عزل Myocytes الأذيني الإنسان للقياسات في وقت واحد من الكالسيوم 2 + العابرون والتيارات غشاء

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل الخلايا العضلية الأذينية البشرية المناسبة للقياسات المتزامنة للكالسيوم والعابرين والتيارات الغشائية. يتم الحصول على العينة الأذينية اليمنى من المرضى الذين يخضعون لجراحة القلب المفتوح ويتم نقلها بسرعة لبدء الإجراء. تتمثل الخطوة الأولى في الإجراء في تنظيف الأنسجة وتقطيعها إلى قطع صغيرة من الأنسجة.

الخطوة الثانية هي الهضم الأنزيمي المزدوج للأنسجة باستخدام الإنزيمات المحللة للبروتين مما يؤدي إلى عزل الخلايا العضلية الأذينية. تتمثل الخطوة الأخيرة في تحميل الخلايا العضلية بصبغة فلورية حساسة للكالسيوم. في النهاية ، ينتج عن الاستخدام المشترك للفحص المجهري الفلوري epi وتقنية مشبك التصحيح تسجيلات متزامنة لعابرات الكالسيوم مع تيارات الغشاء أو إمكانات الفعل.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في فهم الأساس الجزيئي للتشوهات في التعامل مع الكالسيوم الخلوي الكامنة وراء أمراض القلب مثل الرجفان الأذيني ، مما يدل على أن الطريقة ستكون كلوديا ليرا ، كبيرة الفنيين في مختبرنا ، يجب نقل الأنسجة الأذينية البشرية التي تم الحصول عليها من المرضى الذين يخضعون لجراحة القلب المفتوح لتطعيم المجازة التاجية ، أو استبدال الصمام التاجي بسرعة إلى المختبر في محلول النقل. بمجرد وصولك إلى المختبر ، انقل عينة الأنسجة والمحلول إلى طبق طوله 10 سم. ثم قم بإزالة الأنسجة الدهنية تقريبا باستخدام المقص.

بعد ذلك ، قم بتلويح عينة الأنسجة. احتفظ بما بين 200 و 600 ملليغرام لعزل الخلية وقم بتجميد الباقي في النيتروجين السائل للتحليل الكيميائي الحيوي. انقل الأنسجة لعزل الخلايا إلى طبق من محلول بارد خال من الكالسيوم وقم بتقطيع الأنسجة إلى قطع ملليمتر مكعب واحد لغسل الأنسجة.

انقله مع المحلول الخالي من الكالسيوم إلى الدورق المغلف. يسخن إلى 37 درجة. قم بتوفير الأكسجين من خط مغطى بطرف ماصة لمنع الفقاعات القوية.

حرك المنديل بعناية لمدة ثلاث دقائق باستخدام شريط تحريك مغناطيسي. ثم اترك الأنسجة تستقر. الآن قم بتصفية المادة الطافية بعناية من خلال شبكة نايلون 200 ميكرون.

يجب أن تبقى معظم الأنسجة في الدورق أعد ملء الدورق بمحلول دافئ خال من الكالسيوم بزاوية 37 درجة. ثم أعد قطع الأنسجة المتوترة من الشبكة إلى الدورق باستخدام الملقط وكرر إجراء الغسيل مرتين.

ابدأ هذا الجزء من الإجراء بتحضير 20 مل من محلول إنزيم 37 درجة مئوية الدافئ E الذي يحتوي على الكولاجيناز والبروتياز. صفي المحلول الخالي من الكالسيوم بعناية بعد خطوة الغسيل النهائية وأعد تعليق الأنسجة المغسولة في محلول E one. أعد الأنسجة التي تم جمعها على الشبكة إلى الدرق.

حرك التعليق بعناية لمدة 10 دقائق. ثم أضف 40 ميكرولترا من 10 مللي مولار كلوريد الكالسيوم ، واستمر في التقليب لمدة 35 دقيقة. بعد ذلك ، قم بتصفية المادة الطافية بعناية من خلال شبكة من النايلون.

يجب أن تبقى معظم الأنسجة في الدورق قم بإعداد محلول إنزيم 20 مل E اثنين يحتويان على الكولاجيناز واحد فقط ، واستخدمه لإعادة ملء الدرق. أعد الأنسجة التي تم جمعها على الشبكة إلى الدرق.

ثم أضف على الفور 40 ميكرولترا من محلول كلوريد الكالسيوم 10 مللي مولار أثناء الهضم الثاني ، واستخدم أحيانا المقص لتقطيع جلطات الأنسجة. بعد خمس دقائق ، خذ عينة من المعلق للتحقق من تفكك الخلايا تحت المجهر. استمر في أخذ العينات كل دقيقتين إلى ثلاث دقائق حتى تظهر خلايا عضلة القلب المخططة على شكل قضيب بوضوح.

ثم أوقف التحريك ، مما يسمح للأنسجة بالاستقرار. بمجرد تسويته ، قم بتصفية المادة الطافية بعناية من خلال شبكة من النايلون وفي أنبوب بلاستيكي سعة 50 مل. بعد ذلك ، قم بتعليق الأنسجة في محلول تخزين 20 مل وأعد قطع الأنسجة المتوترة من الشبكة إلى الدورق

مزيد من فصل الخلايا عن طريق الترتيب الميكانيكي اللطيف. باستخدام ماصة سعة 20 ملليلتر ، حاول تجنب تكوين الفقاعات. بعد ذلك ، قم بتصفية المادة الطافية بعناية من خلال شبكة من النايلون بعد جهاز الطرد المركزي المجهد ، وكلاهما مجموعتان من المواد الطافية عند 90 5G لمدة 10 دقائق.

لتكوير الخلايا ، تخلص من المواد الطافية عن طريق الشفط دون إزعاج مقاومة الحبيبات. كل حبيبات في 1.5 مل من محلول التخزين في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، أضف 7.5 ميكرولتر من محلول كلوريد الكالسيوم 10 ملليمولار إلى كل أنبوب وانتظر 10 دقائق.

ثم أضف 7.5 ميكرولتر إضافي من كلوريد الكالسيوم ، وانتظر 10 دقائق أخرى. بعد الانتظار ، أضف حجما ثالثا بحجم 15 ميكرولتر من 10 مللي مولار كلوريد الكالسيوم لرفع التركيز النهائي لكلوريد الكالسيوم في المحلول إلى 0.2 ملليمول. الغرض من هذا العزل هو تحقيق خلايا مناسبة لقياسات الكالسيوم داخل الخلايا.

لذلك ، من الضروري حذف أي مخازن مؤقتة للكالسيوم مثل EGGA من محلول التخزين. انقل 1.5 مل من تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة ملليلترين. يجب تنفيذ الخطوات التالية مع مراعاة حساسية الضوء لمؤشر الكالسيوم الفلوري.

الإنفلونزا يا ثلاثة. أولا ، اصنع محلول مخزون إنفلونزا مليمولي واحد أوه 3:00 صباحا. يمكن تخزين هذا المحلول عند سالب 20 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد.

بعد ذلك ، أضف 15 ميكرولترا من محلول مخزون الأنفلونزا أوه 3:00 صباحا إلى تعليق الخلية 1.5 ملليلتر. حرك الخليط بعناية واحتضان المعلق لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة في صندوق غير شفاف. بعد الحضانة ، قم بالطرد المركزي للأنسجة لفترة وجيزة عند حوالي 6 ، 000 دورة في الدقيقة.

ثم تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 1.5 مل من محلول الاستحمام. اترك معلق الخلية لمدة 30 دقيقة تقريبا لأسترة د قبل بدء التجارب. ثم تابع قياسات مشبك التصحيح المتزامنة وقياسات الكالسيوم الفلوري epi باستخدام البروتوكول الموضح.

تم عزل الخلايا العضلية من الأنسجة الأذينية وقياسها كميا على شريحة مجهر مكتشف الخلايا. يشير متوسط إنتاجية الخلايا بوضوح إلى أن هناك ميلا لخفض إنتاجية الخلايا في عينات من المرضى الذين يعانون من الرجفان الأذيني المزمن. تم تحفيز الأنفلونزا أوه ثلاث خلايا عضلية محملة عند 0.5 هرتز في تكوين المشبك الحالي لاستنباط إمكانات العمل ، وأظهرت حوالي 90٪ من الخلايا التي تم فحصها تقلصات منتظمة.

استجابة لهذا التحفيز ، يصور التحول إلى المجهر الفلوري جهد الفعل الذي أدى إلى إطلاق الكالسيوم من الشبكة الساركوبلازمية ، مما يؤدي إلى الانكماش الخلوي. تظهر التسجيلات التمثيلية من المرضى الذين يعانون من إيقاع الجيوب الأنفية والرجفان الأذيني أن sr. عادة ما يكون لإمكانات عمل المريض شكل مسمار وقبة ، في حين أن التثليث والتقصير المحتمل للفعل هي السمات المميزة النموذجية لإعادة تشكيل الأذين.

في الرجفان الأذيني ، كشف مرضى الكالسيوم العابرين داخل الخلايا المسجلين في وقت واحد عن زيادة مستويات الكالسيوم الانبساطي وانخفاض السعة العابرة للكالسيوم في الخلايا العضلية من مرضى الرجفان الأذيني لتسجيل تيارات الكالسيوم من النوع L. تم حظر تيارات البوتاسيوم باستخدام أربعة أمينو باريدين وكلوريد الباريوم. تم تحفيز الخلايا عند 0.5 هرتز في تكوين مشبك الجهد باستخدام إمكانات احتجاز سالب 80 مللي فولت مع منحدر 100 مللي ثانية إلى 40 مللي فولت تحت الصفر ونبضة اختبار 100 مللي ثانية إلى 10 مللي فولت.

تظهر التسجيلات التمثيلية أن الرجفان الأذيني يرتبط بتيار الكالسيوم المنخفض من النوع L. مرة أخرى ، زاد مستوى الكالسيوم الانبساطي ، في حين أن سعة الكالسيوم العابرة كانت أقل. في الرجفان الأذيني.

أدى تطبيق إيزوبرين ناهض مستقبلات الغدة الكظرية بيتا غير الانتقائي إلى زيادة سعة تيارات الكالسيوم من النوع L والكالسيوم العابر العصاري. في كلتا المجموعتين ، يشير هذا إلى أن الخلايا لديها سلسلة نقل إشارة بيتا الأدرينالية السليمة. أظهرت النتائج أن هذه الطريقة توفر خلايا عضلية عالية الجودة تتحمل الكالسيوم ، وهي مناسبة لمشابك التصحيح المتزامنة والقياسات العابرة للكالسيوم.

بالإضافة إلى ذلك ، قد تكون الخلايا العضلية التي تم الحصول عليها مفيدة لقياسات تقصير الخلايا أو تلطيخ المناعة أو تلطيخ TTU.