الأيضية وصفها وغشاء التقطير للالمقارن تحليل البروتين من

يتمثل الهدف العام من التجربة التالية في فصل الأقسام الفرعية المختلفة للغشاء ودراسة تركيبها البروتيني المتباين. ويتحقق ذلك عن طريق الوسم بالنظائر المستقرة للخلايا تحت ظروف مختلفة للسماح بالتمييز بين المعاملات. وفي خطوة ثانية، يتم خلط المواد الخلوية من المعاملتين في تحليل قياس الطيف الكتلي، مما يضمن المعالجة المشتركة ويقلل من التباين بين العينات.

بعد ذلك، يتم تنقية الأجزاء الفرعية للغشاء البلازمي وفصلها إلى أجزاء فرعية غنية ومعقمة وأجزاء فرعية مستنزفة ومعقمة باستخدام السكروز. يتم الحصول على نتائج الطرد المركزي المتدرج التي تظهر وفرة بروتينية متباينة في الأجزاء الفرعية تحت تأثير معاملات مختلفة، بناءً على بيانات من قياس الطيف الكتلي الكمي. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول مقارنة بالطرق الحالية، مثل لطخة ويسترن، في قدرتنا على تسجيل توزيع آلاف البروتينات في الأجزاء الفرعية كمياً، وبالتالي اكتشاف مرشحين جدد لعمليات التأشير.

يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية نظراً لصعوبة تعلم عملية تنقية نظام ثنائي الطور. ويرجع ذلك إلى أنها تتضمن العديد من الخطوات، كما أن التحكم الدقيق والتعامل الشامل يكتسبان أهمية كبيرة. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال التأشير من خلال اكتشاف بروتينات مرشحة جديدة كمنظمات للعمليات الغشائية. ابدأ بزراعة مستنبتات معلقة من خلايا arabidopsis ana المسمى وغير المسمى كما هو موضح في البروتوكول النصي.

يتم خلط كميات متساوية من مستنبتات الخلايا المجمدة الموُسمة وغير الموُسمة، بناءً على الوزن الطازج، في بيكر، وذلك باستخدام خلايا متجانسة من حوالي لتر واحد من مستنبتات معلق خلوي عمرها سبعة أيام في النيتروجين السائل، ثم يُضاف حجمان من المنظم H. يوضع البيكر فوراً على جهاز هزاز ويُرج حتى تذوب المادة وتختفي البلورات الجليدية. يتم ترشيح المتجانس عبر طبقة واحدة من قماش المرآة (mirror cloth) في أنابيب طرد مركزي سعة 250 مللي لتر، وبعد موازنة العينات بالمنظم H، يتم إجراء عملية الطرد المركزي عند 10,000 Gs لمدة ثماني دقائق. وعقب الطرد المركزي، يُنقل السائل الطافي (snat) إلى أنابيب طرد مركزي فائقة مبردة مسبقاً وبسعة حوالي 32 مللي لتر.

بعد موازنة العينات باستخدام المنظم h، قم بترسيب الجسيمات الدقيقة عن طريق الطرد المركزي عند 100, 000 Gs ودرجة حرارة أربع درجات Celsius لمدة 30 دقيقة. بعد الطرد المركزي، قم بإزالة السائل الطافي، حيث يحتوي السائل الطافي على بروتينات ذائبة. يمكن الاحتفاظ بكمية صغيرة من هذا الجزء لترسيب البروتين لاحقاً، والتحليل اللاحق للبروتينات الذائبة. أعد تعليق راسب الغشاء لكل عينة في الكمية المناسبة من المنظم R كما هو موضح في البروتوكول النصي، ثم قم بتحميلها على الجزء العلوي من نظام U one two phase.

في حال استخدام النظام ثنائي الطور بسعة ستة جرامات، يتم وضع جرامين بالضبط من كريات الغشاء المعاد تعليقها، ووضع نفس حجم المنظم R النقي المستخدم في عملية إعادة تعليق العينة في الأنبوب U2. اخلط الأنبوبين U1 وU2 ببطء عن طريق قلبهما 30 مرة بمعدل قلبة واحدة تقريبًا في الثانية، ثم قم بطرد العينات مركزياً عند 1500 Gs ودرجة حرارة 4 °C لمدة 10 دقائق. بعد الطرد المركزي، قم بإزالة الطور العلوي من U2. انقل الطور العلوي من U1 إلى U2 قبل تكرار عملية الطرد المركزي باستخدام نفس المعايير. بعد ذلك، انقل الطور العلوي من U2 إلى أنابيب الطرد المركزي الفائق، خففه بخمسة أحجام من المنظم R واخلطه جيداً، ثم قم بطرد العينات مركزياً عند 200,000 Gs ودرجة حرارة 4 °C لمدة ساعة واحدة.

أخيراً، إعادة الاستخدام. قم بتعليق كريّة الغشاء في كمية صغيرة من منظم T and E لعزل الأغشية المقاومة للمنظفات. بعد التحقق من تركيز جزء الغشاء البلازمي باستخدام مقايسة Bradford، أضف Triton X 100 إلى جزء الغشاء البلازمي بنسبة وزنية بين المنظف والبروتين تتراوح بين 13 و 15، وبتركيز نهائي للمنظف يتراوح بين 0.5 و 1%. رجّ العينات عند سرعة 100 RPM تقريباً ودرجة حرارة أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.

ثم أضف ثلاثة أحجام من السكروز بتركيز 2.4 molar إلى حجم واحد من الغشاء البلازمي المعالج للحصول على تركيز نهائي للسكروز يبلغ 1.8 molar. قم بتجهيز تدرج السكروز في أنابيب جهاز الطرد المركزي الفائق عن طريق تحميل محاليل السكروز المقابلة فوق جزء الـ 1.8 molar. قم بطرد العينات مركزياً عند 250,000 GS ودرجة حرارة أربع درجات Celsius لمدة 18 ساعة. أخرج أنابيب جهاز الطرد المركزي الفائق بعناية من الدوار لتجنب تشتت نطاق الكثافة المنخفضة، والذي قد يظهر كحلقة حليبية عند الواجهة بين السكروز بتركيز 0.15 molar و1.4 molar.

في بعض الأحيان، قد لا يظهر شيء مرئي، ولكن يظل جزء البروتين المقاوم للمنظفات موجوداً. قم بإزالة جزء بحجم 0.75 milliliter من أعلى التدرج، وهما الجزءان الثاني والثالث، اللذان يغطيان أحجاماً تبلغ حوالي 1.5 milliliters فوق حلقة الطور البيني، و0.5 milliliters تحت حلقة الطور البيني.

تمثل هذه الكسور جزء الغشاء المقاوم للمنظفات. اجمع هذه الكسور في أنابيب فالكون سعة 15 ملليلتر. يحتوي الكسران التاسع والعاشر على جزء الغشاء القابل للذوبان في المنظفات، ويمكن جمعهما أيضاً للمقارنة.

لبدء استخلاص البروتينات من الجزء المقاوم للمنظفات، أضف أربعة أحجام من الميثانول إلى الأجزاء التي تم جمعها وقم بالرج باستخدام جهاز الفورتكس جيداً. ثم أضف حجماً واحداً من الكلوروفورم قبل الرج جيداً مرة أخرى باستخدام جهاز الفورتكس. وأخيراً، أضف ثلاثة أحجام من الماء وقم بالرج جيداً باستخدام جهاز الفورتكس، ثم قم بطرد العينات مركزياً عند 2000 Gs لمدة خمس دقائق.

باستخدام جهاز طرد مركزي مكتبي، قم بإزالة الطور المائي الموجود فوق طبقة البروتين في الطور البيني. بعد ذلك، أضف ثلاثة أحجام من الميثانول وقم بالخلط باستخدام جهاز الدوامة (vortex). قم بإزالة السائل الطافي S تماماً قبل سحب الراسب لتحضيره لعملية الهضم في المحلول.

ابدأ عملية الهضم في المحلول عن طريق إذابة العينة في حجم صغير من اليوريا بتركيز 6 molar وthyroid بتركيز 2 molar عند pH 8، والتي يُرمز لها اختصاراً بـ UTU. استخدم أقل حجم ممكن يتوافق مع العينة. بعد تدوير العينات وإجراء عملية الهضم كما هو موضح في البروتوكول النصي، خفف العينة بأربعة أضعاف حجمها من tris HCL بتركيز 10 millimolar عند pH 8.

ثم أضف 1 µL من trypsin لكل 50 µg من بروتين العينة، وحضنها طوال الليل في درجة حرارة الغرفة مع الرج المستمر بسرعة 700 RPM، ثم قم بإجراء الطرد المركزي للعينات عند 4,000 g لمدة 10 دقائق. وأخيراً، قم بتحميض العينات لتصل إلى تركيز نهائي 0.2% TFA لتحقيق pH 2 عن طريق إضافة ما يقرب من عُشر الحجم من حمض trifluoroacetic بتركيز 2%. ولتصنيع رؤوس C18 stage tips، ضع قرص C18 على سطح مستوٍ ونظيف مثل أطباق بيتري البلاستيكية التي تستخدم لمرة واحدة.

قم بثقب قرص صغير باستخدام إبرة حقن ذات طرف غير مدبب بقطر 1.5 مليمتر. سيلتصق القرص في الإبرة ويمكن نقله إلى طرف ماصة. ادفع القرص خارج الإبرة وثبته في الجزء المستدق من طرف الماصة باستخدام قطعة من السيليكا المنصهرة أو أنبوب يتناسب مع الجزء الداخلي من الإبرة، ثم قم بتهيئة طرف مرحلة C 18 عن طريق وضع 50 µL من المحلول B على طرف المرحلة المُجهز.

قم بتدوير الطرف في جهاز الطرد المركزي بسرعة 2000 RPM لمدة دقيقتين. في جهاز طرد مركزي مكتبي، قم بموازنة طرف المرحلة باستخدام 100 µL من المحلول a. قم بتدوير الطرف بسرعة 5,000 GS في جهاز طرد مركزي مكتبي. كرر عملية الموازنة والتدوير.

قم بتحميل العينة على القرص عن طريق نقل العينة بعناية باستخدام الماصة إلى رأس الماصة الذي يحتوي على القرص بالداخل. قم بتدوير الرؤوس في جهاز الطرد المركزي حتى يمر كامل حجم العينة عبر قرص C 18. اغسل رؤوس المرحلة مرتين باستخدام 100 µL من المحلول A. بعد تدوير الرؤوس في جهاز الطرد المركزي، اجمع الـ EIT في أنبوب تفاعل جديد سعة 1.5 mL يحتوي على 40 µL من المحلول B ثم قم بإجراء الطرد المركزي.

مرة أخرى، قم بتركيز العينة في جهاز speed vac تحت الظروف المثالية. أوقف عملية التجفيف عندما يتبقى حوالي 1 أو 2 µL من السائل. وكخطوة نهائية، أضف حجماً نهائياً قدره 9 µL من محلول Resus suspension إلى العينة وانقلها إلى لوحة microtiter لإجراء تحليل mass spec.

يمكن إثبات إثراء بروتينات الغشاء البلازمي من خلال التحليل البروتومي لكميات صغيرة من أجزاء الغشاء البلازمي والبروتينات الموجودة في الطور السفلي للنظام ثنائي الطور. حيث يحتوي الطور السفلي على الأغشية الداخلية للخلية. فعلى سبيل المثال، أظهرت بروتينات الغشاء البلازمي المعروفة عادةً، مثل بروتينات كيناز المستقبلات، وفرة عالية في جزء الغشاء البلازمي ووفرة منخفضة في جزء الطور السفلي الذي يحتوي على الأغشية الداخلية.

وفي المقابل، أظهرت البروتينات المعروفة في الشبكة الإندوبلازمية وفرة عالية في جزء الغشاء الداخلي ولم تُلاحظ في جزء الغشاء البلازمي. وسيؤدي الإثراء اللاحق لأجزاء الغشاء المقاومة للمنظفات، في الحالات المثالية، إلى تكوين حلقة لبنية من حويصلات غشائية منخفضة الكثافة. وعند حوالي خمس ارتفاع الأنبوب، وُجدت أعلى وفرة من بروتين remn في أجزاء الغشاء المقاوم للمنظفات أو أجزاء DRM كما كان متوقعاً.

وعلى العكس من ذلك، فإن البروتينات التي لا تتواجد في النطاقات الدقيقة للغشاء، مثل ناقل ABC، لا تظهر زيادة في الوفرة ضمن جزء DRM. كما أن الملوثات النموذجية، مثل بروتين الميتوكوندريا من معقد ATP synthase F₀ والبروتين الريبوسومي من ريبوسوم 60s، لا تظهر وفرة مثرية في جزء DRM. وعلى الرغم من إمكانية تحديد كميات ضئيلة بعد تحليل مطياف الكتلة، إلا أنه يمكن التمييز كمياً بين نسب وفرة البروتين وحالة فسفرة البروتين في أجزاء الغشاء البلازمي لمزارع الخلايا الملحقة بعلامات وتلك غير الملحقة بها.

يجب أن تُظهر النتائج النموذجية من نافذة التكميم لـ MS نسبة شدة أيونية تبلغ واحد إلى واحد لمعظم الببتيدات المحددة. وتُعتبر الببتيدات التي تنحرف نسبة شدة الأيونات فيها بشكل ملحوظ عن نسبة واحد إلى واحد منظمة بشكل تفاضلي بين المزارع الخلوية الموسومة وغير الموسومة، وتعد مرشحة للمطابقة مع البروتينات المتأثرة بالمعالجة المطبقة. ومن مؤشرات ضبط الجودة الجيدة لنجاح الوسم الأيضي ظهور كلاً من نسخ الببتيد الموسومة وغير الموسومة كقمة واحدة في فصل nano HPLC كما هو موضح هنا.

بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون ثلاثة أيام بدءاً من عملية الاستخلاص وصولاً إلى تحميل العينة على مطياف الكتلة. واتباعاً لهذا الإجراء، يمكن إجراء طرق أخرى مثل Western Blot للإجابة على أسئلة إضافية حول وجود بروتينات مستهدفة محددة. لذا، بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لدينا فهم جيد لكيفية خلط مستنبتات الخلايا النباتية الموسومة بنظائر مستقرة، وكيفية إجراء تنقية للغشاء البلازمي عبر نظام ثنائي الطور، وكيفية فصل المقصورات الفرعية للغشاء الغنية بالستيرول عن تلك المنخفضة الستيرول.