توسيع الجنينية والكبار الخلايا الجذعية العصبية من قبل في الرحم الصعق الكهربائي أو حقن التجسيمي الفيروسية

السيطرة على التوسع في الخلايا الجذعية الجسدية هو أحد العوامل الرئيسية التي تعوق دراستهم واستخدامها في العلاج. نحن هنا وصف نظام للسيطرة على التوسع زمنيا العصبية خلال الخلايا الجذعية التنمية والبلوغ، والتي يمكن استخدامها لزيادة عدد الخلايا العصبية في الدماغ ولدت الماوس.

مرحبا ، اسمي فيديريكو ك وأنا قائد مجموعة في مركز العلاجات التجديدية في دريسدن ، ألمانيا. في الفيلم التالي ، نود أن نعرض لكم بعض التقنيات التي استخدمناها في مختبرنا في السنوات السابقة للتحكم في تحول الخلايا الجذعية العصبية للثدييات من التكاثر إلى التمايز وتكوين الخلايا العصبية. على وجه الخصوص ، وجدنا أنه عندما نبالغ في التعبير عن كيناز معتمد على ركوب الدراجات لمركب D ، يمكننا حث الخلية الجذعية على تقصير G واحد ، وخلال هذا الوقت ، ستخضع الخلايا لانقسام تكاثري يوسع عدد سكانها بدلا من تكوين الخلايا العصبية.

ومن المثير للاهتمام ، أنه عندما يتم هذا التلاعب ، يعود CDK بشكل عابر وركوب الدراجات إلى المستوى الفسيولوجي للتعبير. يمكن أن تتحول هذه المجموعة الموسعة من الخلايا الجذعية إلى تكوين الخلايا العصبية الفسيولوجية. نتيجة لتوسعها ، ستولد الخلايا المزيد من المعادن ووجدنا أن هذا المبدأ ينطبق أثناء التطور الجنيني للقشرة الدماغية للفأر وكذلك في الحصين البالغ.

لذلك في مقطع الفيديو التالي ، سيوضح لك كريستيان لانج كيف يمكن إجراء هذا التلاعب في تطوير أجنة الفئران من خلال الأداء في التثقيب الكهربائي. في الجزء الثاني من الفيديو الخاص بنا ، ستستخدم Beja تقنية مماثلة من الناحية المفاهيمية ، ولكن في دماغ البالغين ، وتحديدا في الحصين عن طريق إجراء الحقن الفيروسي التجسيمي. لذلك آمل أن تكون هذه التقنية وهذا النوع من التلاعب مفيدة أيضا لبحثك في مختبراتك وآمل أن تستمتع بهذا الفيديو.

مرحبا ، أنا كريستيان لانجر واليوم سأريكم توسع الخلايا الجذعية العصبية في قشرة الفأر النامية. من خلال الاستكشاف المحايد ل CDKs وركوب الدراجات. يتم طلاء سد الحامل بأكسيد الألومنيوم ووضعه على طاولة التشغيل الساخنة.

هناك ، حيث يتم تطبيق البخار المتدفق عبر قناع التنفس الذي نستخدمه كمتدفق لأن إدارته المستمرة تسمح بتوقيت دقيق ومرن لمغناطيس التشغيل. لبدء العملية ، حلقت بطن الفأر بعناية. يتم تطهير المنطقة المحلوقة بمحلول اليود بعد الجراحة و gia.

أقوم بحقن 100 ميكرولتر من محلول tega ing تحت الجلد. بالنسبة لحقن الحمض النووي ، استخدمت الشعيرات الدموية القابلة للسحب المملوءة بالحمض النووي للبلازما المكمل ب D. لقد قطعت الطرف المغلق للشعرية باستخدام ثلاثة ث.

تم تعقيم جميع الأدوات بالحرارة لفتح بطن السد الحامل. أقوم بإجراء قطع طولي في خط الوسط لجلد البطن باستخدام المقص. تم تطهير جميع الأدوات الجراحية في معقم حراري زجاجي.

من تجربتنا ، يكفي الاحتفاظ بالأدوات في منصة التشغيل معقمة لتجنب الالتهابات البكتيرية. يتم قطع الصفاق بشكل مشابه لجلد البطن المغطى عن طريق عمل شق طولي في خط الوسط يفتح تجويف الجسم. يتم ترطيب التجويف بمحلول التثقيب الكهربائي.

PBS مكمل بحزام قلم لهذه العدوى ولتسهيل استخراج الرحم. بعد إجراء عملية استئصال الدهون ، غطيت البطن بستارة جراحية معقمة. باستخدام ضام الخزان ، أفتح تجويف الجسم وأمسك الرحم بعناية بين اثنين من الجرثات لسحب قرني الرحم برفق من تجويف الجسم.

بالنسبة للعملية ، أستخدم فأرة حامل في Emry A 14. في هذا العمر ، تكون الأجنة مرئية بوضوح في الرحم ويمكن إجراء العملية دون استخدام المجهر. من المهم جدا لبقاء الأجنة على إبقاء الرحم مغطى بمحلول التثقيب الكهربائي طوال العملية.

لحقن الحمض النووي المنقوش ، أمسك صفارا واحدا بعناية بيد واحدة لمعالجة الجنين بالداخل. بطريقة أستطيع من رؤية نصفي الكرة الأرضية ، تمسك أصابعي الكيس حتى لا يتمكن الجنين بالداخل من الابتعاد عن قوة الإبرة وأحقن من خلال جدار الرحم في نصف الكرة الأرضية حتى يتم تحديد البطين باللون الأزرق بواسطة محلول الحمض النووي الملون. بعد الحقن ، يتم ترطيب الرحم مرة أخرى بمحلول التثقيب الكهربائي ويتم وضع الأقطاب الكهربائية.

من الضروري وضع عمود جيش التحرير الشعبى الصينى للقطب الكهربائي على الرحم فوق نصف الكرة المحقون وبعد ذلك نبدأ في الأوضاع الكهربائية باستخدام مفتاح القدم. يتم تخزين الأقطاب الكهربائية في PVS أثناء العملية لغسل الأملاح التي تتشكل عند التلامس. أثناء العملية الكهربائية ، يتم ترطيب الرحم مرة أخرى ويستمر مع الجنين التالي.

عندما يتم تشغيل جميع الأجنة بالكهرباء ، أستخدم مرة أخرى ضام الطن لفتح الجرح في تجويف الجسم لإعادة الأجنة بعناية فائقة إلى الداخل ، وأستخدم الحنفيات أو إذا لزم الأمر الأصابع للحصول على الرحم في الداخل. لإغلاق الجرح. أبدأ بإزالة الستارة الجراحية.

أستخدم الغرز الجراحية لإغلاق الجرح. في الصفاق ، أسحب القامة من خلال. أدرت نهاية الإبرة من القامة مرتين حول الملقط ، وأمسكت بالطرف الآخر وسحبت لأداء العقدة الجراحية.

ينصح بسحب العقدة بإحكام ثم يتم قطع الأطراف باستخدام المقص. يتم تنفيذ هذه التقنية كل بضعة ملليمترات حتى يتم إغلاق القطع في الصفاق تماما. يغلق الجرح في جلد البطن.

باستخدام المشابك الجراحية ، أستخدم الملقط لإنشاء حلقة في الجلد ، ثم يتم تثبيتها معا. باستخدام قضيب المشبك هذا ، تنتهي العملية ويمكن إزالة من قناع الحزن للاستيقاظ والتعافي. في غضون خمس إلى 10 دقائق ، يستيقظ على منصة التشغيل ويمكن نقله إلى قفص منزله.

بعد يوم واحد من العملية ، يتم التضحية بالأنثى الحامل وجمع الأجنة بنجاح. يتم تحديد الأجنة الكهربائية تحت مجهر ستيريو الفلورسنت. التعبير عن مراسلي الفلورسنت في دماغهم الأمامي الموضح هنا على الدماغ المقطوع ، وهو مقطع عرضي بالكامل للقشرة الكهربائية استعرضت خلايا ggl الراديوية المستهدفة في البداية في منطقة البطين وذريتها المتمايزة ، والأسلاف القاعدية في المنطقة تحت البطين والخلايا العصبية في المنطقة المتوسطة والصفيحة القشرية.

وبالتالي ، يمكن تحديد تمايز الخلايا الكهربائية عن طريق القياس الكمي للخلايا الفلورية في هذه المناطق المختلفة من القشرة أو عن طريق تلطيخ علامات محددة لأسلاف VA الواضحة والعصبية الراديوية. مرحبا ، اسمي آني. سنقوم اليوم بإعداد بعض مضادات الفيروسات لفيروس نقص المناعة البشرية وسأوضح لك لاحقا كيفية حقنها في دماغ فأر بصوت عال.

قمنا بطلاء خمسة من 10 إلى ستة إلى تسع ثلاث خلايا تائية في كل طبق 10 سم بإجمالي 15 طبقا باستخدام الطلب المكمل بنسبة 10٪ FCS والمضادات الحيوية. اليوم الثاني هو الانتقال. بادئ ذي بدء ، سنقوم بإعداد محلول الحمض النووي.

لدينا ثلاثة بلازميدات مختلفة. أحدهما حالي لبروتين DSPG ، والثاني لبروتينات GPU ، والأخير لجيناتنا الوظيفية ، لذا فإن الثاني و CDK الأربعة. في هذه الحالة ، نقوم بإعداد مزيج ضخم من البلازميد الثلاثة لإضافته إلى وسائط DN العادية.

بمجرد الانتهاء من ذلك ، نقوم بخلط محلول الحمض النووي. ثم نقوم بإعداد محلول PI. تتم إضافة حل PI إلى حل DA.

يتم خلطها وتحضانها لمدة 1530 دقيقة في مصنع واحد. في غضون ذلك ، نستبدل وسائط ألوحاتنا بطلب جديد يحتوي على 15٪ FCS من أجل الحصول على تركيز نهائي يبلغ 10٪ FCS. بمجرد إضافة مزيج التحويل ، نضيف بعد ذلك إلى ML لطبق مزيج التحويل.

نخلطها برفق وبعد ذلك نرفع الخلايا في كوبرا بين عشية وضحاها. في اليوم الثالث ، نعالج الخلايا بزبدات الخلية لتقليل التعبير من محفز CMD. نضيف أولا زبدات الخلية إلى جميع الأطباق.

نحتضنهم لمدة ست أو ثماني ساعات عند 37 درجة ، وبعد ذلك سنقوم بتغيير وسائل الإعلام. اليوم الرابع هو اليوم الأخير من إعدادنا. نقوم بجمع الوسائط من جميع الأطباق ثم من أجل التخلص من بقايا الخلية ، نقوم بتصفيتها.

بعد أن قمنا بجمع وتصفية الوسائط من جميع اللوحات التي ننقلها في الأنبوب ، من المهم موازنة أنابيب الطرد المركزي الفائق بعناية قبل الشروع في الطرد المركزي الفائق ثم نحصل على العينات في نهاية الطرد المركزي الفائق. نأخذ عيناتنا بعناية ونتخلص بعناية من البليت بالكاد مرئية ويبدو وكأنه ظل في الجزء السفلي من الأنبوب. نقوم بغسل البليت باستخدام PBS ثم قمنا باحتضان الثلج لمدة ساعة واحدة.

هناك حنك معلق نقل هذه الأنابيب الصغيرة وأجهزة الطرد المركزي الفائقة مرة أخرى ، يتم تعليق لوحة الفيروسات في 50 ميكرون من PBS وتصفيتها. تم تخدير الفم كما هو موضح بالفعل. باستخدام الملقط ، نفتح الفم ونصلحه على جزء الحنك من الإطار التجسيمي.

ثم نقوم بإصلاح الرأس بقضبان هنا ويتم إدارة Al. كما هو موضح بالفعل. نضع الكريم على ثلج الفأر لتجنب العمى.

نملأ الشعيرات الدموية بالزيت حتى نصف طوله ، أكثر أو أقل ، ونريد حاقن النانولتر الذي سنحتاجه لحقن الفيروسات. تم تشكيل جلد الرأس وتطهيره بعناية كما هو موضح بالفعل. من أجل كشف الجمجمة ، يمكنني استخدام الجلد باستخدام المشرط الأول ثم المقص.

باستخدام الخفافيش القطنية ، أقوم بتنظيف سطح الجمجمة برفق. يجب الآن وضع طرف الغطاء في مراسلات نقطة بريما. للقيام بذلك قدر الإمكان من التمارين ، نستخدم مساعدة المجهر الصوتي.

قمنا بتحريك ذراع الإطار التجسيمي على المحور Y و X حتى يتم وضع طرف القدرة في bgma. ثم نقوم بتعيين القيمة المعروضة على الشاشة الرقمية. إطار ساكس القطعة متصل.

ثم نقوم بتحريك ذراع الإطار التجسيمي حتى لا نصل إلى الإحداثيات المطلوبة الموضحة على الشاشة. بعد أن نضع طرف القدرة على الإحداثيات الحمراء ، نحتفل بالنقطة باستخدام قلم تحديد بعجلة كهربائية ، وأفتح ثقبا في هذه النقطة مع الانتباه ، وليس الدماغ التالف. من الآن فصاعدا نبدأ في العمل مع الفيروسات ، لذلك علينا اتخاذ احتياطات خاصة لتجنب أي تلوث.

يتم الاحتفاظ بالفقرة دائما في عيون جافة مع keval ونحن نرميها. ثم آخذ خمسة ميكرولترات من تعليق البرميل ويتركون القطرة على قطعة صغيرة من الزعنفة التي وضعتها سابقا على شريط الهواء. أحرك إطار الذراع مرة أخرى حتى يلامس طرف الشعيرات الدموية قطرة تعليق الفيروس.

سيؤدي استخدام وحدة التحكم الرقمية لحانة حقن اللتر إلى تحميل تعليق البطارية في الشعيرات الدموية عن طريق امتصاصها. ثم نعيد الشعيرات الدموية إلى جانب الحقن. بمجرد أن يلامس طرف الشعيرات الدموية سطح PL ، أقوم بإعادة تعيين القيمة على المحور Z على الشاشة الرقمية ، يتم التخلص من الفيروسات اليسرى على الفور.

يرجى تذكر أنه يمكن تطهير الفيروسات بالإيثانول ، لذلك كل ما يمكن أن يواجهه معلق الفيروس ليكون نظيفا بالإيثانول. حان الوقت الآن للحقن ، لذلك نحرك الغطاء في المحور Z ، ونخترق الأنسجة حتى نصل إلى نقطة اللدغة ثم نبدأ الحقن. من المهم حقن الفيروسات بمعدل حقن منخفض جدا.

في هذه الحالة 1 55 نانولتر في الدقيقة. بعد جيش تحرير الشعبى الشعبى، ننتظر دقيقتين لتجنب هذا التدفق عبر مسار الإبرة، ثم نسحب الشعيرات الدموية في النهاية. يغلق الجلد كما تم عرضه بالفعل.

تومض القمامة حاويتين S ثم اللوحة الخارجية. بعد الجراحة ، يمكن حشو الفأر بنسبة 4٪ Paraform dei. يمكن تشريح الدماغ بالإضافة إلى XI بين عشية وضحاها في 4٪ يوم باراشكل.

في النهاية ، يمكن إعطاء اليورانيوم المنضب و / أو تاموكسيفين أو المكونات الأخرى قبل التضحية وفقا لنماذج مختلفة للتحقيق في حركية دورة الخلية ووقف التعبير عن الجين المعدل فيروسيا. عندما تكون محاطا بجانبها ، يمكن بعد ذلك معالجة الدماغ من أجل تلطيخ المناعة باستخدام علامات ER لتحديد السيقان والخلايا السلفية والخلايا العصبية مثل SOX two GFIP nesting T Two Double Carin أو غيرها. ويمكن استخدام هذا لتحديد نسبة مجموعات الخلايا المختلفة.

مع ذلك ، أعتقد أنك تستمتع بمشاهدة مقطع فيديو وآمل أن يكون هذا مفيدا لبحثك.