Name: الاغاروز الكهربائي للهلام لفصل أجزاء الحمض النووي (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: تعلم تقنية الهلام الكهربائي للأجاروز لفصل أجزاء الحمض النووي بأحجام مختلفة. تتيح هذه الطريقة تصور النطاقات وتحديد أحجام الأجزاء بدقة في البحوث الجزيئية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. إعداد جيل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزن خارج الكتلة المناسبة من الاغاروز الى دورق مخروطي. وتعد المواد الهلامية الاغاروز باستخدام AW / الخامس حل مئوية. سيكون تركيز الاغاروز في جل تعتمد على أحجام شظايا من الحمض النووي يمكن فصلها، مع معظم المواد الهلامية التي تتراوح بين 0.5٪ -2٪. وينبغي أن حجم المخزن المؤقت لا يكون أكبر من 1/3 من قدرة قارورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة إلى تشغيل العازلة القارورة التي تحتوي على الاغاروز. دوامة لخلط. الجل الأكثر شيوعا تشغيل مخازن هي تاي (40 ملم تريس، خلات، 1 ملم EDTA) وTBE (45 مم، تريس بورات، 1 ملم EDTA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يذوب الخليط الاغاروز / العازلة. هو الأكثر شيوعا ويتم ذلك عن طريق تسخين في الميكروويف، ولكن يمكن أيضا أن يتم على نار بنسن. على فترات ق 30، إزالة قارورة وعباب المحتويات إلى مزيج جيد. كرر حتى الاغاروز قد حلت تماما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة إيثيديوم بروميد (EtBr) إلى تركيز 0.5 ميكروغرام / مل. بدلا من ذلك، يمكن أيضا أن جل ملطخة بعد الكهربائيةرحلان في تشغيل العازلة التي تحتوي على 0.5 ميكروغرام / مل EtBr عن 15-30 دقيقة، تليها destaining في تشغيل المخزن المؤقت لمدة متساوية من الزمن. </li></ol> ملاحظة: EtBr هو مادة مسرطنة مشتبه بهم، ويجب التخلص منها بطريقة صحيحة في لوائح المؤسسة. وينبغي دائما أن ترتديه قفازات عند التعامل مع المواد الهلامية التي تحتوي على EtBr. الأصباغ البديلة لتلطيخ من الحمض النووي متاحة، ومع ذلك لا يزال EtBr الأكثر شعبية واحدة نظرا لحساسيتها والتكلفة. <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح لتبريد الاغاروز إما على الفوق أو حضانة في حمام ماء 65 درجة مئوية. وعدم القيام بذلك تشوه علبة هلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع علبة الجل في جهاز الصب. بدلا من ذلك، قد شريط واحد أيضا على حواف مفتوحة من علبة الجل لخلق القالب. تضع مشط المناسبة في القالب هلام لإنشاء الآبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب الاغاروز المنصهر في القالب الجل. السماح للالاغاروز لتعيين في درجة حرارة الغرفة. إزالة مشط ووضع الجل في المربع هلام. بدلا من ذلك، زويمكن أيضا أن تكون ملفوفة في شرم الاغطية البلاستيكية وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى استخدام (الشكل 1). </li></ol> 2. إنشاء جهاز جل والفصل بين أجزاء الحمض النووي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة إلى تحميل صبغ عينات من الحمض النووي لا بد من فصل (الشكل 2). يتم عادة جل التحميل صبغ في تركيز 6X (0.25٪ برومفينول الزرقاء، 0.25٪ cyanol الزيلين، 30 الجلسرين٪). التحميل صبغ يساعد على تتبع مدى عينة الحمض النووي الخاص بك قد سافر، ويسمح أيضا العينة لتغرق في هلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> برنامج التيار الكهربائي إلى الجهد المطلوب (1-5V/cm بين الأقطاب الكهربائية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة يكفي العازلة تشغيل لتغطية سطح هلام. من المهم لاستخدام المخزن المؤقت تشغيل نفسه بوصفها واحدة تستخدم لتحضير هلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نعلق يؤدي من مربع هلام لامدادات الطاقة. بدوره على امدادات الطاقة والتحقق من أن كلا من صندوق جل وامدادات الطاقة والعمل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الغطاء. ببطءوتحميل بعناية عينة من الحمض النووي (ق) في هلام (الشكل 3). وينبغي دائما على حجم الحمض النووي مناسبة علامة يمكن تحميل جنبا إلى جنب مع نماذج تجريبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال غطاء لصندوق هلام. وينبغي أن الكاثود (الخيوط السوداء) تكون أقرب الآبار من (الخيوط الحمراء) الأنود. مضاعفة التحقق التي تم توصيل أقطاب كهربائية في فتحات الصحيح في امدادات الطاقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على السلطة. تشغيل هلام حتى الصبغة قد هاجروا إلى مسافة مناسبة. </li></ol> 3. ملاحظة شظايا من الحمض النووي مطلق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما أكملت الكهربائي، إيقاف تشغيل التيار الكهربائي وإزالة غطاء العلبة هلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة هلام من مربع هلام. تصريف فائض العازلة من على سطح الأرض من هلام. وضع علبة الجل على مناشف ورقية لامتصاص أي عازلة إضافية قيد التشغيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة هلام من علبة الجل وفضح هلام للأشعة فوق البنفسجية. هو الأكثر شيوعا ويتم ذلك باستخدام نظام وثائق هلام (الشكل 4). وينبغي أن عصابات الحمض النووي تظهرعلى النحو العصابات فلوري البرتقالي. التقاط صورة من هلام (الشكل 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التخلص السليم من الجل وتشغيل العازلة في لوائح المؤسسة. </li></ol> 4. ممثل النتائج الشكل 5 يمثل نتيجة نموذجي بعد الكهربائي للهلام الاغاروز من المنتجات PCR. بعد الانفصال، وشظايا من الحمض النووي الناتج مرئية كما نطاقات محددة بوضوح. يجب أن يتم فصل معيار الحمض النووي أو سلم إلى درجة تسمح لتقرير مفيد من أحجام عينة العصابات. في المثال المعروض، ويفصل شظايا من الحمض النووي من 765 شركة بريتيش بتروليوم، BP 880 و بي بي 1022 على جل الاغاروز 1.5٪ جنبا إلى جنب مع سلم DNA 2-السجل. <img alt="الشكل 1." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig1.jpg" /> الشكل 1. جل الاغاروز طدت بعد إزالة المشط. <img alt="الشكل 2." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig2.jpg" /> الشكل 2. على الطالب إضافة إلى صبغ التحميل عينات من الحمض النووي لها. <img alt="الشكل 3." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig3.jpg" /> الشكل 3. الطالب تحميل عينة من الحمض النووي في بئر في هلام. <img alt="الشكل 4." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig4.jpg" /> الشكل 4. مثال على هلام نظام التوثيق. <img alt="الشكل 5." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig5.jpg" /> الشكل 5. صورة لهلام إستشراد آخر. وأضيف إلى EtBr الجل قبل الكهربائي إلى تركيز النهائي من 0.5 ميكروغرام / لتر، يليه فصل في 100 فولت لمدة 1 ساعة. تعرضت الجل للأشعة فوق البنفسجية والصورة التي اتخذت مع هلام نظام التوثيق.

<ol><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%22">Molecular Cloning</a>. , 3rd, (2001).</li>
<li>Kirkpatrick, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+agarose+gel+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis+of+large+DNA+molecules%3A+theory+and+applications%22%5BJournal%5D)">Overview of agarose gel properties.</a> Electrophoresis of large DNA molecules: theory and applications. , 9-22 (1991).</li>
<li>Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+endonuclease+R%E2%80%A2EcoRI+fragments+of+DNA+from+lambdoid+bacteriophages+and+other+viruses+by+agarose-gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Analysis of endonuclease R•EcoRI fragments of DNA from lambdoid bacteriophages and other viruses by agarose-gel electrophoresis.</a> J. Virol. 14, 1235-1244 (1974).</li>
<li>Smith, S. B., Aldridge, P. K., Callis, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observation+of+individual+DNA+molecules+undergoing+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Observation of individual DNA molecules undergoing gel electrophoresis.</a> Science. 243, 203-206 (1989).</li>
<li>Aaji, C., Borst, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gel+electrophoresis+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">The gel electrophoresis of DNA.</a> Biochim. Biophys. Acta. 269, 192-200 (1972).</li>
<li>Lai, E., Birren, B. W., Clark, S. M., Simon, M. I., Hood, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsed+field+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Pulsed field gel electrophoresis.</a> Biotechniques. 7, 34-42 (1989).</li>
<li>Devor, E. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDevor%2C+EJ+%22IDT+tutorial%3A+gel+electrophoresis%22">IDT tutorial: gel electrophoresis</a>. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://cdn.idtdna.com/Support/Technical/TechnicalBulletinPDF/Gel_Electrophoresis.pdf">http://cdn.idtdna.com/Support/Technical/TechnicalBulletinPDF/Gel_Electrophoresis.pdf</a> (2010).</li>
<li>Serwer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gels%3A+properties+and+use+for+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Agarose gels: properties and use for electrophoresis.</a> Electrophoresis. 4, 375-382 (1983).</li>
<li>Dea, I. C. M., McKinnon, A. A., Rees, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tertiary+and+quaternary+structure+and+aqueous+polysaccharide+systems+which+model+cell+wall+adhesion%3A+reversible+changes+in+conformation+and+association+if+agarose%2C+carrageenan+and+galactomannans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Tertiary and quaternary structure and aqueous polysaccharide systems which model cell wall adhesion: reversible changes in conformation and association if agarose, carrageenan and galactomannans.</a> J. Mol. Biol. 68, 153-172 (1972).</li>
<li>Sharp, P. A., Sugden, B., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+two+restriction+endonuclease+activities+in+H.+parainfluenzae+using+analytical+agarose-ethidium+bromide+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Detection of two restriction endonuclease activities in H. parainfluenzae using analytical agarose-ethidium bromide electrophoresis.</a> Biochemistry. 12, 3055-3063 (1973).</li>
</ol>

ليس لدينا ما يكشف.

وقد أثبتت جل الاغاروز الكهربائي إلى أن يكون وسيلة ناجعة وفعالة لفصل الأحماض النووية. قوة الاغاروز في هلام عالية تسمح لمناولة المواد الهلامية انخفاض النسبة المئوية لانفصال شظايا من الحمض النووي كبير. يتم تحديد النخل الجزيئية حسب حجم المسام التي تم إنشاؤها بواسطة حزم من الاغاروز 7 في مصفوفة هلام. بشكل عام، وارتفاع تركيز الاغاروز، أصغر من حجم المسام. جل الاغاروز التقليدية هي الأكثر فعالية في فصل شظايا من الحمض النووي بين 100 كيلوبايت و BP 25. لفصل شظايا من الحمض النووي أكبر من 25 كيلوبايت، واحد في حاجة إلى استخدام نبض هلام إستشراد مجال 6، والتي تنطوي على تطبيق التيار المتردد من اتجاهين مختلفين. وبهذه الطريقة يتم فصل أكبر شظايا من الحمض النووي الحجم من السرعة التي تعيد توجيه نفسها مع التغيرات في الاتجاه الحالي. وعلى نحو أكثر فعالية فصل شظايا من الحمض النووي أصغر من 100 شركة بريتيش بتروليوم باستخدام بولكرلميد الكهربائي للهلام. على عكسالاغاروز المواد الهلامية، ويتم تشكيل مصفوفة هلام بولكرلميد من خلال الجذور الحرة تفاعل كيميائي يحركها. هذه المواد الهلامية هي أرق من تركيز أعلى، يتم تشغيلها عموديا ويكون أفضل قرار. ويستخدم الحمض النووي في تسلسل الحديث الكهربائي الشعري، حيث يتم ملء أنابيب شعرية مع مصفوفة هلام. استخدام أنابيب شعرية يسمح لتطبيق الفولتية العالية، مما يتيح للانفصال شظايا من الحمض النووي (وتحديد تسلسل الحمض النووي) بسرعة. ويمكن تعديل الاغاروز لخلق منخفض الاغاروز ذوبان من خلال hydroxyethylation. يستخدم عادة منخفضة ذوبان الاغاروز عندما يتم المطلوب عزل شظايا من الحمض النووي المشتتة. Hydroxyethylation يقلل من كثافة التعبئة والتغليف من الحزم الاغاروز، والحد بشكل فعال حجمها المسام 8. وهذا يعني أن جزء الحمض النووي من نفس الحجم وسوف يستغرق وقتا أطول للانتقال من خلال هلام الاغاروز ذوبان منخفضة بالمقارنة مع هلام الاغاروز القياسية. لأن حزم ربط مع بعضها البعضمن خلال المنظمات غير التساهمية التفاعلات 9، فمن الممكن لإعادة صهر 1 هلام الاغاروز بعد أن وضعت. EtBr هو كاشف الأكثر شيوعا التي تستخدم لصبغ الحمض النووي في المواد الهلامية الاغاروز 10. عندما تتعرض لضوء الأشعة فوق البنفسجية، يتم تنشيط الإلكترونات في الحلقة العطرية للجزيء إيثيديوم، الأمر الذي يؤدي إلى إطلاق طاقة (الضوء)، وعودة الإلكترونات إلى الحالة الأرضية. EtBr يعمل عن طريق الإقحام نفسها في جزيء الحمض النووي بطريقة تعتمد على التركيز. وهذا يسمح لتقدير كمية من الحمض النووي DNA في أي فرقة خاصة تقوم على شدته. بسبب تهمة إيجابية، واستخدام EtBr يقلل من معدل الهجرة الحمض النووي بنسبة 15٪. EtBr هو المغير المشتبه بهم ومسرطنة، وبالتالي لا بد من توخي الحذر عند التعامل مع المواد الهلامية الاغاروز احتوائه. وبالإضافة إلى ذلك، يعتبر EtBr نفايات خطرة ويجب التخلص منها بشكل مناسب. البقع بديلة للحمض النووي في المواد الهلامية الاغاروز تشمل SYBR الذهب، والأخضر SYBR، بنفسجي كريستال والأزرق الميثيل. من هؤلاء،الميثيل الأزرق والبنفسجي كريستال لا تتطلب التعرض للأشعة فوق البنفسجية هلام للرؤية شرائح الحمض النووي، مما يقلل من احتمال تحور إذا هو المطلوب استرداد جزء من الحمض النووي من الجل. ومع ذلك، والحساسيات هم أقل من EtBr. SYBR الذهب والأخضر SYBR على حد سواء، للأشعة فوق البنفسجية حساسة للغاية تعتمد على الأصباغ مع أقل سمية من EtBr، لكنها أكثر تكلفة بكثير. وعلاوة على ذلك، كل من الأصباغ البديلة إما لا يمكن أن تكون أو لا تعمل بشكل جيد عندما تضاف مباشرة إلى هلام، وبالتالي فإن جل أن تكون ملطخة آخر بعد الكهربائي. نظرا لسهولة وتكلفة الاستخدام، والحساسية، EtBr لا تزال الصبغة المفضل لكثير من الباحثين. ومع ذلك، في حالات معينة، مثل التخلص من النفايات الخطرة عندما يصعب أو عند الطلاب الشباب يؤدون تجربة، قد يكون من المفضل صبغة أقل سمية. الأصباغ المستخدمة في التحميل الكهربائي للهلام تخدم ثلاثة أغراض رئيسية. لأول مرة إضافة إلى كثافة العينة، والسماح لها تغرق في هلام. ثانيا، توفير الأصباغ لون وتبسيط عملية التحميل. وأخيرا، فإن تحرك الأصباغ في المعدلات القياسية من خلال هلام، والسماح لتقدير المسافة التي شظايا من الحمض النووي قد هاجروا. ويمكن تحديد أحجام الدقيق للشظايا من الحمض النووي مفصولة المتهم بالتآمر في سجل من الوزن الجزيئي لفرق مختلفة من الحمض النووي ضد معيار المسافة التي تقطعها كل فرقة. مستوى الحمض النووي يحتوي على مزيج من شظايا من الحمض النووي من أحجام محددة مسبقا التي يمكن مقارنتها ضد عينات من الحمض النووي غير معروف. من المهم الإشارة إلى أن أشكالا مختلفة من الحمض النووي التحرك من خلال هلام بمعدلات مختلفة. البلازميد Supercoiled، بسبب التشكل الصغير، وينتقل من خلال أسرع هلام، يليه جزء DNA خطي من نفس الحجم، مع شكل دائري مفتوح يسافر أبطأ. في الختام، منذ اعتماد المواد الهلامية الاغاروز في 1970s لفصل الحمض النووي، لديهاثبت أن واحدة من التقنيات الأكثر فائدة وتنوعا في بحوث العلوم البيولوجية.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> الاغاروز أنا </td><td> Amresco </td><td> 0710 </td><td></td></tr><tr><td> حمض البوريك </td><td> سيغما </td><td> B7901 </td><td></td></tr><tr><td> زرقة البروموفينول </td><td> سيغما </td><td> B8026 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> سيغما </td><td> E9884 </td><td></td></tr><tr><td> إيثيديوم بروميد </td><td> سيغما </td><td> E7637 </td><td> المسببة للسرطان، يجب التخلص منها كنفايات خطرة </td></tr><tr><td> حامض الخليك الجليدي </td><td> الصياد </td><td> BP2401-212 </td><td> تآكل </td></tr><tr><td> الغليسيرول </td><td> الصياد </td><td> G33-1 </td><td></td></tr><tr><td> Xylenه cyanol FF </td><td> سيغما </td><td> X4126 </td><td></td></tr><tr><td> تريس قاعدة </td><td> سيغما </td><td> T1503 </td><td></td></tr><tr><td> محقق / FX نظام الجل وثائق </td><td> Fotodyne </td><td></td><td></td></tr><tr><td> بومة صغيرة Easycast هلام B1 نظام الكهربائي </td><td> الحرارية العلمية </td><td> B1-PTM </td><td></td></tr><tr><td> EPS امدادات الطاقة 301 </td><td> جنرال إلكتريك للرعاية الصحية </td><td> 18-1130-01 </td><td></td></tr></tbody></table>

الاغاروز الكهربائي للهلام لفصل أجزاء الحمض النووي

Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

الاغاروز هلام إستشراد هو أنجع وسيلة للفصل بين شظايا من الحمض النووي من أحجام مختلفة تتراوح بين 100 شركة بريتيش بتروليوم إلى 25 كيلو بايت 1. معزول الاغاروز من الأعشاب البحرية Gelidium جنسا والجراسيلاريا، ويتكون من agarobiose المتكررة (L-D-والجالاكتوز) مفارز 2. خلال دبق، والبوليمرات الاغاروز ربط غير تساهمي وتشكيل شبكة من الحزم الذي المسام تحديد الأحجام جل والجزيئية خصائص النخل. ثورة في استخدام هلام إستشراد الاغاروز فصل الحمض النووي. وقبل اعتماد من المواد الهلامية الاغاروز، ويفصل في المقام الأول الحمض النووي باستخدام الطرد المركزي السكروز التدرج الكثافة، والتي وفرت فقط تقريبي عن حجمها. لفصل الحمض النووي باستخدام الجل الاغاروز الكهربي، يتم تحميل الحمض النووي في سابقة الصب آبار في الهلام والتطبيقية الحالية. واتهم سلبا على العمود الفقري الفوسفات من الحمض النووي (RNA و) جزيء، وبالتالي عندما توضع في مجال كهربائي، وشظايا من الحمض النووي الهجرة إلى صاتهم ositively الأنود. لأن الحمض النووي لديه كتلة موحدة / المسؤول عن النسبة، يتم فصل جزيئات الحمض النووي من حيث الحجم داخل هلام الاغاروز في نمط من هذا القبيل أن المسافة المقطوعة تتناسب عكسيا إلى سجل من وزنه الجزيئي 3. و&quot;منحاز reptation&quot; النموذج الرائد للحركة الحمض النووي من خلال الجل الاغاروز، حيث الحافة الأمامية تتحرك إلى الأمام وتسحب بقية جزيء على طول 4. يتم تحديد معدل الهجرة من جزيء الحمض النووي من خلال مادة هلامية من قبل ما يلي: حجم 1) من جزيء الحمض النووي، 2) الاغاروز تركيز، 3) التشكل DNA 5، 4) الجهد التطبيقية، 5) وجود بروميد إيثيديوم، 6) نوع من عازلة الكهربائي الاغاروز و 7). بعد الانفصال، لا يمكن للجزيئات الحمض النووي يمكن تصور تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية بعد تلطيخ مع صبغ المناسبة. باتباع هذا البروتوكول، يجب أن يكون الطالب قادرا على: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فهم الآلية التي يتم فصل شظايا من الحمض النووي داخل مصفوفة هلام </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فهم كيفية التشكل للوجزيء الحمض النووي تحديد التنقل من خلال مصفوفة هلام </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التعرف على حل الاغاروز من تركيز مناسب لاحتياجاتهم </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد هلام الاغاروز الكهربائي من لعينات من الحمض النووي </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الجهاز الكهربائي للهلام وامدادات الطاقة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار الجهد المناسب لانفصال شظايا من الحمض النووي </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فهم الآلية التي إيثيديوم بروميد يسمح التصور من عصابات الحمض النووي </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد أحجام شظايا من الحمض النووي فصل </li></ol>

يوصف بروتوكول الأساسية للانفصال شظايا من الحمض النووي باستخدام الجل الاغاروز الكهربائي.

يُعد الفصل الكهربائي لهلام الأجاروز الطريقة الأكثر فعالية لفصل قطع الحمض النووي (DNA) ذات الأحجام المتفاوتة التي تتراوح ما بين 100 زوج قاعدي و25 كيلوباز. ويتم استخلاص الأجاروز من...

الهدف العام من هذا الإجراء هو فصل قطع DNA ذات الأحجام المختلفة. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تحضير هلام بتركيز مناسب من الـ agarose وصبغة فلورية. وتتمثل الخطوة الثانية في صب الهلام في قالب مناسب ثم تركه ليتماسك.يتم تحميل العينات في الهلام وتطبيق تيار كهربائي. وتتمثل الخطوة النهائية في تصور قطع DNA المفصولة تحت الأشعة فوق البنفسجية. وباختصار، يُستخدم الفصل الكهربائي لهلام AGROS في جميع الحالات التي يتطلب فيها إجراء فصل روتيني لقطع DNA.تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق التي كانت متاحة في ذلك الوقت، مثل الطرد المركزي بتدرج كثافة السكروز، في أنها تتيح تصور حزم DNA، كما تمكننا من تحديد الحجم الدقيق لقطعة DNA عند فصلها بالتزامن مع DNA marker. وتعد هذه الطريقة أساسية في أبحاث علوم الحياة، كما هو الحال في استنساخ الجينات وتنقية جزيئات DNA وتسلسلها. ورغم أن هذه الطريقة تُستخدم عمومًا لفصل قطع DNA التي يتراوح حجمها بين 100 base pairs و25 kilo bases، إلا أنه يمكن تعديلها لفصل قطع DNA يصل حجمها إلى 10 megabases.يتم تحضير هلامات الأغاروز باستخدام محلول بنسبة الوزن إلى الحجم. ويعتمد تركيز هلام الأغاروز على أحجام قطع DNA المراد فصلها. لبدء إجراء تحضير الهلام، قم بوزن الكتلة المناسبة من الأغاروز في دورق إرلنماير، ثم أضف الحجم المناسب من محلول التشغيل المنظم إلى الدورق.يجب ألا يتجاوز حجم المحلول المنظم ثلث سعة الدورق؛ قم بتدوير الدورق للمزج، ثم صهر خليط محلول agarose المنظم عن طريق التسخين في جهاز الميكروويف بأقصى طاقة. وبفواصل زمنية مدتها 30 ثانية، أخرج الدورق وقم بتدوير المحتويات للمزج. كرر هذه العملية جيداً حتى يذوب agarose تماماً.بعد ذلك، أضف بروميد الأثيريوم (Atherium bromide) بتركيز 0.5 µg/mL. ومن المهم ملاحظة أن بروميد الأثيريوم مادة مسرطنة، لذا يجب دائماً ارتداء القفازات عند التعامل مع الهلامات التي تحتوي على بروميد الأثيريوم. اترك الأغاروس ليبرد عن طريق التحضين في حمام مائي عند درجة حرارة 65 °C؛ حيث إن عدم القيام بذلك سيؤدي إلى تشويه صينية الهلام أثناء تبريد الأغاروس.قم بتجهيز قالب الهلام عن طريق وضع صينية الهلام في جهاز الصب. وبدلاً من ذلك، يمكن لصق الحواف المفتوحة لصينية الهلام لإنشاء قالب. ضع المشط المناسب في قالب الهلام لإنشاء الفجوات.صُب القالب والحلقات في قالب الهلام. اترك الحلقات لتتصلب في درجة حرارة الغرفة. وبمجرد تصلب الحلقات، قم بإزالة المشط.إذا لم يتم استخدام الهلام على الفور، فقم بتغليفه بغلاف بلاستيكي وتخزينه في درجة حرارة أربع درجات مئوية حتى استخدامه. أما إذا كان الهلام سيُستخدم على الفور، فوضعه في صندوق الهلام. لبدء هذا الإجراء، أضف صبغة تحميل الهلام إلى عينات DNA المراد فصلها.يتم تحضير صبغة التحميل عادةً بتركيز 6x، وبمجرد ضبط وحدة التغذية الكهربائية على الجهد المطلوب، أضف كمية كافية من محلول التشغيل المنظم (running buffer) في صندوق الهلام لتغطية سطح الهلام. من المهم استخدام نفس محلول التشغيل المنظم الذي استُخدم في تحضير الهلام؛ قم بتوصيل أطراف صندوق الهلام بوحدة التغذية الكهربائية ثم قم بتشغيل الوحدة. تحقق من أن كلاً من صندوق الهلام ووحدة التغذية الكهربائية يعملان بشكل صحيح.يشير ظهور الفقاعات عند الأقطاب الكهربائية إلى مرور التيار. ونظراً لأن أيدينا تميل إلى الاهتزاز قليلاً بشكل طبيعي، فقد يكون من الصعب إدخال رأس ماصة صغير في بئر صغيرة. إحدى الطرق لمنع اهتزاز اليد هي إسنادها على الذراع الأخرى أو على صندوق الهلام.ارفع غطاء صندوق الهلام ببطء وحذر، ثم قم بتحميل عينات DNA في الهلام. تسمح صبغة التحميل الموجودة في العينة للعينة بالهبوط داخل الهلام، كما ستساعد في تتبع المسافة التي قطعتها العينة. يجب دائمًا تحميل مؤشر حجم DNA جنبًا إلى جنب مع العينات التجريبية.أعد تركيب الغطاء. تأكد جيداً من توصيل الأقطاب الكهربائية في الفتحات الصحيحة بمزود الطاقة. قم بتشغيل الطاقة، واترك الهلام يعمل حتى تهاجر الصبغة إلى مسافة مناسبة.عند اكتمال عملية الرحلان الكهربائي، قم بإيقاف تشغيل وحدة إمداد الطاقة وارفع غطاء صندوق الهلام. أخرج الهلام من الصندوق وقم بتصريف المحلول المنظم الزائد الموجود على سطحه. ضع صينية الهلام على مناشف ورقية لامتصاص أي محلول منظم متبقٍ من عملية التشغيل.لتصوير قطع الـ DNA، أخرج الهلام من صينية الهلام وعرّضه للأشعة فوق البنفسجية. يتم ذلك عادةً باستخدام نظام توثيق الهلام. يجب أن تظهر حزم الـ DNA على شكل حزم فلورية برتقالية.التقط صورة للهلام في نهاية التجربة، وتخلص من الهلام ومحلول التشغيل بشكل صحيح وفقاً للوائح المؤسسة. يمثل هذا الشكل نتيجة نموذجية بعد إجراء الفصل الكهربائي للهلام لمنتجات PCR. بعد الفصل، تظهر قطع DNA الناتجة على شكل حزم محددة بوضوح.يجب فصل معيار DNA أو السلم الجزيئي بدرجة تسمح بالتحديد المفيد لأحجام حزم العينة. في هذا المثال، تم فصل قطع DNA بأحجام 765 base pairs و880 base pairs و1022 base pairs على هلام AROS بنسبة 1.5% باستخدام سلم DNA ثنائي اللوغاريتم. عند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر التحقق المزدوج من وضع الأقطاب الكهربائية قبل تطبيق التيار.يتم ذلك لضمان تحرك جزيئات DNA في الاتجاه الصحيح. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير خلية agarose، وفصل DNA إلى شظايا ذات أحجام حاملة، والحصول على صور ممثلة لنتائجك. لا تنسَ أن العمل بـ bromide الثلاثي يمكن أن يكون خطيراً للغاية، ويجب دائماً اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء القفازات والنظارات الواقية ومعاطف المختبر عند تنفيذ هذا الإجراء.

agarose-gel-electrophoresis-for-the-separation-of-dna-fragments

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

في هذا الفيديو ، ونحن يبرهن على وجود طريقة لفصل الكهربي للبروتينات باستخدام بولي acrylimide الكهربائي للهلام (PAGE).

الكهربي فصل البروتينات

يوضح هذا الفيديو تقنية فصل قائمة على بولي أكريلاميد لتغيير طبيعة البروتينات. تساعد هذه التقنية في التحديد الأولي للبروتينات بناء على أوزانها الجزيئية.

الرحلان الكهربائي لجل بولي أكريلاميد دوديسيل كبريتات الصوديوم لتحليل البروتين: تقنية لفصل البروتينات وتصورها بناء على الوزن الجزيئي

&lt; p class = "jove_content"&gt;في هذا الفيديو ، نوضح طريقة الرحلان الكهربائي للهلام ثنائي الأبعاد التي تفصل البروتينات الفردية عن خليط بروتيني معقد يتم الحصول عليه من أنسجة الورم الورمي الحميد النخامي البشري غير الوظيفي (NFPA). يتم فصل البروتينات بناء على شحنتها الكهربائية في البعد الأول ويتم فصلها بشكل أكبر بناء على الأوزان الجزيئية في البعد الثاني.

الرحلان الكهربائي لجل بولي أكريلاميد ثنائي الأبعاد: تقنية فصل لتحليل البروتينات في خليط البروتين المركب بناء على الشحنة والوزن الجزيئي

التقليدية البلازما هلام (سغي) التجارب تتطلب جهاز معقد والاستهلاك الكيميائي عالية. يعرض هذا العمل بروتوكولا يصف طريقة منخفضة التكلفة لفصل شظايا الحمض النووي ضمن إطار زمني قصير.

في الوقت الحقيقي تتبع فصل جزء من الحمض النووي عن طريق الهاتف الذكي

نقدم هنا، بروتوكول لاستخدامه thiazole البرتقالي للكشف عن الحمض النووي في جل التجارب التفريد. يسمح استخدام اللون البرتقالي thiazole القضاء اثيديوم بروميد، ويمكن أن يتحقق الأسفار الكشف بالأشعة فوق البنفسجية أو الضوء الأزرق.

التفريد الحمض النووي باستخدام أورانج Thiazole بدلاً من اثيديوم بروميد أو الأصباغ البديلة

تغيير طبيعة الكهربائي جل التدرج (DGGE)

هذا الفيديو يوضح بروتوكول لفحص الأوعية الدموية في المختبر الذي يلخص مراحل عديدة من الأوعية الدموية. وتظهر -- الوقت الفاصل بين الصور التي تنتشر من وتشكيل التجويف ، والمتفرعة مفاغرة -- الملامح الرئيسية الأوعية الدموية.

الفحص الأمثل الفايبرين الخرزة جل لدراسة الأوعية الدموية

علينا أن نظهر أن التعبير أكثر من البشرة مستقبلات عامل النمو (EGFR) يعزز حركية من خلايا الجذعية العصبية (NSCs) باستخدام agarose هلام رواية الجهاز ميكروفلويديك القائمة. يمكن أن تكون قابلة للتكيف هذه التكنولوجيا بسهولة لغيرها من نظم خلايا الثدييات الخلية حيث قالت مصادر شحيحة ، مثل الخلايا الجذعية العصبية ، وبدوره حولها الساعة الحرجة.

تقييم العصبية على الحركة باستخدام الخلايا الجذعية جل المستندة Agarose الأجهزة ميكروفلويديك

SDD - AGE هو تقنية مفيدة للكشف وتوصيف اميلويد مثل البوليمرات في الخلايا. هنا علينا أن نظهر للتكيف الذي يجعل هذه التقنية قابلة للتطبيقات واسعة النطاق.

الكشف عن تجميع اميلويد بواسطة تغيير طبيعة شبه الكهربائي جل منظفات - Agarose

تغيير طبيعة استخدام هلام بولي أكريلاميد الكهربائي لفصل واحد اليوريا الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي الريبي أو تصل إلى حد 500 النيوكليوتيدات. اليوريا في تركيبة مع عينات يبدل طبيعة الحرارة وضيق واحد غير منظمة الهجرة داخل المصفوفة هلام وفقا لوزنها الجزيئي.

تغيير طبيعة جل بولي أكريلاميد الكهربائي اليوريا (PAGE اليوريا)

تعلم تقنية الهلام الكهربائي للأجاروز لفصل أجزاء الحمض النووي بأحجام مختلفة. تتيح هذه الطريقة تصور النطاقات وتحديد أحجام الأجزاء بدقة في البحوث الجزيئية.

الاغاروز الكهربائي للهلام لفصل أجزاء الحمض النووي

استكشف المزيد من الفيديوهات