إعداد الفايبرين 3D السقالات لتطبيقات الجذعية زراعة الخلايا

الهدف العام لهذا الإجراء هو إعداد سقالات الفيبرين ثلاثية الأبعاد لزراعة الخلايا الجذعية متعددة القدرات وتمييزها ، بما في ذلك الخلايا الجذعية الجنينية والمستحثة متعددة القدرات. يتم تحقيق ذلك عن طريق صنع محاليل الفيبرينوجين أولا وتحويلها بالكلى طوال الليل لإزالة الجزيئات التي تمنع البلمرة. تتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في بلمرة طبقة أساسية سفلية من الفيبرين في كل بئر من لوحة زراعة الأنسجة 24 بئر.

الخطوة الثالثة من الإجراء هي البذر. يشتق جسم الجنين الفردي من الخلايا الجذعية متعددة القدرات على الطبقة الأساسية من السقالة ، متبوعة بإضافة الطبقة الثانية من الفيبرين لإكمال التغليف. الخطوة الأخيرة من الإجراء هي إضافة وسائط زراعة الخلايا المناسبة إلى السقالات.

اعتمادا على التطبيق ، يمكن الحصول على نتائج في النهاية تظهر أن أجسام الأجنة المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات يمكن زراعتها بنجاح داخل الفيبرين ثلاثي الأبعاد ، السقالات القائمة على المواد الحيوية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على طرق زراعة الخلايا ثنائية الأبعاد التقليدية هي أنه يمكنك مراقبة سلوك الخلايا الجذعية ومعالجته في ثلاثة أبعاد. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول بيولوجيا الخلايا الجذعية عن طريق فحص عوامل مثل المركبات الكيميائية وعوامل النمو التي تؤثر على سلوك الخلايا الجذعية في بيئة مكروية ثلاثية الأبعاد ، يعتبر الفيبرينوجين بروتين مشتقا من الدم ، وبالتالي يجب إكمال التدريب المناسب على السلامة قبل التعامل معه.

للبدء ، قم بإزالة الفيبرينوجين المجفف بالتجميد من الثلاجة واتركه لمدة 20 دقيقة حتى يصل إلى درجة حرارة الغرفة ، أضف ثلاثة ملليلتر من محلول ملحي مخفض تريس إلى كل طبق بتري 35 ملم. قم بوزن ما يقرب من 100 إلى 130 ملليغرام من الفيبرينوجين ورشه على سطح TBS في كل طبق. انتظر خمس دقائق حتى يبدأ الفيبرينوجين في الدخول إلى المحلول.

ثم غطي طبق بتري بغطاء. احتضن أطباق بتري عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين للسماح للفيبرينوجين بالدخول بالكامل في المحلول. بعد ذلك ، قم بطي أنابيب غسيل الكلى الرطبة باستخدام TBS الطرف السفلي من الأنبوب وقم بتثبيت الطرف بأغلق بمشابك غسيل الكلى ، وقم بماصة محلول الفيبرينوجين من الأطباق إلى أنبوب غسيل الكلى.

ثم قم بطي الطرف العلوي وأغلقه بمشبك غسيل الكلى. ضع أنبوب غسيل الكلى الذي يحتوي على محلول الفيبرينوجين في وعاء سعة أربعة لترات من TBS. امزج المحلول.

باستخدام طبق تقليب مضبوطة على سرعة منخفضة ، قم بغسيل المحلول طوال الليل على الطبق لمدة 12 ساعة على الأقل. لا يحتاج محلول T Bs إلى التغيير خلال هذا الوقت تحت غطاء مزرعة الأنسجة المعقمة. قم بإزالة محلول الفيبرينوجين من أنبوب غسيل الكلى وضعه في أنبوب مخروطي الشكل.

قم بتصفية محلول الفيبرينوجين باستخدام مرشح حقنة خمسة ميكرون لإزالة الشوائب الكبيرة في المحلول. بعد ذلك ، استخدم مرشحا نقطيا 22 ميكرون لتصفية وتعقيم محلول الفيبرينوجين في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. بعد تحديد الحجم الكلي ، قم بقياس امتصاص محلول الفيبرينوجين عند 280 نانومتر ، غالبا ما يكون عامل التخفيف 50 ضروريا للحصول على امتصاص تحت واحد.

احسب تركيز البروتين الموجود في محلول الفيبرينوجين باستخدام المعادلة التالية حيث يساوي تركيز الفيبرينوجين بالملليغرام لكل مليلتر عامل تخفيف 80 مرة مقسوما على 1.55 ، حيث 1.55 هو معامل الانقراض عند اثنين 80 للفيبرينوجين البشري. بعد ذلك ، احسب كمية TBS اللازمة لتخفيف تركيز المحلول إلى 11.1 ملليغرام لكل مليلتر من الفيبرينوجين بناء على الحجم الأولي. سيكون التركيز النهائي للبروتين في سقالات الفيبرين 10 ملليغرام لكل مليلتر.

بعد البلمرة ، أضف 15 ميكرولترا من محلول الثرومبين 40 وحدة لكل مليلتر إلى الجانب الأيمن من كل بئر في الصف الأول من صفيحة 24 بئر ، ثم أضف 15 ميكرولترا من محلول كلوريد الكالسيوم 50 مليمول إلى الجانب الأيسر من كل منها. حسنا ، أضف أخيرا 270 ميكرولتر من محلول الفيبرينوجين إلى اللوحة. رج الطبق من جانب إلى آخر ومن الخلف إلى الأمام لخلط المحاليل.

دع الصف الذي يحتوي على المخاليط يتبلمر لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة ، تصبح السقالات أكثر غموضا لأنها تبلمر تستمر في صنع صفوف من الفيبرينوجين المبلمر واحدة تلو الأخرى حتى يتم الحصول على العدد المطلوب من سقالات الفيبرين. بعد آخر خمس دقائق من الحضانة ، احتضن الألواح عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة لبلمرة السقالات بالكامل. عند اكتمال الحضانة لمدة ساعة واحدة.

قم بزرع السقالة باستخدام رجل ماصة سعة 20 ميكرولتر لاختيار جسم جنين فردي ووضعه في وسط سقالة الفيبرين. تحقق بالمجهر من أن كل بئر يحتوي على جسم جنين واحد. أضف خمسة ميكرولترات من محلول الثرومبين وخمسة ميكرولترات من محلول كلوريد الكالسيوم 50 ملليمولار فوق كل جسم جنين ، متبوعا ب 90 ميكرولترا من محلول الفيبرينوجين لكل بئر ، يجب أن يشكل المحلول فقاعة تغلف جسم الجنين.

احتضان اللوحة لمدة ساعة إضافية عند 37 درجة مئوية لضمان البلمرة بعد الحضانة ، أضف ملليلترا واحدا من وسط زراعة الخلايا المناسب لكل بئر وضع اللوحة مرة أخرى في حاضنة 37 درجة مئوية. هنا ، يتم عرض صور تمثيلية للخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة بالفئران المزروعة على طبقات تغذية الخلايا الليفية الجنينية للفأر. باستخدام بروتوكول علاج حمض الريتينويك لمدة ثمانية أيام ، يتم حث الخلايا على تكوين أجسام جنينية ، وهي مجاميع من الخلايا التي تحتوي على أسلاف عصبية كما هو موضح هنا.

يوضح هذا الشكل ظهور جسم جنين مشتق من IPS بعد ثلاثة أيام من الزراعة داخل سقالات الفيبرين ثلاثية الأبعاد. تم الحصول على نتائج مماثلة سابقا باستخدام الخلايا الجذعية الجنينية للفأر. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية زرع أجسام الأجنة في سقالات فيبرين ثلاثية الأبعاد باستخدام هذه العملية التي تستغرق يومين.

لا تنس أن العمل مع الفيبرينوجين يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب اتخاذ الاحتياطات المناسبة ، بما في ذلك ارتداء معدات الحماية الشخصية والتخلص المناسب من النفايات أثناء تنفيذ هذا الإجراء.