الأيضية وصفها وغشاء التقطير للالمقارن تحليل البروتين من نبات الأرابيدوبسيس thaliana الثقافات تعليق خلية

الهدف العام من التجربة التالية هو فصل المقصورات الفرعية للأغشية المختلفة ودراسة تركيبتها البروتينية التفاضلية. يتم تحقيق ذلك من خلال وضع العلامات النظيرية المستقرة للخلايا في ظل ظروف مختلفة للسماح بتمايز العلاجات. في التحليل الطيفي الكتلي كخطوة ثانية يتم خلط مادة الخلية من المعالجتين ، مما يضمن معالجة مشتركة ويقلل من تباين العينة إلى العينة.

يتم تنقية المقصورات الفرعية لغشاء البلازما التالية وفصلها إلى مقصورات فرعية معقمة وغنية ومعقمة مستنفدة بواسطة السكروز. يتم الحصول على نتائج الطرد المركزي المتدرج التي تظهر وفرة البروتين التفاضلي في المقصورات الفرعية تحت معالجات مختلفة بناء على بيانات من قياس الطيف الكتلي الكمي. الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول على الطرق الحالية ، مثل النشاف الغربي ، هي أنه يمكننا تسجيل توزيع المقصورة الفرعية لآلاف البروتينات كميا وبالتالي اكتشاف مرشحين جدد لعمليات الإشارات.

العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب تعلم تنقية نظام ثنائي الطور. والسبب في ذلك هو أنه ينطوي على الكثير من الخطوات والتحكم الدقيق والتعامل الشامل مهم للغاية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الإشارات من خلال اكتشاف بروتين مرشحين جدد كمنظمين لعمليات الأغشية ابدأ بزراعة مزارع تعليق الخلايا ذات العلامات التجارية وغير المسماة كما هو موضح في بروتوكول النص.

تقوم الخلايا المتجانسة من حوالي لتر واحد من مزارع تعليق الخلايا التي يبلغ عمرها سبعة أيام في النيتروجين السائل بخلط نفس الكميات من مزارع الخلايا المجمدة المصنفة وغير المسماة بناء على الوزن الطازج في دورق وإضافة مجلدين من المخزن المؤقت H ، ضع الدورق على الفور على شاكر ورجها حتى تذوب المادة وبدون ثلج. تقوم البلورات بتصفية التجانس من خلال طبقة واحدة من قماش المرآة إلى أنابيب طرد مركزي سعة 250 مليلتر بعد موازنة العينات باستخدام جهاز طرد مركزي H عازل عند 10 ، 000 Gs لمدة ثماني دقائق. بعد الطرد المركزي ، قم بتحميل snat في أنابيب طرد مركزي فائقة البرودة مسبقا بحجم حوالي 32 ملليلترا.

بعد موازنة العينات مع حبيبات الميكروسومات عن طريق الطرد المركزي عند 100 ، 000 جي ثانية وأربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة المادة الطافية ، يحتوي المادة الطافية على بروتينات قابلة للذوبان. يمكن حفظ كمية صغيرة من هذا الكسر لمزيد من ترسيب البروتين ، والتحليل اللاحق للبروتينات القابلة للذوبان يعيد تعليق الحبيبات الغشائية لكل عينة بالكمية المعنية من المخزن المؤقت R كما هو موضح في تحميل بروتوكول النص على الجزء العلوي من نظام U ذو الطور الواحد.

إذا تم استخدام نظام ثنائي الطور بسعة ستة جرامات ، فقم بتحميل جرامين بالضبط من الحبيبات الغشائية المعلقة بنفس حجم المخزن المؤقت النقي R المستخدم في تعليق إعادة تشكيل العينة على U2. امزج ببطء أنابيب U one و U2 عن طريق قلبها 30 مرة بمعدل انعكاس واحد تقريبا في الثانية ، وأجهزة الطرد المركزي للعينات عند 1500 Gs وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة المرحلة العليا من U2. انقل المرحلة العليا من U واحد إلى U2 قبل تكرار الطرد المركزي باستخدام نفس المعلمات. بعد ذلك ، انقل المرحلة العليا من U2 إلى أنابيب الطرد المركزي الفائقة المخففة بخمسة أحجام من المخزن المؤقت R واخلطها جيدا بالطرد المركزي للعينات عند 200 ، 000 جي ثانية وأربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة.

أخيرا ، أعد الاستخدام. قم بتعليق حبيبات الغشاء في كمية صغيرة من المخزن المؤقت T و E لعزل الأغشية المقاومة للمنظفات. بعد التحقق من تركيز جزء غشاء البلازما بواسطة مقايسة برادفورد ، أضف Triton X 100 إلى جزء غشاء البلازما عند منظف إلى بروتين ، ونسبة الوزن إلى الوزن بين 13 و 15 ، وتركيز المنظف النهائي بين 0.5 و 1٪ رج العينات عند حوالي 100 دورة في الدقيقة وأربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.

ثم أضف ثلاثة أحجام من 2.4 سكروز مولار إلى حجم واحد من غشاء البلازما المعالج للحصول على تركيز نهائي 1.8 مولي من السكروز. قم بإعداد تدرج السكروز في أنابيب الطرد المركزي الفائق عن طريق تحميل محاليل السكروز المعنية فوق جهاز الطرد المركزي 1.8 المولي للعينات عند 250 ، 000 GS وأربع درجات مئوية لمدة 18 ساعة. قم بإزالة أنابيب الطرد المركزي الفائق بعناية من الدوار لتجنب تعطيل النطاق منخفض الكثافة ، والذي قد يكون مرئيا كحلقة حليبية عند واجهة 0.15 مولار و 1.4 سكروز مولاري.

في بعض الأحيان لا يمكن رؤية أي شيء ، لكن جزء البروتين المقاوم للمنظفات لا يزال موجودا. قم بإزالة جزء من حجم 0.75 مليلتر من أعلى التدرج ، الكسرين الثاني والثالث ، والتي تغطي أحجام حوالي 1.5 مل فوق حلقة الطور البيني. و 0.5 مل تحت حلقة الطور البيني.

تمثل جزء الغشاء المقاوم للمنظفات. اجمع هذه الكسور في أنابيب فالكون سعة 15 ملليلترا. يحتوي الكسران التاسع والعاشر على جزء الغشاء القابل للذوبان في المنظفات ويمكن أيضا جمعهما للمقارنة.

لبدء استخراج البروتينات من الجزء المقاوم للمنظفات ، أضف أربعة أحجام من الميثانول إلى الكسور المجمعة والدوامة الخامسة جيدا. ثم أضف حجما واحدا من الكلوروفورم قبل الدوامة جيدا مرة أخرى. أخيرا ، أضف ثلاثة أحجام من الماء وقم بالطرد المركزي للعينات بدقة عند 2000 Gs لمدة خمسة.

باستخدام جهاز طرد مركزي على الطاولة ، قم بإزالة المرحلة المائية فوق طبقة البروتين في الطور البيني. بعد ذلك ، أضف ثلاثة أحجام من الميثانول والدوامة. قم بإزالة المادة الطافية S جيدا قبل سحب الحبيبات للتحضير لهضم غير الذولة.

ابدأ هضم المحلول عن طريق إذابة العينة في حجم صغير من ستة مولي يوريا اثنين من الرقم الهيدروجيني الغدة الدرقية المولي ثمانية اختصار UTU. استخدم أقل مستوى صوت ممكن متوافق مع العينة. بعد تدوير العينات وإجراء عملية الهضم كما هو موضح في بروتوكول النص ، قم بتخفيف العينة بأربعة مجلدات من 10 مللي مولار ثلاثية الهيدروكلوريك PH ثمانية.

ثم أضف ميكرولتر واحد من التربسين لكل 50 ميكروغرام من عينة البروتين تحتضن طوال الليل في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز مستمر عند 700 دورة في الدقيقة ، والطرد المركزي للعينات عند 4 ، 000 GS لمدة 10 دقائق. أخيرا ، قم بتحمض العينات إلى التركيز النهائي 0.2٪ TFA للوصول إلى درجة الحموضة الثانية عن طريق إضافة حجم واحد تقريبا من 2٪ حمض الخليك ثلاثي الفلور. لتصنيع أطراف المرحلة C 18 ، ضع قرص مور C 18 على سطح نظيف مثل طبق بتري البلاستيكي القابل للتصرف

قم بإخراج قرص صغير باستخدام إبرة تحت الجلد ذات طرف حاد بقطر 1.5 ملم. يلتصق القرص بالإبرة ويمكن نقله إلى طرف ماصة. ادفع القرص خارج الإبرة وثبته في مستدق طرف الماصة باستخدام قطعة من السيليكا المنصهرة أو تركيب الأنابيب في داخل الإبرة ، قم بوضع طرف المرحلة C 18 عن طريق وضع 50 ميكرولترا من المحلول B على طرف المرحلة المعد.

قم بتدوير الطرف في جهاز الطرد المركزي بسرعة 2000 دورة في الدقيقة لمدة دقيقتين في جهاز طرد مركزي على الطاولة ، قم بموازنة طرف المرحلة باستخدام 100 ميكرولتر من المحلول أ. قم بتدوير الطرف عند 5 ، 000 GS في جهاز طرد مركزي على الطرد المركزي. كرر التوازن والدوران.

قم بتحميل العينة على القرص عن طريق سحب العينة بعناية في طرف الماصة مع وجود القرص بداخله. قم بتدوير الأطراف في جهاز الطرد المركزي حتى يمر الحجم الكامل للعينة عبر قرص C 18. اغسل أطراف المرحلة مرتين باستخدام 100 ميكرولتر من المحلول أ.بعد تدوير الأطراف في جهاز الطرد المركزي ، اجمع EIT في أنبوب تفاعل جديد سعة 1.5 مليلتر عند 40 ميكرولتر من المحلول B وجهاز الطرد المركزي.

مرة أخرى ، ركز العينة في سرعة التفريغ في ظل ظروف مثالية. أوقف عملية الجفاف عندما يتبقى حوالي ميكرولتر أو ميكرولتر من السائل. كخطوة أخيرة ، أضف حجما نهائيا قدره تسعة ميكرولترات من محلول تعليق Resus إلى العينة وانقله إلى لوحة الميكروتيتر لتحليل مواصفات الكتلة.

يمكن إظهار إثراء بروتينات غشاء البلازما من خلال التحليل البروتيني للجزء الصغير من غشاء البلازما والكسور والبروتينات في المرحلة السفلية من النظام ثنائي الطور. تحتوي المرحلة السفلية على الأغشية الداخلية للخلية. على سبيل المثال ، أظهرت بروتينات غشاء البلازما المعروفة عادة مثل بروتينات كيناز المستقبلات وفرة عالية في جزء غشاء البلازما ووفرة منخفضة في جزء الطور السفلي الذي يحتوي على الأغشية الداخلية.

في المقابل ، تظهر البروتينات المعروفة للشبكة الإندوبلازمية وفرة عالية في جزء الغشاء الداخلي ولم يتم ملاحظتها في جزء غشاء البلازما. سيؤدي التخصيب اللاحق للكسور الغشائية المقاومة للمنظفات ، في الحالات المثالية ، إلى تكوين حلقة حليبية من حويصلات غشائية منخفضة الكثافة. عند ما يقرب من خمس ارتفاع الأنبوب ، تم العثور على أعلى وفرة من البروتين المتبقي في الغشاء المقاوم للمنظفات أو كسور DRM كما هو متوقع.

على العكس من ذلك ، فإن البروتينات غير الموجودة في الغشاء ، والمجالات الدقيقة مثل ناقل A b ، C لا تظهر وفرة متزايدة في جزء DRM. أيضا ، لا تظهر الملوثات النموذجية مثل بروتين الميتوكوندريا من مركب A TPAs F صفر والبروتين الريبوسومي من الريبوسوم 60 ثانية وفرة غنية في جزء DRM. على الرغم من أنه لا يزال من الممكن تحديد الحد الأدنى من الكميات بعد التحليل الطيفي الكتلي ، إلا أنه يمكن تمييز نسب وفرة البروتين لحالة فسفرة البروتين في غشاء البلازما ، وكسور مزارع الخلايا المصنفة وغير المسماة كميا.

يجب أن تظهر النتائج النموذجية من نافذة القياس الكمي MS نسبة شدة الأيونات من واحد إلى واحد لمعظم الببتيدات المحددة. تعتبر تلك الببتيدات ذات نسبة شدة الأيونات التي تنحرف بشكل كبير عن واحد إلى واحد منظمة بشكل تفاضلي بين ثقافة الخلايا المسماة وغير المسماة ، وهي مرشحة للمطابقة مع البروتينات المتأثرة بالعلاج المطبق. التحكم الجيد في الجودة لوضع العلامات الأيضية الناجحة هو تحالف كل من إصدارات الببتيد المصنفة وغير المسماة كذروة واحدة في فصل nano HPLC كما هو موضح هنا.

بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في ثلاثة أيام من بداية الاستخراج حتى تحميل العينة على مطياف الكتلة. باتباع هذا الإجراء ، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل الحزام الغربي من أجل الإجابة على أسئلة إضافية حول دعاء بروتينات مستهدفة محددة. لذلك بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لدينا فهم جيد لكيفية خلط مزارع الخلايا النباتية المسماة بالنظائر المستقرة ، وكيفية إجراء تنقية غشاء البلازما على نظام ثنائي الطور ، وكيفية فصل المقصورات الفرعية الغشائية المعقمة الغنية عن المعقمة المستنفدة.