عزل Myocytes الأذيني الإنسان للقياسات في وقت واحد من الكالسيوم

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل الخلايا العضلية القلبية الأذينية البشرية المناسبة للقياسات المتزامنة لترانزيتات الكالسيوم وتيارات الغشاء. يتم الحصول على عينة الأذين الأيمن من المرضى الذين يخضعون لجراحة القلب المفتوح، وتُنقل بسرعة لبدء الإجراء. تتمثل الخطوة الأولى من الإجراء في تنظيف النسيج وتقطيعه إلى قطع نسيجية صغيرة.

تتمثل الخطوة الثانية في إجراء هضم إنزيمي مزدوج للأنسجة باستخدام إنزيمات تحليل البروتين، مما يؤدي إلى عزل الخلايا العضلية الأذينية. وتتضمن الخطوة النهائية تحميل الخلايا العضلية بصبغة فلورية حساسة للكالسيوم. وفي الختام، يتيح الاستخدام المشترك لمجهر الفلورة فوق البنفسجية وتقنية تثبيت الرقعة (patch clamp) تسجيلات متزامنة للعابرات الكالسيومية مع تيارات الغشاء أو جهود الفعل.

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في فهم الأساس الجزيئي لاضطرابات التعامل مع الكالسيوم الخلوي الكامنة وراء أمراض القلب مثل الرجفان الأذيني، وستقوم كلوديا ليرا، الفنية الأولى في مختبرنا، بتوضيح الطريقة؛ حيث يجب نقل أنسجة الأذين البشري التي تم الحصول عليها من المرضى الذين يخضعون لجراحة القلب المفتوح لعمليات تحويل مسار الشريان التاجي، أو استبدال الصمام المترالي، بسرعة إلى المختبر في محلول نقل. وبمجرد وصولها إلى المختبر، يتم نقل عينة النسيج والمحلول إلى طبق قطرُه 10 سنتيمتر. ثم يتم إزالة الأنسجة الدهنية بشكل تقريبي باستخدام المقص.

بعد ذلك، قم بوزن عينة النسيج. احتفظ بما يتراوح بين 200 و 600 milligrams لعزل الخلايا وجمّد المتبقي في النيتروجين السائل للتحليل البيوكيميائي. انقل النسيج المخصص لعزل الخلايا إلى طبق يحتوي على محلول خالٍ من الكالسيوم مبرد، وقطّع النسيج إلى قطع بحجم 1 cubic millimeter لغسل النسيج.

انقله مع المحلول الخالي من الكالسيوم إلى الكأس ذي الغلاف الحراري. يتم التسخين إلى 37 درجة. يتم توفير الأكسجين من خط مغطى بطرف ماصة لمنع حدوث فقاعات قوية.

قم بتحريك النسيج بعناية لمدة ثلاث دقائق تقريبًا باستخدام قضيب تحريك مغناطيسي. بعد ذلك، اترك النسيج يترسب. الآن، قم بتصفية السائل الطافي بعناية عبر شبكة نايلون بمسامية 200 micron.

يجب أن يظل معظم النسيج في الكأس. أعد ملء الكأس بمحلول خالٍ من الكالسيوم مُدفأ عند 37 درجة. بعد ذلك، أعد قطع النسيج المصفاة من الشبكة إلى الكأس باستخدام الملقط، وكرر إجراء الغسيل مرتين.

ابدأ هذا الجزء من الإجراء بتحضير 20 milliliters من محلول الإنزيم E one الدافئ عند 37 degrees Celsius والذي يحتوي على collagenase و protease. قم بتصفية المحلول الخالي من الكالسيوم بعناية بعد خطوة الغسيل النهائية، ثم أعد تعليق الأنسجة المغسولة في محلول E one. أعد الأنسجة التي تم تجميعها على الشبكة إلى الكأس.

قم بتقليب المعلق بعناية لمدة 10 minutes. ثم أضف 40 µL من كلوريد الكالسيوم بتركيز 10 mM، واستمر في التقليب لمدة 35 minutes. بعد ذلك، قم بترشيح السائل الطافي بعناية باستخدام مصفاة نايلون.

يجب أن يظل معظم النسيج في الكأس. قم بتحضير 20 milliliters من محلول الإنزيم E two الذي يحتوي على collagenase one فقط، واستخدمه لإعادة ملء الكأس. أعد النسيج الذي تم جمعه على الشبكة إلى الكأس.

ثم أضف فوراً 40 µL من محلول كلوريد الكالسيوم بتركيز 10 mM خلال مرحلة الهضم الثانية، واستخدم المقص من حين لآخر لتقطيع تكتلات الأنسجة. بعد خمس دقائق، خذ عينة من المعلق لفحص تفكك الخلايا تحت المجهر. استمر في أخذ العينات كل دقيقتين إلى ثلاث دقائق حتى تصبح الخلايا العضلية القلبية المخططة عصوية الشكل مرئية بوضوح.

بعد ذلك، أوقف عملية التقليب للسماح للأنسجة بالترسب. وبمجرد ترسبها، قم بتصفية السائل الطافي بعناية من خلال مشبك نايلون وفي أنبوب بلاستيكي سعة 50 milliliter. بعد ذلك، قم بتعليق الأنسجة في 20 milliliters من محلول التخزين وأعد قطع الأنسجة المصفاة من المشبك إلى الكأس.

قم بمزيد من تفكيك الخلايا عن طريق التقليب الميكانيكي اللطيف. استخدم ماصة سعة 20 milliliter، وحاول تجنب تكون الفقاعات. بعد ذلك، قم بتصفية السائل الطافي بعناية عبر شبكة نايلون، ثم قم بطرد مجموعتي السائل الطافي مركزياً عند 90 5G لمدة 10 minutes.

لترسيب الخلايا، تخلص من السوائل الطافية عن طريق الشفط دون تعكير الراسب. قم بإعادة تعليق كل راسب في 1.5 milliliters من محلول التخزين في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، أضف 7.5 microliters من محلول كلوريد الكالسيوم بتركيز 10 millimolar إلى كل أنبوب وانتظر لمدة 10 دقائق.

ثم أضف 7.5 µL إضافية من كلوريد الكالسيوم، وانتظر لمدة 10 دقائق أخرى. بعد فترة الانتظار، أضف حجماً ثالثاً قدره 15 µL من كلوريد الكالسيوم بتركيز 10 mM ليصل التركيز النهائي لكلوريد الكالسيوم في المحلول إلى 0.2 mM. الغرض من هذا العزل هو الحصول على خلايا مناسبة لقياسات الكالسيوم داخل الخلايا.

لذلك، من الضروري استبعاد أي محاليل منظمة للكالسيوم مثل EGGA من محلول التخزين. انقل 1.5 milliliters من معلق الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 milliliter. يجب تنفيذ الخطوات التالية مع مراعاة الحساسية الضوئية لمؤشر الكالسيوم الفلوري.

Flu O₃. أولاً، قم بتحضير محلول مخزون من Flu O₃ بتركيز 1 mM. يمكن تخزين هذا المحلول عند درجة حرارة -20 °C لمدة تصل إلى أسبوع واحد.

بعد ذلك، أضف 15 µL من المحلول المخزون من flu oh 3:00 AM إلى معلق الخلايا بحجم 1.5 mL. رُج المزيج بعناية واحضن المعلق لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة داخل صندوق معتم. بعد فترة الاحتضان، قم بطرد مركزي سريع للأنسجة عند حوالي 6,000 RPM.

بعد ذلك، تخلص من السائل الطافي وأعد تعليق الراسب في 1.5 milliliters من محلول الحمام. اترك معلق الخلايا لمدة 30 دقيقة تقريباً لعملية d esterification قبل البدء في التجارب. ثم ابدأ بإجراء قياسات patch clamp والفلورة فوق البنفسجية للكالسيوم (epi fluorescent calcium measurements) بشكل متزامن باستخدام البروتوكول الموضح.

تم عزل الخلايا العضلية القلبية من أنسجة أذينية وتقدير كميتها باستخدام شريحة مجهرية مخصصة للبحث عن الخلايا. وتشير متوسطات إنتاجية الخلايا بوضوح إلى وجود ميل لانخفاض إنتاجية الخلايا في العينات المأخوذة من المرضى الذين يعانون من رجفان أذيني مزمن. تم تحفيز الخلايا العضلية القلبية المحملة بـ Flu oh three بتردد 0.5 hertz في وضع تثبيت التيار لاستثارة جهود الفعل، وأظهرت حوالي 90% من الخلايا المفحوصة انقباضات منتظمة.

استجابةً لهذا التحفيز، يتيح الانتقال إلى المجهر الفلوري رؤية إطلاق الكالسيوم من الشبكة الساركوبلازمية الذي يحفزه جهد الفعل، وهو ما يؤدي بدوره إلى بدء الانقباض الخلوي. وتظهر التسجيلات النموذجية من المرضى الذين يعانون من نظم جيبي ورجفان أذيني أن جهود الفعل لدى المرضى عادةً ما تتخذ شكلاً يتكون من ذروة وقبة، بينما يعد تثليث جهد الفعل وتقصره من العلامات المميزة لإعادة تشكيل الأذين.

كشفت التسجيلات المتزامنة للعوامل العابرة للكالسيوم داخل الخلايا في المرضى المصابين بالرجفان الأذيني عن ارتفاع مستويات الكالسيوم الانبساطية وانخفاض سعة العوامل العابرة للكالسيوم في الخلايا العضلية القلبية لهؤلاء المرضى، وذلك لتسجيل تيارات الكالسيوم من النوع L. تم حظر تيارات البوتاسيوم باستخدام four amino paridine وكلوريد الباريوم. تم تحفيز الخلايا بتردد 0.5 hertz في وضع تثبيت الجهد (voltage clamp) باستخدام جهد تثبيت قدره -80 millivolts مع زيادة تدريجية لمدة 100 milliseconds إلى -40 millivolts ونبضة اختبار لمدة 100 millisecond تصل إلى 10 millivolts.

تظهر التسجيلات التمثيلية أن الرجفان الأذيني يرتبط بانخفاض في تيار الكالسيوم من النوع L. ومرة أخرى، ارتفع مستوى الكالسيوم الانبساطي، بينما انخفض سعة عابر الكالسيوم في حالة الرجفان الأذيني.

أدى تطبيق الإيزوبرين، وهو محفز غير انتقائي لمستقبلات بيتا الأدرينالية، إلى زيادة سعة تيارات الكالسيوم من النوع L والTransient الكالسيومي السيتوزولي. ويشير ذلك في كلتا المجموعتين إلى أن الخلايا تمتلك شلال نقل إشارة بيتا أدرينالية سليم. وتظهر النتائج أن هذه الطريقة توفر خلايا عضلية قلبية ذات جودة عالية ومتحملة للكالسيوم، مما يجعلها مناسبة لقياسات تثبيت الرقعة (patch clamp) وTransient الكالسيوم في آن واحد.

بالإضافة إلى ذلك، قد تكون الخلايا العضلية التي تم الحصول عليها مفيدة لقياسات تقصير الخلايا، أو التلوين المناعي، أو التلوين بـ TTU.