عزل الخلايا الليفية عادي والسرطان يرتبط بها من الأنسجة الطازجة من الإسفار خلية المنشط الفرز (FACS)

سرطان الخلايا الليفية المرتبطين بها (سي أي إف إس) تسهيل بدء الورم، والنمو والتقدم من خلال الإشارات التي تشجع انتشار الأسلحة النووية، الأوعية الدموية، والتهاب. نحن هنا وصف طريقة لعزل السكان نقية من الخلايا الليفية الطبيعية وسي أي إف إس من الماوس الطازجة والأنسجة البشرية عن طريق الفرز الخلية، وذلك باستخدام PDGFRα كعلامة السطح.

الهدف من هذا الإجراء هو عزل الخلايا الليفية الطبيعية والمرتبطة بالسرطان من الأنسجة الطازجة. يتم تحقيق ذلك عن طريق تشريح الغدد الثديية أولا. الخطوة الثانية هي تحضير الغدد الثديية ، ومعلقات الخلية المفردة ، والخلية التالية المدعومة بالأجسام المضادة الخاصة بالخلايا الليفية ، بالإضافة إلى الأجسام المضادة الخاصة بمجموعات الخلايا الأخرى.

الخطوة الأخيرة هي إجراء مصادر الخلايا المنشطة بالفلورة أو الحقائق. في النهاية ، يتم استخدام توصيف تعبير Q-R-T-P-C-R لعلامات محددة يتم التعبير عنها في مجموعات الخلايا المصنفة لتقييم نقاء مجموعات الخلايا التي تم فرزها. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية لعزل الخلايا الليفية هي أنها تسمح بعزل غالبية الخلايا الليفية الأنسجية مع الحد الأدنى من التلوث بالخلايا المناعية أو الخلايا الظهارية ، مع تجنب خطوة زراعة الأنسجة التي قد تغير ملف تعريف التعبير الجيني للأرومات الليفية.

يمتد تأثير هذه التقنية إلى جميع علاجات سرطان الثدي لأن فهم وتحديد الأهداف الجزيئية قد يوفر نهجا جديدا للدمج لمكافحة تطور سرطان الثدي ، وإطالة بقاء المريض على قيد الحياة والمساعدة في النهاية على تحسين وتخصيص الخيارات العلاجية الفردية. بالإضافة إلى عينك ، الدكتورة لينا وحدها ، سيوضح مدير المختبر الإجراء لبدء هذا الإجراء. ضع أنثى الفأر القتل رحيم على ظهرها على سطح الستايروفوم واستخدم 25 إبرة قياس لتثبيت الأطراف الأربعة بإحكام.

رش الماوس بسخاء بنسبة 70٪ من الإيثانول باستخدام الملقط. اسحب جلد البطن لأعلى عند خط الوسط وقم بعمل شق صغير بمقص حاد يبدأ من الشق. قطع الجلد حتى عنق مع تجنب ثقب تجاويف الصدر في البطن.

قطع الجلد على الساقين الخلفيتين من شق خط الوسط باتجاه الساق ، مما ينتج عنه شكل Y. بعد ذلك ، اسحب الجلد بعيدا عن جسم الفأر وقم بتثبيته لأسفل لتعريض الغدد الثديية المرتبطة بالجانب السفلي من الجلد. أحد أكثر الأشياء إشكالية في هذا الإجراء هو تجنب أخذ الأنسجة العضلية.

من أجل تجنب هذه المشكلة ، سآخذ فقط الغدة الثديية الرابعة والخامسة وليس الثانية ، والتي تقع على مقربة من الأنسجة العضلية. استخدم نصائح Q لفصل غدة الذاكرة برفق عن الجلد أثناء قطع الأنسجة الملتحمة بمقص حاد صغير لفصل غدة الذاكرة باتجاه العمود الفقري للفأر ، وإزالة أي مناطق نخرية موجودة. ضع غدد الذاكرة المقطعة في PBS على الجليد.

أسهل طريقة للحصول على أنسجة الجلد دون الحاجة إلى التعامل مع إزالة الشعر هي استخدام آذان الفأر. استخدم مقصا حادا لقطع كلتا الأذنين عن الفأر القتل الرحيم. ضع الأذنين على الفور في وعاء هضم يحتوي على كمية صغيرة من PBS على الثلج.

لتحضير تعليق الغدة الثديية أحادية الخلية يستخدم مقص منحني لفرم الغدد الثديية تماما في وعاء هضم يحتوي على كمية صغيرة من PBS على الجليد ، أضف 20 مل من محلول الكولاجيناز إلى الأنسجة المفرومة. ستعمل هذه الكمية من محلول الكولاجيناز على فصل ما يقرب من خمسة جرامات من أنسجة الذاكرة أو الورم والأذنين بكفاءة من ما يصل إلى 15 فأرا. ضعه على الفور على طبق التحريك في حمام مائي 37 درجة مئوية واحتضنه لمدة 15 دقيقة مع التحريك بمعدل متوسط لإيقاف التفاعل عند 30 مل من DMEM البارد بالإضافة إلى 10٪ FCS.

بعد ذلك ، قم بتصفية خليط الأنسجة والوسائط من خلال مصفاة خلية 70 ميكرون موضوعة فوق أنبوب مخروطي سعة 50 مل. جهاز الطرد المركزي للأنبوب المخروطي لمدة خمس دقائق عند 450 مرة جم عند أربع درجات مئوية. إذا لم تكن الفئران ممتلئة ب PBS قبل التضحية ، فسيتعين أن تكون خلايا الدم الحمراء في العينة أكاذيب قبل تلطيخ المناعة.

يجب حظر الخلايا من أجل FC الداخلي قبل وضع العلامات على الخلايا الليفية ومجموعات الخلايا الأخرى. يقوم Resus بتعليق الخلايا في واحد إلى ثلاثة ملليلتر من الفاكس المخزن المؤقت الأول ، ثم إضافة كتلة FC عند احتضان تخفيف واحد إلى 50 على الجليد لمدة 10 إلى 20 دقيقة. ليست هناك حاجة لغسل كتلة نقل 100 ميكرولتر من خلية نقل FC لإنهاء أنابيب orph لاستخدامها كعنصر تحكم غير ملوث وعناصر تحكم أحادية اللون.

اعتمادا على عدد الأجسام المضادة الفلورية المستخدمة في هذا العرض التوضيحي ، سيتم استخدام اثنين من الأجسام المضادة الفلورية لتسمية الخلايا الليفية في مستقبلات PDGF المضادة ألفا. يتم اقتران ذلك مباشرة مع فلور عند تخفيف من واحد إلى 50 إلى عينة الفرز بالإضافة إلى عناصر التحكم في اللون الفردي لتسمية مجموعات الخلايا الأخرى. أضف الأجسام المضادة المترافقة بالفلورسنت المناسبة إلى علامات السطح أيضا عند تخفيف واحد إلى 50.

بإضافة أجسام مضادة أيضا إلى أنابيب التحكم أحادية اللون المناسبة ، بما في ذلك الأجسام المضادة للخلايا المناعية والخلايا الظهارية من أجل استبعاد أي مجموعات موجبة مزدوجة وبالتالي تعزيز نقاء الخلايا الليفية المعزولة. بعد ذلك ، احتضان الخلايا بالأجسام المضادة لمدة ساعة واحدة على الجليد في الظلام بعد ساعة اغسل الخلايا عن طريق ملء الأنابيب بمخزن الفاكس الأول والدوران لمدة خمس دقائق عند 450 مرة G عند أربع درجات مئوية ، وخلايا ثني الشفط الأمريكية وخلايا الانحناء في الفاكس المخزن المؤقت الأول إلى التركيز الأنسب للفرز باستخدام فارز الفاكس المراد استخدامه. انقل الخلايا المسمى إلى أنابيب فاكس مع أسطح مرشح وخلايا التصفية في الأنابيب لمنع تكتل الخلايا ، والكتل لاستبعاد الخلايا الميتة.

DPI لجميع العينات باستثناء عنصر التحكم غير الملطخ. احتفظ بالعينات على الجليد أثناء تحليل الفاكس. لبدء هذا الإجراء ، استخدم برنامج فرز الحقائق لإعداد إعداد الفلورسنت وإعداد الاستحواذ وإعداد السقوط الهيدروديناميكي.

دوامة كل عينة لفترة وجيزة لإعادة تعليق الخلايا قبل تحميلها في فارز الخلايا. ابدأ بتحليل العينة غير الملوثة من أجل ضبط البوابة لإجمالي عدد الخلايا للتخلص من بقايا الخلية وتحديد التألق الذاتي أو تلطيخ الخلفية. بعد ذلك ، قم بتحليل العينة غير الملوثة بالإضافة إلى DPI لتحديد وبوابة عدد الخلايا الحية من إجمالي عدد الخلايا.

قم بتحليل كل عنصر تحكم في اللون لتحديد ومعايرة المعلمات مثل التعويض. قم بتحليل عينة البقعة لتحديد موضع البوابات للفرز. بمجرد تعيين المعلمات والبوابات لمجموعات الخلايا المرغوبة ، ابدأ في فرز مجموعات الخلايا المسماة إلى أنابيب eph أو أنابيب مخروطية سعة 15 مليلتر تحتوي على وسط ثقافة أو مخزن مؤقت لتحلل الحمض النووي الريبي.

مباشرة بعد الانتهاء من الفرز ، قم بتدوير الخلايا لأسفل ونقلها إلى وسط جديد أو مخزن مؤقت لتحلل الحمض النووي الريبي. اعتمادا على الغرض من تجربتك ، إذا تم فرزها ، يجب زراعة الخلايا الليفية ، ودائما ما تكون الألواح المطلية بالكولاجين على البلاستيك مباشرة ، لأن هذا سيؤدي إلى تنشيط الخلايا الليفية مما يؤدي إلى تغييرات في تعبيرها الجيني. يؤدي استخدام مستقبلات PDGF ألفا كعلامة للأرومات الليفية إلى عزل مجموعات عالية الإثراء من الخلايا الليفية الأنسجية.

في هذا المثال ، تم تلطيخ معلقات الخلية المفردة للغدد الثديية الفئرانية بمستقبلات PDGF ألفا و F أربعة أجسام مضادة 80. يتم عرض مخطط فرز الحقائق في اللوحة اليسرى حيث P two هي بوابة الخلايا الليفية ، و P four هي بوابة الضامة. تم إجراء تحليل لاحق للمصدر لتحديد نقاء الخلايا الليفية المصنفة الموضحة في اللوحة اليمنى والضامة الموضحة في اللوحة الوسطى.

يوضح هذا الشكل التالي تحليلا لمصادر النقاء بواسطة Q-R-T-P-C-R لجينات التحكم الخاصة بالخلية للخلايا الليفية والخلايا المناعية والخلايا الظهارية. تم تطبيع النتائج إلى جينين للتدبير المنزلي ، ga و DH و mgus ، والتعبير النسبي عن الفجوة. يظهر DH ، تظهر هذه التحليلات عادة 0.1 إلى 0.6٪ تلوث.

يسمح هذا المستوى من النقاء بتنميط النسخ عالي الجودة للأرومات الليفية المعزولة. يشير القياس الكمي لتعبير ألفا لمستقبلات PDGF في مجموعة غير مصنفة من الخلايا الليفية الثديية إلى أن ما يقرب من 85٪ من إجمالي الخلايا الليفية للأنسجة في الغدد الثديية هي مستقبلات PDGF إيجابية ألفا. لقد عزلت.

يمكن زراعة الخلايا الليفية مباشرة بعد الفرز ، ولكنها قد تتطلب بضعة أيام للتعافي. من الضروري إجراء جميع التجارب الإضافية على خلايا التدليك المنخفضة حيث تخضع الخلايا الليفية الأولية للشيخوخة أثناء التكاثر. في الثقافة ، بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في أربع ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

إذا تم تعيين الخلايا الثالثة ليتم استزراعها ، استيرادها لتذكر تنفيذ جميع الإجراءات في ظل ظروف معقمة. في هذه اللقطة ، لم نقم بإجراء نوع معقم. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل السكان المخصبين للغاية من الخلايا الليفية من الأنسجة الطازجة.