لين العريكة التهابات خلايا الثدييات مع طفيل وحيد الخلية، تستعد البكتيريا

الهدف العام من هذا الإجراء هو حصاد وتحديد البكتيريا القابلة للتتبع الفلورية من مضيف وسيط للعدوى اللاحقة للخلايا المضيفة للثدييات. هنا يتم استخدام Legionella mala التي تعبر عن GFP لإصابة الأميبا الأولية المضيفة الطبيعية acan ، طبقات أحادية الكاستيلانية. ثم يتم حصاد el mala عن طريق التحلل الانتقائي ثم يتم حساب تركيز البكتيريا باستخدام صيغة تعتمد على تخفيف انبعاث التألق للأوليات.

ثم تستخدم البكتيريا الجاهزة لإصابة الطبقات الأحادية لخلايا الثدييات. أخيرا ، يتم تحديد عدد البكتيريا المعدية في خلايا الثدييات باستخدام مزيج من المجهر الفلوري وقياس التدفق الخلوي ومحللات الطلاء لاستعادة وحدات تشكيل المستعمرة. توضح البيانات الناتجة ميزة مسببة للأمراض مكتسبة للبكتيريا التي تمت زراعتها في الخلايا الأولية في مرحلة التحضير عند مقارنتها بنفس السلالة التي تمت زراعتها في وسط اصطناعي.

لقد طورنا هذه التقنية من خلال ملاحظة أن التعبير عن عوامل ضراوة معينة في البكتيريا لا يمكن إحداثه من خلال الزراعة في المختبر وحدها. تستخدم نماذج العدوى النموذجية للطبقات الأحادية المستنبتة من الخلايا في المختبر البكتيريا المستنبتة للفيلقية والعديد من البكتيريا الأخرى. توفر البروتيازومات خزانا طبيعيا للتكاثر حيث تكتسب البكتيريا ميزة مسببة للأمراض.

تسمح التقنية التي سنصفها بالقياس الكمي للبكتيريا الأولية للبروتيازوم من أجل قياس مساهمة عامل الفوعة الذي يتم إنتاجه فقط في سياق النمو داخل الخلايا. وعرض الإجراء سيكون بيندون. مساعد باحث سام رينان ، وهو أيضا مساعد باحث وعمري لاما ، زميل ما بعد الدكتوراه ، ابدأ هذا الإجراء باستخدام التثقيب الكهربائي لتحويل جميع سلالات L pneumophila المستخدمة في الفحص باستخدام البلازميد PAM 2 39 ، والذي يشفر IPTG المحفز GFP يحتضن البكتيريا لمدة ثلاث ساعات على شاكر عند 37 درجة ، باستخدام بكتيريا خط الموزعة من كل تحول إلى صفيحة واحدة وتحتضن لمدة 72 ساعة عند 37 درجة مئوية.

بعد ثلاثة أيام ، انقل مستعمرة واحدة من السلالة البكتيرية إلى ثلاثة ملليلتر من الوسط يحتوي على IPTG واحد مليمولار ، وزراعته طوال الليل إلى مرحلة ثابتة على شاكر مداري عند 37 درجة مئوية. في اليوم التالي ، انقل 10 ميكرولترات من المزرعة إلى شريحة زجاجية وقم بتطبيق زلة غطاء. ثم اعرض الشريحة تحت المجهر لتأكيد تعبير GFP.

باستخدام هدف 60 × تحت مرشحات الإثارة والانبعاث المناسبة ، يجب رؤية العديد من القضبان البكتيرية أن اللون الأخضر الفلوري النقي عند عرضه باستخدام قناة GFP في المجهر ، إذا كانت جميع البكتيريا تتألق ، فستستعد لإصابة الأموبي عن طريق تخفيف 100 ميكرولتر من كل مزرعة في المختبر إلى واحد إلى 10 في H2O المعقم. اصنع فارغا باستخدام 100 ميكرولتر وسيط YE يحتوي على مللي مولار IPTG واحد 6.25 ميكروغرام لكل مليلتر في الكلورامفينيكول و 900 ميكرولتر ماء. بعد ذلك ، خذ قياسات OD 600 للتخفيف باستخدام مقياس الطيف الضوئي ، باستخدام الصيغة الواردة في المستند المصاحب.

احسب الحجم اللازم لإصابة بئر بمضاعفة العدوى أو وزارة الداخلية 20 لكل ثقافة في المختبر. قبل 24 ساعة من بدء المزارع السائلة البكتيرية ، استبدل الوسط في مزارع acan MEbA castellani ABI. في اليوم التالي ، اجمع الخلايا وعدها باستخدام مقياس الخلوي الدموي.

للقيام بذلك ، قم بإزاحة الخلايا عن طريق النقر على القارورة ونقل عينة إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل. بعد ذلك ، امزج aliquot مع الصبغة الزرقاء trian وقم بتحميلها على شريحة مقياس الخلوي hemo. بعد عد الخلايا تحت المجهر الضوئي ، قم بتخفيف الأموبي بوسط جديد إلى تركيز نهائي واحد في 10 إلى الخلايا السادسة لكل مليلتر باستخدام بذرة ماصة متكررة.

12 لوحة ثقافة الروح الحسنا مع مليلتر واحد من درجة حرارة الغرفة المحتضنة ABI بين عشية وضحاها. أصعب جانب في هذا الإجراء هو العدوى القوية أثناء خطوة التحضير. للمساعدة في تحقيق ذلك ، نستخدم ماصة يدوية عند غسل الأميبا لمنع الخسارة.

الأميبا ليست ملتصقة بشكل خاص ويمكن فقدانها أو إزالتها بسهولة أثناء خطوات الغسيل أو استبدال الوسائط. بعد الحضانة ، استخدم ماصة مصلية سعة 10 ملليلتر وماصة يدوية لغسل آبار ألواح زراعة خلايا الآبار المكونة من 12 لوحة ثلاث مرات باستخدام مليلتر واحد من PBS المعقم. بعد شفط PBS ، أضف ملليلترا واحدا من وسط العدوى لكل منهما.

حسنا ، ثم احتضان الأطباق في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك ، قم بإصابة كل بئر بوزارة الداخلية 20 عن طريق إضافة المعلق البكتيري إلى وسط العدوى في كل بئر طرد مركزي للوحة عند 400 مرة G لمدة خمس دقائق. بعد الدوران ، قم بتعويم اللوحة في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.

انقل اللوحة إلى حاضنة ثاني أكسيد الكربون 37 درجة مئوية 5٪ لمدة 18 ساعة. بعد الحضانة ، يوجد مجهر مضان لتأكيد العدوى بعد خطوة فتيلة ناجحة. يجب أن تحتوي 90٪ من الخلايا المضيفة على VAEs كبيرة مأهولة ببكتيريا تعبر عن GFP والتي تظهر على شكل هلال أخضر كما هو موضح في تباين الطور المدمج وصور الفلورة.

في هذا الوقت ، حققت معظم خلايا عين Castin أقصى قدر من الأحمال البكتيرية ، ومع ذلك فإن تحلل السكان ضئيل. تحت الفحص المجهري الضوئي ، يجب أن يظهر الأموبي مستديرا ومنفصلا. يجب ألا تنمو النقطة ، وهي سلالة متحولة لا يمكنها دعم نقل المؤثرات بوساطة ICM في العين المصبوبة.

لذلك ، يجب الكشف عن الحد الأدنى من التألق. سيظهر الأموبي مسطحا ويجب أن تكون الطبقة الأحادية سليمة. كان من المفترض أن يكون سرطان الدم البشري أحادي الخلية الحاد أو THP خلية واحدة ، والتي تعمل كخلايا مستهدفة ، قد تم تحضيرها على صفيحة 12 بئر كما هو موضح في المستند المصاحب.

اغسل خلية THP ثلاث مرات باستخدام PBS. ثم أضف ملليلتر واحد من RPMI 1640 الطازج مع 10٪ FBS لكل بئر احتضان TP خلية واحدة لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون. لتحضير المحللة البكتيرية ، استنشق الوسط من رئيس إلى توبي.

ثم لإلقاء القمل عليها ، أضف 500 ميكرولتر من الثلج والماء البارد والمعقم والمرشح للغاية وضعه على الثلج لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، اسحب المحللات حسب الإجهاد. اكتب أنابيب مخروطية سعة 15 مليلتر لتحديد التألق الكلي.

قم بقياس الانبعاث عند 512 نانومتر لكل من الليسات المجمعة. باستخدام لوحة 96 بئر في قارئ لوحة مضان ، احسب قياس OD 600 للمحللات المجمعة وفقا للصيغة. في المستند المصاحب ، استخدم محللات الأموبي غير المصابة الخاضعة لنفس الظروف التجريبية مثل الأميبا المصابة لتحديد خلفية المحلل.

ثم لكل تجمع محلل ، احسب الحجم اللازم لإصابة بئر من الخلايا المستهدفة بوزارة الداخلية 20. احتفظ بالمحللات على الجليد للحد من أي تغييرات في التعبير الجيني البكتيري. قبل الإصابة ، في غضون 30 دقيقة من التحلل ، قم بإصابة ثلاثة آبار من خلية TP واحدة لكل حالة في وزارة الداخلية المحسوبة.

يسمح استخدام المحللات المجمعة لمجموعة من الآبار بالبقاء غير مصابة ، مما يعمل كعنصر تحكم سلبي. لتحليل التدفق الخلوي. الطرد المركزي للوحة عند 400 مرة G لمدة خمس دقائق.

بعد الدوران ، قم بتعويم اللوحة في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. انقل اللوحة إلى حاضنة ثاني أكسيد الكربون 37 درجة مئوية 5٪ لمدة ساعة واحدة ، بعد ساعة واحدة من الإصابة. استنشق الوسط واغسل الآبار ثلاث مرات.

باستخدام PBS ، أضف ملليلتر واحد من RPMI 1640 الطازج الذي يحتوي على 10٪ FBS إلى الآبار وأعد اللوحة إلى الحاضنة. احتضان خلية TP واحدة لمدة 14 إلى 16 ساعة لتحديد مستويات العدوى في كل من مرحلة التحضير وعدوى مرحلة الخلية المستهدفة. قم بتصوير الآبار المصابة باستخدام مجهر مضان بتكبير 10 × أو 20 ×.

ثم لتحديد عدوى الخلية المستهدفة عن طريق قياس التدفق الخلوي عيون التربسين ، فإن THP المصابة خلية واحدة وغسلها برفق من الآبار عن طريق الخلط في PBS. باستخدام ماصة ، اسحب الخلايا في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 ملليلتر ، ثم جهاز الطرد المركزي عند 1 ، 800 مرة G لمدة دقيقتين. بعد الدوران ، قم بإعادة تعليق الكريات في مليلتر واحد من PBS تدور مرة أخرى عند 1 ، 800 مرة G.If بعد إعادة تعليق الكريات في PBS ، تكون المعلقات الناتجة عكرة للغاية.

يجب تخفيفها من واحد إلى ثلاثة في PBS إضافي لمنع انسداد الخطوط في مقياس التدفق الخلوي باستخدام الخلايا المستهدفة غير المصابة ، ورسم مبعثر الجانب الأمامي على مقياس التدفق الخلوي بمجرد ضبطه ، وجمع 20،000 حدث إجمالي لكل عينة إصابة بالخلية المستهدفة باستخدام إثارة ليزر 488 نانومتر وقناة FL واحدة. بعد نقل البيانات إلى جهاز كمبيوتر منفصل لتحليل المشية ، قم بتجميع خلايا ما بعد الالتقاط لاستبعاد الخلايا غير المصابة ورسم شدة التألق في الرسم البياني كما هو موضح هنا ، افحص كفاءة العدوى عن طريق طلاء CFU للخلايا التي تم حصادها لقياس التدفق الخلوي. قم بإعداد التخفيف التسلسلي للعينات في الماء شديد الترشيح عند 10 إلى سالب واحد 10 إلى سالب اثنين و 10 إلى سالب ثلاثة صفيحة 20 ميكرولتر من كل تخفيف على ثلث صفيحة A-C-Y-E-A مع 6.25 ميكروغرام لكل ملليلتر من الكلورامفينيكول.

احتضان الصفائح عند 37 درجة مئوية لمدة 72 ساعة بعد الحضانة. عد المستعمرات باستخدام عود أسنان وعداد الخلايا للحصول على مجموعة من البكتيريا الأولية الأولية. سلالات الفيس البرية من النوع L المستحثة للتعبير عن GFP.

تم استخدامها لإصابة طبقات أحادية كاستيلاني لمدة 18 ساعة في وزارة الداخلية 20. ثم تم استخدام البكتيريا التي تعبر عن GFP لإعادة إصابة الأموبي في مرحلة الخلية المستهدفة لمقارنة البكتيريا الأولية الأولية مع البكتيريا المستنبتة في المختبر. تم تحضين طبقات أحادية القلعة.

18 ساعة في وزارة الداخلية من 10 كما يتضح من هذه الصور المجهرية ، تتمتع البكتيريا الأولية الأولية الأولية بميزة مسببة للأمراض كبيرة على البكتيريا المستزرعة في المختبر في نفس وزارة الداخلية لتحديد عدوى البلاعم الخلوية المستهدفة باستخدام البكتيريا الأولية والبكتيريا الجاهزة. أصيبت البلاعم المميزة THP واحدة بالنوع البري L pneumophila الذي تم حصاده من عدوى مرحلة البروتيازوم والتحضير لمدة 14 ساعة. ثم تم إجراء قياس التدفق الخلوي لتحديد العدوى كما هو موضح هنا.

التحول الصحيح في التألق هو مقياس لإجمالي الخلايا المصابة في السكان. يمكن ربط زيادة شدة إشارة الفلورسنت بعدد البكتيريا لكل مضان من البلاعم غير المصابة TP ، وتظهر البلاعم باللون الأحمر ويظهر مضان الخلايا المصابة باللون الأخضر. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في حوالي أسبوعين إجمالا إذا تم تنفيذ كل شيء بدقة.

تذكر أنه أثناء القيام بهذا الإجراء من المهم عدم إزعاج البروتيازوم والطبقة الأحادية. سيساعد استخدام الماصة اليدوية أثناء خطوات الغسيل على زيادة إنتاجية العدوى الجاهزة. لا تنس أن العمل مع الفيلقية يمكن أن يكون ثيبا خطيرا.

لذا اتخذ الاحتياطات مثل منع إنتاج الهباء الجوي أثناء تنفيذ هذا الإجراء.