في المختبر الثقافة عضوي من أورام القولون ماوس

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء عضيات ورم القولون العصبية الأولية. يتم تحقيق ذلك عن طريق جمع أنسجة ورم القولون في الفأر أولا. الخطوة الثانية هي فصل ظهارة القولون الطبيعية المجاورة.

بعد ذلك ، يتم هضم الخلايا السرطانية في القولون إلى خلايا مفردة. تتمثل الخطوة الأخيرة في تضمين الخلايا السرطانية في القولون في ماتريجل وزراعتها بشكل انتقائي بظروف غذائية محدودة. في النهاية ، يتم استخدام الفحص المجهري الضوئي لإظهار المسار الزمني لتكوين ورم القولون العضوي.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل خطوط خلايا سرطان القولون المحولة ، هي أن الثقافات العضوية تحاكي عن كثب الحالة في الجسم الحي وتولد بيانات أكثر صلة من الناحية الفسيولوجية. بعد القتل الرحيم للفأر بثاني أكسيد الكربون وجمع القولون ، اغسل القولون باستخدام PBS. استخدم المقص لفتح القولون طوليا ، ثم ضعه تحت مجهر استريو واستخدم المقص لإزالة المناطق التي تحتوي على أورام.

اجمع وغسل أنسجة الورم باستخدام PBS. بعد الغسيل ، انقل شظايا الأمعاء إلى استخلاب EDTA ، والمخزن المؤقت ، واحتضانه على الجليد لمدة 60 دقيقة بعد الاستخلاب ، وسيتم فصل معظم الخلايا الظهارية المعوية الطبيعية بينما ستظل الخلايا السرطانية متصلة بالمكي. استنشق المخزن المؤقت للاستخلاب الذي يحتوي على خلايا ظهارية طبيعية واغسل شظايا الورم المتبقية.

مرة إضافية. مع خمسة ملليلتر من مخزن الخلب البارد. بعد شفط المخزن المؤقت للاستخلاب ، اغسل شظايا الورم بخمسة ملليلتر من بارد واحد XPBS.

بعد شفط واحد XPBS إضافة مخزن الهضم إلى شظايا الأنسجة واحتضانة لمدة ساعتين. عند 37 درجة مئوية ، اسمح لشظايا الورم بالاستقرار تحت الجاذبية العادية لمدة دقيقة واحدة ثم اجمع المادة الطافية S في أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلترا. بيليه تعليق الورم أحادي الخلية supinate عن طريق الطرد المركزي عند 200 مرة G لمدة ثلاث دقائق.

ثم اغسل مرة واحدة بخمسة ملليلتر من PBS وأجهزة الطرد المركزي. مرة أخرى ، احصل على إعادة تعليق حبيبات الورم مع 500 ميكرولتر من PBS. ثم عد الخلايا السرطانية المفردة المعزولة باستخدام مقياس الخلوي الدموي.

بعد ذلك ، قم بلف الخلايا السرطانية عن طريق الطرد المركزي عند 200 مرة G لمدة ثلاث دقائق وأعد إرسالها بخمسة ملليغرام لكل مليلتر ماتريجيل على الجليد. ثم لوحة 15 ، 000 خلية في حجم 50 ميكرولتر من ماتريجل لكل بئر في لوحة 24 بئر. بعد السماح لخليط خلايا ماتريجيل بالبلمرة لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، أضف 500 ميكرولتر من وسط الاستزراع القاعدي الذي يحتوي على 50 نانوجرام لكل مليلتر بول EGF إلى كل وسط زراعة قاعدي لتغيير الآبار يحتوي على EGF كل يومين وتدليك العضيات من واحد إلى خمسة مرة واحدة في الأسبوع للتدليك.

بعد استبدال وسط الاستزراع بوسط قاعدي جديد، استخدم ماصة P 1000 بطرف ماصة مقطوع لتعطيل العضيات والماتريجيل ميكانيكيا. انقل المعلق العضوي إلى أنبوب صقر سعة 15 مل. استخدم ماصة المعكرونة المصقولة بالنار لزيادة تعطيل العضيات.

اغسل العضيات المنفصلة بخمسة ملليلتر من الثقافة القاعدية ، متوسطة وأجهزة طرد مركزي 200 مرة جم لمدة دقيقتين. ثم تخلص من supinate ، وأعد تعليق الحبيبات باستخدام هلام ماتري واللوحة كما هو موضح سابقا لتجميد العضيات لفصل الغسيل والطرد المركزي. كما كان من قبل ، تخلص من الاستلقاء والريسوس.

قم بتعليق الحبيبات في DMEM التي تحتوي على 20٪ مصل بقري جنيني و 10٪ أكسيد ثنائي ميثيل سلف. بعد ذلك ، انقل تعليق الخلية إلى أنابيب تبريد سعة 1.5 مل. انقل الأنابيب إلى حاوية تجميد Nalgene Mr.Frosty وخزنها في فريزر 80 درجة مئوية تحت الصفر لتحقيق معدل تبريد واحد تحت الصفر درجة مئوية في الدقيقة.

بعد الحضانة بين عشية وضحاها ، انقل الخلايا إلى نيتروجين سائل. يمكن تخزين الخلايا بهذه الطريقة لأكثر من عامين. لاستخراج الحمض النووي الريبي ، يتم جمع الخلايا.

بالنسبة للمرور ، يتم عزل الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة عزل الحمض النووي الريبي النقي بيكو. وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لاستخراج البروتين ، يتم جمع حبيبات الخلية بالطريقة المعتادة ثم تكمن في 100 ميكرولتر من مخزن فحص الترسيب المناعي الراديوي للكيمياء المناعية. بعد شفط وسط زراعة الخلية، استخدم ماصة P 1000 مقطوعة لنقل عضيات الورم إلى قالب تبريد.

ضع القالب على الثلج الجاف وأضف وسط تجميد الأنسجة إلى الأجزاء المجمدة المقطوعة بالعفن عند سبعة ميكرون وصمة عار وفقا للبروتوكولات المنشورة سابقا ، تظهر هذه الصورة تكوينا عضويا تمثيليا مشتقا من ورم القولون المأخوذ من فأر يبلغ من العمر ثلاثة أشهر ، وهو فأر صغير ، بعد فترة قصيرة من الطلاء. تظهر هذه الصورة نفس العضوية بعد يوم واحد من الطلاء. هنا ، كانت العضوية في الثقافة لمدة ثلاثة أيام.

بينما تظهر هذه الصورة العضوية بعد ستة أيام من الطلاء. هنا يتم عرض نوعين من العضيات التي كانت موجودة في الثقافة لمدة 14 يوما. لاحظ أنه في هذه المرحلة ، يتكون كل عضو عضوي من مجموعة من الخلايا.

يوضح هذا الرسم البياني المعدل الناجح لتكوين العضوية في ظل حالتين مختلفتين لهضم الكولاجيناز. تظهر هذه الصور عضيات مشتقة من ورم القولون مأخوذة من فأر يبلغ من العمر ثلاثة أشهر ، وهو فأر صغير للكمبيوتر الشخصي مع تلطيخ فلورسنت مناعي لبيتا كاتينين. تم استخدام DPI لتلطيخ النوى.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء OID لورم القولون في البول الأولي عن طريق هضم الإنزيم.