غير الغازية التصوير من المبيضات المنتشر في يرقات اسماك الزرد

الهدف العام من هذا الإجراء هو إظهار تقنيات إصابة يرقات الزرد باستخدام العامل الممرض الفطري المبيضات البيضاء. أولا ، يتم تحضير مزرعة فطرية فلورية وتغليف أجنة الأسماك. بعد ذلك ، تصطف الأسماك على طبق حقن أروس.

المبيضات البيضاء بشكل دقيق من خلال أذن كل سمكة في صياد البطين الخلفي ، ثم يتم تضمينه في الهوائية منخفضة الذوبان ويتم تصورها بواسطة الفحص المجهري الفلوري epi. في النهاية ، يمكن استخدام هذه الطريقة لتصوير تفاعل العامل الممرض المضيف بشكل غير جراحي في البيئة المعقدة للمضيف بدلا من النظام المبسط لطبق بتري. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل حقن الوريد المزيل هي أنك تخلق عدوى موضعية تؤدي إلى مرض مميت منتشر.

علاوة على ذلك ، تسمح هذه التقنية بالحقن الفعال لخلايا C bucan الكبيرة بطبيعتها في يرقات سمك الزرد الصغيرة. ابدأ بوضع مخزون المبيضات البيكان على خميرة. تحتضن صفيحة أجار سكر العنب اللوحة طوال الليل عند 37 درجة مئوية للسماح للمستعمرات بالنمو.

بمجرد أن تصبح المستعمرات مرئية ، استخدم وتدا خشبيا معقما لاختيار مستعمرة معزولة وإذابة الخميرة في خمسة ملليلتر من الخميرة الطازجة ، استخرج مرق سكر العنب بيبتو في أنابيب استزراع 16 × 150 ملم. ضع المزرعة على أسطوانة أسطوانة زراعة الأنسجة ، المجهزة بعجلة أنبوب اختبار وحاضنات طوال الليل عند 37 درجة مئوية. في اليوم التالي ، قم بنقل مليلتر واحد من الثقافة إلى أنبوب 1.5 مليلتر من الأنبوب وقم بطرده عند 14 ، 000 مرة ، G لمدة دقيقة واحدة لحبيبات الخلايا ثم تخلص من الحبيبات ودوامة الحبيبات لفكها.

أعد تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من دوامة PBS وقم بطردها مرة أخرى. ثم تخلص من الاستيعاب وكرر هذا الغسيل. خطوة ثلاث مرات لإزالة أي وسط ثقافة متبقي.

بمجرد غسل الخلايا ، قم بحسابها في مقياس الخلوي الدموي عند تخفيف من واحد إلى 100 في PBS. للحصول على ثقافة لمدة 12 ساعة ، يجب أن تتوقع ثلاثة إلى أربعة أضعاف 10 إلى ثماني خلايا لكل مليلتر. ينحني ريس الخميرة بتركيز نهائي من 10 إلى الخلايا السبع لكل مليلتر.

استخدم غربالا لجمع أجنة أسماك الحمار الوحشي من حوض التفريخ في اليوم السابق للحقن وتخزينها في محلول ماء البيض يحتوي على 60 ملليغرام لكل مليلتر من أملاح المحيط الفورية في ماء معقم منزوع الأيونات. ثم ضع الأجنة عند 33 درجة SIUs لمدة 24 ساعة مع دورة مظلمة فاتحة لمدة 12 ساعة. هذا يسمح بتطور الجنين إلى مرحلة اليرقات الأولية 25 ، وهي المرحلة المثلى للعدوى في يوم الإصابة.

انقل الأجنة بماصة نقل في 60 مل من ماء البيض إلى طبق بتري عميق للغاية. ثم يقوم المستخدم بتشريح المجهر وملاقط دومون لطلاء الأجنة. يمكن تحقيق ذلك عن طريق فصل الكوريان برفق مثل كيس من رقائق البطاطس حتى ينبثق السمك.

بمجرد طلاء جميع الأجنة. لذلك في حين أن طبق بتري لتحريك السمك نحو المركز ، انقل السمك إلى غطاء الطبق ، وقم بإزالة الوسط واستبدله بماء البيض العذب. أضف السمك إلى ماء البيض الطازج.

قم بإعداد محلول 200 ميكروغرام لكل مليلتر من سلفونات الميثان trica لتخدير الأسماك باستخدام ماصة نقل. اجمع 20 إلى 50 جنينا واستبدلها في محلول التخدير لمدة دقيقة إلى دقيقتين أو حتى تتوقف عن الحركة. في غضون ذلك ، قم بتشغيل وحدة الحقن ، وتأكد من تشغيل الضغط على النبض ، ويتم ضبط مدة النبضة على تسعة مع ثلاثة رطل لكل بوصة مربعة لوحدة الضغط الخلفي.

افتح الصمام الموجود على خزان النيتروجين تدريجيا حتى يصل ضغط الحقن إلى 30 رطل لكل بوصة مربعة. بعد ذلك ، قم بتحميل الماصة الدقيقة المجمعة بخمسة ميكرولترات من محلول المبيضات الدوامة وضعها في حامل الماصة الصغيرة. ضع طبق بتري عميقا جدا يحتوي على الماء على مرحلة المجهر التشريح واضبط موضع الماصات الدقيقة حتى يتم عرضه ويتم غمر طرفه جزئيا فقط في الماء.

ثم باستخدام الملقط ، قم بقص إبرة الماصة المجمعة على بعد حوالي ثلاثة ملليمترات من الحافة. إذا تم قص الإبرة بنجاح ، فإن الضغط على مفتاح قدم وحدة الحقن يجب أن يسمح بتوزيع السائل. باستخدام شريحة متدرجة ، قم بقياس الحجم الذي تم توزيعه ، ثم اضبط الضغط بحيث يكون حجم السائل الموزع 0.21 ملم في القطر أو أقل بقليل من حجم تلميذ جنين سمكة الحمار الوحشي.

بمجرد إعداد المجهر وتخدير الأسماك ، قم بتورم الطبق لجذب السمكة إلى المركز ونقلها إلى ماصة نقل. اضغط بعناية على جانب الماصة حتى تستقر السمكة عند الحافة. ثم باستخدام أقل حجم ممكن ، قم بإيداع السمك برفق في طبق حقن يرقات aose دافئا مسبقا إلى 28 درجة مئوية.

باستخدام قضيب زجاجي أملس ، قم باصطف السمك بعناية. ثم باستخدام منشفة ورقية ، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من السوائل من الطبق. ضع طبق الأروس مع السمك تحت المجهر حتى تصبح كل من الإبرة والسمكة الأولى في مرأى واضح.

تأكد من أن كل سمكة لا تزال على قيد الحياة من خلال ملاحظة وجود نبضات قلب مرئية. إذا ماتت ، تخلص منها وانتقل إلى المرحلة التالية. حرك الإبرة الزجاجية نحو تكبير السمكة.

أثناء القيام بذلك ، أدخل الإبرة بعناية في الهيكل الدائري لأذن السمكة مع وجود حجرين للأذن خلف العين مباشرة. بمجرد أن تصبح الإبرة في موضعها ، قم بحقن الخميرة باستخدام مفتاح القدم. إذا تم إدخال الإبرة بشكل صحيح ، فإن السمكة هي الدماغ الخلفي سوف يتراجع البطين قليلا بعد الحقن ، ويسحب الإبرة ويكرر الإجراء مع السمكة التالية.

يجب ألا تستغرق العملية برمتها أكثر من 15 أو 20 دقيقة ، وإلا ستجف الأسماك وتموت بعد هذا الوقت. ستستقر الخميرة أيضا في قاع الماصة الدقيقة وتؤدي إلى عدوى غير متساوية أو جرعات أو انسداد الماصة الدقيقة المجمعة. بمجرد حقن جميع الأسماك ، استخدم ماء البيض لغسلها من الحروس وفي طبق بتري طازج يحتوي على 60 مل من ماء البيض.

ثم ضع الطبق على حرارة 28 درجة مئوية. أغلق صمام النيتروجين ، واضبط مفتاح الحقن على الوضع المستمر لتخفيف الضغط في خط الخزان. ثم عندما ينخفض الضغط إلى الصفر ، اضبط المفتاح مرة أخرى على النبض وقم بإيقاف تشغيل وحدة الحقن.

ابدأ بتخدير الأسماك المصابة في كبريتات الميثان كما هو موضح سابقا. بمجرد تخدير الأسماك ، استخدم ماصة لنقل سمكة واحدة في كل مرة إلى طبق بتري يحتوي على 0.4٪ أجار منخفض الذوبان. ثم استخدام ماصة النقل وحمل أقل قدر ممكن من agros.

انقل كل سمكة من طبق بتري إلى بئر واحد من طبق تصوير زجاجي القاع بحوالي 0.2 مل و 0.4٪ نشأ ذوبان منخفض مكمل ب 200 ميكروغرام لكل مليلتر من مخدر فوق السمكة بحيث تمتلئ الدوائر الداخلية وتنتشر طبقة رقيقة من الأروس عبر قاع البئر. يمكن الآن تصوير الأسماك لمدة تصل إلى 24 ساعة باستخدام مجهر مقلوب مع نظام متحد البؤر للمسح بالليزر. بعد خمس ساعات من إصابة أسماك الحمار الوحشي بالشميضات البيضاء الفلورية الحمراء.

الخميرة في الدماغ الخلفي للأسماك في أسماك FL I EGFP ، مثل هذه ، البطانة الوعائية والخلايا الشبيهة بالبلاعم في جميع أنحاء جسم الأسماك فلورية. تظهر هنا باللون الأخضر ، بعد خمس ساعات من الإصابة. يمكن رؤية الخميرة داخل الخلايا الشبيهة بالبلاعم بمقدار 24 ساعة.

انتشرت العدوى على طول أنسجة الذيل الظهرية حيث يمكن اكتشاف الخميرة مرة أخرى داخل خلايا FTIC. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية الحقن الدقيق للمبيضات البيضاء في البطين الخلفي للدماغ الخلفي لسمكة الزرد في المرحلة 25 من Prim ، بما في ذلك واحدة لتحضير الثقافة الفطرية ، ويرقات التخدير لسمك الزرد. ثلاثة حقن دقيق في البطين الخلفي للدماغ.

وأربعة ، تحضير اليرقات المصابة للتصوير متحد البؤر.