يعيش التصوير خلية من الأحداث الالتهام الذاتي المبكر: Omegasomes وما بعدها

الوقت الفاصل بين المجهري من علامات الالتهام الذاتي fluorescently المسمى يسمح رصد استجابة الالتهام الذاتي ديناميكية مع القرار الزماني عالية. باستخدام الالتهام الذاتي محددة وعلامات عضية في مزيج من 3 ألوان مختلفة، ونحن يمكن أن يتبع مساهمة بروتين لتشكيل جسيم بلعمي ذاتي في سياق المكاني والزماني قوية.

الهدف العام من هذا الإجراء هو التقاط تكوين lc ثلاثة البلعمات الذاتية الإيجابية جنبا إلى جنب مع الميكروسومات والليزوزومات. يتم تحقيق ذلك باستخدام خلايا HEC 2 9 3 T التي عبرت بثبات عن GFPD FCP علامة واحدة لمناطق أوميغا ونقلها باستخدام Ccfp lc ثلاثة واحد وتمييز الجسيمات الحالة باستخدام متتبع ليو أحمر. الخطوة الثانية هي تحضير غرفة الحضانة.

بعد ذلك ، يتم وضع غرفة الحضانة على مرحلة المجهر ويتم استبدال الوسط الغني بوسط تجويع للحث على استجابة الالتهام الذاتي. الخطوة الأخيرة هي تحديد الخلايا المناسبة وتعيين معلمات الفحص المجهري للفيديو. في النهاية ، يتم استخدام تصوير الخلايا الحية لإظهار أن البلعمات الثلاثة الإيجابية LC تنشأ من مناطق أوميغا موجبة DFCP ، وتندمج في النهاية مع الجسيمات الحالة.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل تصوير الخلايا الثابتة ، هي أنه يمكننا مراقبة تطور الأحداث في نفس الخلايا بعناية بمرور الوقت. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في فشل PHA ، مثل سبب الأحداث التي أدت إلى تكوين التركيز. تستخدم هذه الدراسة خط خلايا HEC 2 9 3 T الذي يعبر بثبات عن GFPD FCP علامة واحدة A لمناطق أوميغا ، وهي هياكل مقدمة تؤدي إلى تكوين البلعمة الذاتية قبل 48 ساعة من تصوير الخلايا الحية.

شاهد عددا منخفضا من التمرير للخلايا على زلات غطاء دائري 22 ملم في ثقافة DMEM بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون إلى طلاقة مشتركة من 30 إلى 40٪ في اليوم التالي. أعد مزيج مركب التعداء لكل لوحة تحتوي على المزيج الأمثل ، ومتوسط المصل المنخفض G تسعة الحمض النووي ، وكاشف التعداء ، و P-E-C-F-P lc ثلاثة بلازما DNA lc. الثالث هو البروتين المثير للاهتمام الذي سيتم تحليل مساهمته في تكوين البلعمة الذاتية في هذه التجربة ، وخلطها برفق عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل ، ثم احتضانها لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، قم بشفط الوسط من ألواح الخلايا وأضف DMEM الطازج إلى 37 درجة مئوية. أضف مركب التعدي إلى الخلايا واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة. بعد 24 ساعة ، يجب أن تكون الخلايا ملتصقة بنسبة 80٪ وجاهزة لتصوير الخلايا الحية إذا كنت تستخدم علامة عضية.

في التجربة ، قم بإزالة كمية ملليلترين من جهاز تعقب ميتو أو جهاز تعقب ليو معد مسبقا يحتوي على وسط وقم بتسخينه إلى 37 درجة مئوية. في هذه التجربة ، سيتم استخدام متتبع Lyo الأحمر لتمييز وسط الشفط للجسيمات الحالة من الخلايا المنقولة. استبدلها بجهاز تعقب ليو الذي يحتوي على خلايا متوسطة واحتضان الخلايا لمدة 30 إلى 60 دقيقة.

لبدء هذا الإجراء ، قم بتنظيف الحلقات المعدنية والبلاستيكية باستخدام 75٪ من الإيثانول وتطبيق شحم السيليكون على حافة الحلقة المعدنية O. باستخدام الملقط ، قم بإزالة زلة الغطاء من اللوحة وجفف الوسط الزائد من الجانب السفلي من زلة الغطاء. هذا لتجنب خلط الكثير من الوسط مع الشحوم ، مما يزيد من احتمالية التسرب.

اترك زلة الغطاء لتستقر على حافة الحلقة البلاستيكية O وقم بتركيب الحلقة المعدنية O أعلى الحلقة البلاستيكية O مع وضع زلة الغطاء بينهما. من أجل إنشاء غرفة مغلقة ، قم بتعبئة الغرفة بالوسط من اللوحة من هذه النقطة فصاعدا ، تجنب الحضانة المطولة للخلايا في وسط DMEA بدون عامل تخزين مؤقت لمنع التغيرات في الأس الهيدروجيني. بعد ذلك ، ضع غرفة الحضانة على مرحلة المجهر لتجويع الخلايا وإحداث استجابة الالتهام الذاتي.

استنشق الوسط الكامل واغسله مرتين بملليلترين من وسط الجوع. بعد الغسيل الثاني ، أضف ملليلترين من وسط الجوع الطازج واضبط المؤقت على نظام تصوير مناسب تم تكوينه لمضان epi واسع النطاق للخلية الحية مطلوب لهذه التجربة. يشتمل هذا النظام عادة على إطار مجهر مقلوب من الدرجة البحثية ، ومرايا ومرشحات مصدر ضوء واسع الطيف مكثفة خاصة ببروتينات الفلورسنت أو الأصباغ ذات الأهمية ، وعدسة موضوعية عالية الجودة ، وكاميرا C-C-D-S-C-M-O-S حساسة وغرفة حضانة.

العامل الأكثر أهمية هو استخدام نظام عالي الحساسية بحيث يمكن الحفاظ على مستويات التعبير لمراسلي الفلورسنت عند الحد الأدنى من حيث اختيار الخلايا المناسبة لتصوير الخلايا الكبيرة والمسطحة التي ستسمح بالتقاط المزيد من أحداث تكوين البلعمة الذاتية. بالإضافة إلى ذلك ، حدد الخلايا التي بدأت بالفعل في إنتاج عدد أكبر من مناطق أوميغا. استخدم عدسة تكبير عالية لمنع التبييض الضوئي ، واضبط شدة ضوء الإثارة على 10 إلى 20٪ كحد أقصى.

اضبط الكاميرا على تعريض ضوئي من 100 إلى 500 مللي ثانية ، يدور اثنان في اثنين وكسب 100. اضبط معدل الحصول على الصورة على إطار واحد كل 10 ثوان. ابدأ التقاط الفيديو بعد 30 دقيقة أو بعد استجابة الالتهام الذاتي من أجل التقاط نسبة أكبر من أحداث تكوين البلعمة الذاتية لكل فيديو.

في هذه الدراسة ، تم تجويع الخلايا التي تعبر عن G-F-P-D-F-C-P واحد و CCF PLC ثلاثة لمدة 30 دقيقة ثم تم تصويرها بمعدل إطار واحد كل 10 ثوان. يظهر هذا الفيديو حدث تكوين البلعمة الذاتية. معدل التشغيل أربعة إطارات في الثانية.

مونتاج لحدث تكوين البلعمة الذاتية التمثيلي الذي تم التقاطه في الفيديو في هذا الشكل ، حيث تشير الإشارات من القناة الخضراء التي تشير إلى DFCP واحد باللون الأخضر الزائف والإشارات من القناة الزرقاء التي تشير إلى lc ثلاثة هي لون أحمر زائف. يصبح تكوين منطقة أوميغا واضحا من الإطار الثاني على شكل بقعة صغيرة يشار إليها السهم. تبدأ منطقة أوميغا في التوسع من أجل تشكيل الهيكل المميز الذي يشبه الحلقة ويصل إلى أقصى قطر لها بعد حوالي ست دقائق.

بعد ذلك ، تبدأ منطقة أوميغا في الانهيار وتختفي في النهاية بعد حوالي 10 دقائق. عندما يتم وضع تكوين الهيكل الإيجابي الثلاث أو البلعمة الذاتية في سياق تكوين منطقة أوميغا ، لوحظ أن البلعمة الذاتية تظهر بعد منطقة أوميغا وتصبح مرئية بوضوح. بعد حوالي دقيقة ونصف ، يبدأ البلعمة الذاتية في التوسع ارتباطا وثيقا ببقعة منطقة أوميغا ثم يرن عندما تبدأ منطقة أوميغا في الانهيار ، وتنفجر براعم البلعمة الذاتية.

في النهاية ، يبقى البلعمة الذاتية في الخلف على ما يبدو للاندماج مع الجسيمات الحالة بعد اختفاء منطقة أوميغا. في هذا الفيديو التالي ، تمت إضافة متتبع الليزوزوم المشار إليه باللون الأزرق من أجل التقاط الارتباط الزمني والمكاني للبلعمة الذاتية المكونة. مع الجسيمات الحالة ، يكون معدل التشغيل أربعة إطارات في الثانية.

السهم أولا إلى تكوين منطقة أوميغا وثانيا ، اندماج البلعمة الذاتية مع الجسيم المحلل. هذا الشكل عبارة عن مونتاج للأحداث التي تم التقاطها في الفيديو كما هو موضح في رأس السهم. بعد دقائق قليلة من انهيار منطقة أوميغا ، يبدأ الجسيم الذاتي الناشئ في الارتباط بالجسيمات الحالة وفي النهاية يندمج مع اندماج واحد للجسيم الليزومي مع الجسيم الليزومي ، ويروي إلى حد كبير مضان CFPL C3 ، ويفترض أنه يرجع ذلك إلى تعرض علامة CFP للبيئة الحمضية للجسيم الليزومي.

ومع ذلك ، يمكن أن يؤدي نفس النوع من التحليل في بعض الأحيان إلى نتائج غير قابلة للتفسير لمجموعة متنوعة من الأسباب. في هذا المثال ، تصبح النتائج غير قابلة للتفسير بسبب الانجراف في التركيز. يظهر تحليل الصور أن تكوين البلعمة الذاتية يتم التقاطه بنجاح عن طريق الفيديو في البداية.

ومع ذلك ، يحدث انجراف في التركيز بعد علامة الثلاث دقائق. يستمر التقاط الفيديو خارج نطاق التركيز لمدة ست دقائق ، ولكن في النهاية يتم تصحيح التركيز يدويا بعد علامة التسع إلى 10 دقائق. لسوء الحظ ، يجعل هذا التحليل من المستحيل التمييز بين ما إذا كان حدث تكوين البلعمة الذاتية الذي تم التقاطه عند تصحيح التركيز هو الحدث الأولي الذي أوشك على الانتهاء ، أو حدث جديد بدأ بعد الانجراف في التركيز.

لمنع الانجراف في التركيز ، يجب مراقبة الفيديو باستمرار وإجراء التصحيحات حسب الحاجة ، إما يدويا أو باستخدام ميزة التركيز التلقائي في المجهر إذا كانت متوفرة. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في مدة لا تزيد عن ساعة واحدة لكل فيديو فيلم إذا تم تنفيذها بشكل صحيح. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إعداد مجهر لتطبيقات تصوير الخلايا الحية ، بما في ذلك متابعة تكوين البلعمة الذاتية مع الميكروسومات والليزوسومات.