباعد ثابت لعمليات التثقيب الكهربائي اللاحقة. قم بإجراء التثقيب الكهربائي للعين وأعد السمكة إلى حوض يحتوي على مياه حوض نظيفة للإنعاش، ثم أخضع السمكة فوراً لإجراء يسبب تغيرات في التعبير الجيني للشبكية، مثل التنكس الشبكي الناجم عن الضوء المستمر.

عندما يتم تقطيع الشبكيات من المنطقة الأنفية إلى الصدغية على المحور الظهري البطني، تمثل المربعات الزرقاء المظللة مناطق الشبكية الأكثر عرضة للتلف الناتج عن عملية التثقيب الكهربائي نفسها. ويمثل المربع الوردي المظلل المنطقة المستهدفة لإدخال الـ morpho إلى خلايا الشبكية عن طريق التثقيب الكهربائي. وكما هو موضح هنا في الصورة على اليمين بعد ثلاثة أيام من التثقيب الكهربائي، لا يزال ملصق lissamine مرئياً في جميع الطبقات وأنواع الخلايا في مقطع الشبكية، بما في ذلك القطع الخارجية للخلايا العصوية، والطبقة النووية الخارجية، والطبقة الضفيرية الداخلية، وطبقة الخلايا العقدية.

تظهر الصورة الفارغة على اليسار العين التي لم يتم حقنها، والتي تفتقر إلى أي مادة مورفولينو موسومة بالليسامين، ويمكن تحقيق التثبيط الكامل للبروتين خلال ثلاثة إلى خمسة أيام بعد عملية التثقيب الكهربائي اعتماداً على فعالية المورفولينو. في هذا المثال، تم إجراء تثقيب كهربائي لمورفولينو ضابط سلبي أو مورفولينو PCNA في الشبكية، ثم أُزيلت الشبكية بعد تعريضها للضوء لمدة يوم واحد أو يومين أو ثلاثة أيام، بعد ذلك تمت معالجة النسيج وصبغه مناعياً باستخدام أجسام مضادة لـ PCNA. لوحظ وجود العديد من الخلايا الموجبة لـ PCNA (باللون الأخضر) في جميع شبكيات المجموعات الضابطة الثلاث، بينما انخفض تعبير PCNA بشكل ملحوظ في الشبكيات المعالجة بالمورفولينو.

بمجرد إتقان هذه التقنية، يجب أن تكون قادراً على إجراء العملية لحوالي 20 سمكة في الساعة الواحدة. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر عدم ملامسة الأقطاب الكهربائية مباشرة لعين السمكة بعد هذه العملية. ويمكن استخدام طرق أخرى مثل الكيمياء النسيجية المناعية، والتهجين الموضعي، وتفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي (real time PCR)، واللطخة المناعية للإجابة على أسئلة إضافية، مثل المسارات الجينية المطلوبة في تجديد الشبكية.